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摘要{目的]初步探索水稻耐盐机制，筛选关键基因。{方法]从公共基因芯片数据库GEO（GeneExpressionOmnibus）搜索有关盐胁迫下水稻基因表达的数据，利用TAC（TranscriptomeAnalysisConsole）筛选表达差异基因，对差异基因进行GO（GeneOntology）富集分析、信号通路富集分析。{结果]在盐胁迫下，CSR11、PL177两种耐受型水稻与IR64、VSR156两种敏感型水稻分别有3289、1934、1806、4426个基因表达。耐受型水稻中同时上调或下调的基因有288个，敏感型水稻中同时上调或下调的基因有330个。通过生物信息学研究发现，耐受型水稻盐胁迫主要影响代谢途径、次级代谢产物合成、转录因子等方面。敏感型水稻盐胁迫影响主要影响胁迫响应、激素转导、物质代谢等方面。{结论]利用生物信息学方法能有效筛选目标基因，并可为进一步研究提供依据。
关键词水稻;盐胁迫;差异基因表达
中图分类号S 511;Q786文献标识码A文章编号0517-6611（2018）36-0018-03
水稻是世界上最重要的粮食作物，世界上一半以上的人口以水稻作为主食，尤其在发展中国家。近年来由于工业污染的加剧，大量使用农药、化肥以及不合理灌溉等使土壤盐碱化程度日益加重，盐害已经严重威胁粮食安全{1-3]。研究显示，盐对植物组织的伤害主要是离子毒害和渗透胁迫{4]。随着分子生物学技术的不断发展，研究人员希望能够掌握盐害下的作物生理响应机制，以此为基础，利用基因工程技术提高作物抗盐能力，从而对合理开发和利用盐碱土地资源，确保国家粮食安全具有重要意义。基因芯片使研究人员能够快速、高通量地了解植物在特定环境条件下的基因表达水平及变化{5]。鉴于此，笔者基于公共基因芯片数据库GEO中盐胁迫下水稻基因表達的芯片数据，通过生物信息学分析对相关基因进行筛选。
1材料与方法
1.1数据来源
登录GEO（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）下载水稻芯片数据（GSE21651、GSE58603），两组数据都是选择研究盐胁迫下水稻叶片基因的表达。水稻类型分别为CSR11、PL177、IR64、VSR156，其中CSR11、PL177为耐受型水稻，IR64、VSR156为敏感型水稻{6-7]。
1.2方法
GEO数据利用TAC进行芯片数据分析，获得差异表达基因，选择差异在2倍以上的表达基因（P<0.05）。利用PlantReMapGO富集分析（http：//plantregmap.cbi.pku.edu.cn/index.php）（P<0.01，Q<0.05），DAVID6.8（https：//david.ncifcrf.gov/）KEGG通路分析（P<0.05）。
2结果与分析
2.1盐胁迫下不同水稻基因的表达
CSR11水稻在盐胁迫下出现差异表达的基因是3289个，其中盐胁迫诱导上调的基因有815个，下调的基因有2502个。IR64水稻在盐胁迫下出现差异表达的基因是1806个，其中盐胁迫诱导上调的基因有786个，下调的基因有1020个。PL177水稻在盐胁迫下出现差异表达的基因是1934个，其中盐胁迫诱导上调的基因有995个，下调的基因有939个。VSR156水稻在盐胁迫下出现差异表达的基因是4426个，其中盐胁迫诱导上调的基因有1400个，下调的基因有3026个（图1）。在4种水
稻中，CSR11、PL177为耐受型水稻。经研究分析发现，
CSR11、PL177表达重叠的基因有398个，但是同时上下调的基因为288个，其中上调的基因有110个，下调的基因有178个。IR64、VSR156为敏感型水稻。分析发现，IR64、VSR156表达重叠的基因有542个，但是同时上下调的基因为330个，其中上调的基因有249个，下调的基因有81个。
2.2盐胁迫下2种水稻表达一致基因生物信息学分析
在耐受型、敏感型水稻中同时上调的表达基因有58个，同时下调的表达基因有25个（图2）。说明这类基因对于水稻适应盐胁迫至关重要，它们不受基因型的限制、不具有组织特异性。通过生物信息学分析，发现这些表达基因富集以响应温度刺激为主、在信号通路上则主要在光合作用、内质网蛋白质加工上，包括热激转录蛋白OsHsfA3（LOC_Os02g32590）、乙醇脱氢酶基因Adh1（LOC_Os11g10480）等基因（表1）。
2.3盐胁迫下2种水稻特异性上调表达基因生物信息学分析
耐受型水稻特异性上调基因有52个，敏感型水稻特异性上调基因则有191个（图2）。对耐受型水稻上调基因进行生物信息学分析发现，基因富集无统计学意义，这可能是因为特异性上调基因太少导致的。对信号通路分析发现，其主要在代谢途径、次级代谢产物合成过程中，包括乙醛脱氢酶OsALDH18B2（LOC_Os01g62900）、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶OsRBCS4（LOC_Os12g19470）等基因。对敏感型水稻上调基因进行生物信息学分析，发现基因富集以胁迫响应为主，如温度刺激、非生物刺激物质化学反应、渗透压等功能，信号通路则主要参与植物激素信号转导，包括活化蛋白激酶OsSAPK1（LOC_Os03g27280）、锌指蛋白ZFP179（LOC_Os03g27280）、赖氨酸-酮戊二酸还原酶/酵母氨酸脱氢酶OsLKR/SDH（LOC_Os02g54254）等基因（表1）。
2.4盐胁迫下2种水稻特异性下调表达基因生物信息学分析
耐受型水稻特异性下调基因有153个，敏感型水稻特异性下调基因有56个（图2）。对耐受型水稻下调基因进行生物信息学分析，发现基因富集主要在核蛋白结合转录因子、特异DNA结合转录因子等功能上，包括WRKY转录因子（LOC_Os01g09080，LOC_Os07g48260，LOC_Os09g25070）、bZIP转录因子（LOC_Os03g19370、LOC_Os05g49420、LOC_Os06g45140）、AP2/ERF转录因子（LOC_Os05g41760，LOC_Os01g58420）等基因，而信号通路无统计学意义。对敏感型水稻下调基因进行生物信息学分析，发现基因富集以酶活性为主，如葡糖激酶、己糖激酶等，信号通路则主要参与到糖代谢途径，包括己糖激酶OsHXK（LOC_Os01g71320、LOC_Os01g53930）等基因（表1）。 3结论与讨论
盐胁迫能够诱发渗透胁迫和离子胁迫从而抑制植物正常的生长发育，在盐胁迫下作物体内的主要生理过程都会受到影响，如光合作用、蛋白质合成、能量和油脂代谢等{8-9]。同时，盐胁迫会诱导多个相关基因的表达来提高植物的抗性，这些盐胁迫耐性相关基因包括参与信号传导和转录调控基因、渗透调节物质代谢相关的基因和转运蛋白基因等{10]。
该研究中耐受型、敏感型水稻的热激转录蛋白OsHsfA（LOC_Os02g32590）、乙醇脱氢酶基因Adh1（LOC_Os11g10480）等基因表达一致，这类基因不具有组织特异性。热激转录因子（Hsf）通过调控热激蛋白（HSP）在植物胁迫响应中起作用。Hsf基因在热和盐胁迫处理后显著上调表达，超量表达OsHsfB2b转基因植株对盐和干旱敏感，抑制表达OsHsfB2b则提高对盐和干旱的抗性{11]。
在耐受型水稻中乙醛脱氢酶OsALDH18B2、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶OsRBCS4等基因显著上调，而WRKY转录因子（OsWRKY47、OsWRKY62、OsWRKY97）、AP2/EREBP家族中转录因子（MFS1、OsERF3/OsAP37）、bZIP转录因子（OsbZIP27、OsbZIP45、OsbZIP52）等显著下调。研究表明，醛脱氢酶基因ALDH与逆境胁迫有关，在干旱和盐胁迫下水稻中的OsALDH2-4、OsALDH3-4、OsALDH7、OsALDH10-1和OsALDH18-2表达上调{12-13]。盐胁迫下OsRBCS4的表达增加，OsRBCS4是调节植物光合作用的关键酶，参与植物光合作用和光呼吸过程，其表达量的变化可影响一些关键酶的表达。AP2/EREBP转录因子与低温、高盐和干旱胁迫应答等密切相关，盐处理下OsERF3/OsAP37显著下调表达{14-15]。在筛选水稻的研究工作中发现转录因子WRKY参与逆境耐受的信号转导过程，在高盐、干旱、冷害、高温等逆境因子胁迫中不同程度地被诱导{16-17]。bZIP转录因子通过ABA信号途径在植物的非生物胁迫响应中起着重要的作用{18]。在水稻中约有100个bZIP成员，OsABI5的表达受ABA及高盐胁迫诱导，对该基因过表达发现其能导致转基因水稻对盐胁迫的更为敏感{19-20]。因此，耐受型水稻可能是通过促进这些酶基因的表达，而抑制转录因子来提高自身的耐盐能力。
该研究发现敏感型水稻中赖氨酸-酮戊二酸还原酶OsLKR/SDH、抗坏血酸过氧化物酶OsAPX2、细胞色素P450单加氧酶OsSL、锌指蛋白基因ZFP179等显著上调，而己糖激酶HXK顯著下调。赖氨酸是谷物中最缺乏的必需氨基酸，OsLKR/SDH是植物中控制游离赖氨酸含量的主要调节子之一{21]。在受到盐胁迫时植物体内的脯氨酸含量会迅速提高，调节植物细胞内渗透压与外界平衡，降低体细胞水势，维持盐胁迫条件下细胞的正常的渗透压和生理代谢{22]。OsAPX2表达受空间和发育时期调节，受干旱、冷害和盐胁迫诱导表达。OsAPX2通过清除活性氧保护幼苗免受非生物胁迫，在水稻生长和发育上起着重要作用{23]。锌指蛋白参与植物生长发育和胁迫应答的多种细胞生化过程。通过基因芯片分析鉴定了盐胁迫应答的锌指蛋白基因ZFP179，ZF179过量表达能够提高耐盐水平，ZPF179在植物体内对盐胁迫应答中发挥重要作用，其耐盐能力的增强在当前的转基因作物中非常有用{24-25]。HXK能磷酸化葡萄糖、果糖，甘露糖等，是联系植物糖和激素的关键元件，通过对拟南芥进行分析，发现植物可能通过调节葡萄糖水平，参与ABA介导并依赖己糖激酶的糖途径，实现从响应逆境到抵御逆境的跨越{26-27]。因此，敏感型水稻可能是通过促进基因以胁迫响应和信号转导相关酶基因的表达，而抑制己糖激酶途径来提高自身的耐盐能力。
该研究比较盐胁迫下不同水稻品种的基因应答，筛选到相关的耐盐基因，为耐盐研究提供了新的方向。随着水稻耐盐机制的研究不断深入，将会不断发掘出耐盐基因，人们可以利用转基因、分子标记等技术培育出耐盐品种、从而为提高盐碱地水稻的产量具有重要的指导意义。
参考文献
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关键词水稻;盐胁迫;差异基因表达
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1.2方法
GEO数据利用TAC进行芯片数据分析，获得差异表达基因，选择差异在2倍以上的表达基因（P<0.05）。利用PlantReMapGO富集分析（http：//plantregmap.cbi.pku.edu.cn/index.php）（P<0.01，Q<0.05），DAVID6.8（https：//david.ncifcrf.gov/）KEGG通路分析（P<0.05）。
2结果与分析
2.1盐胁迫下不同水稻基因的表达
CSR11水稻在盐胁迫下出现差异表达的基因是3289个，其中盐胁迫诱导上调的基因有815个，下调的基因有2502个。IR64水稻在盐胁迫下出现差异表达的基因是1806个，其中盐胁迫诱导上调的基因有786个，下调的基因有1020个。PL177水稻在盐胁迫下出现差异表达的基因是1934个，其中盐胁迫诱导上调的基因有995个，下调的基因有939个。VSR156水稻在盐胁迫下出现差异表达的基因是4426个，其中盐胁迫诱导上调的基因有1400个，下调的基因有3026个（图1）。在4种水
稻中，CSR11、PL177为耐受型水稻。经研究分析发现，
CSR11、PL177表达重叠的基因有398个，但是同时上下调的基因为288个，其中上调的基因有110个，下调的基因有178个。IR64、VSR156为敏感型水稻。分析发现，IR64、VSR156表达重叠的基因有542个，但是同时上下调的基因为330个，其中上调的基因有249个，下调的基因有81个。
2.2盐胁迫下2种水稻表达一致基因生物信息学分析
在耐受型、敏感型水稻中同时上调的表达基因有58个，同时下调的表达基因有25个（图2）。说明这类基因对于水稻适应盐胁迫至关重要，它们不受基因型的限制、不具有组织特异性。通过生物信息学分析，发现这些表达基因富集以响应温度刺激为主、在信号通路上则主要在光合作用、内质网蛋白质加工上，包括热激转录蛋白OsHsfA3（LOC_Os02g32590）、乙醇脱氢酶基因Adh1（LOC_Os11g10480）等基因（表1）。
2.3盐胁迫下2种水稻特异性上调表达基因生物信息学分析
耐受型水稻特异性上调基因有52个，敏感型水稻特异性上调基因则有191个（图2）。对耐受型水稻上调基因进行生物信息学分析发现，基因富集无统计学意义，这可能是因为特异性上调基因太少导致的。对信号通路分析发现，其主要在代谢途径、次级代谢产物合成过程中，包括乙醛脱氢酶OsALDH18B2（LOC_Os01g62900）、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶OsRBCS4（LOC_Os12g19470）等基因。对敏感型水稻上调基因进行生物信息学分析，发现基因富集以胁迫响应为主，如温度刺激、非生物刺激物质化学反应、渗透压等功能，信号通路则主要参与植物激素信号转导，包括活化蛋白激酶OsSAPK1（LOC_Os03g27280）、锌指蛋白ZFP179（LOC_Os03g27280）、赖氨酸-酮戊二酸还原酶/酵母氨酸脱氢酶OsLKR/SDH（LOC_Os02g54254）等基因（表1）。
2.4盐胁迫下2种水稻特异性下调表达基因生物信息学分析
耐受型水稻特异性下调基因有153个，敏感型水稻特异性下调基因有56个（图2）。对耐受型水稻下调基因进行生物信息学分析，发现基因富集主要在核蛋白结合转录因子、特异DNA结合转录因子等功能上，包括WRKY转录因子（LOC_Os01g09080，LOC_Os07g48260，LOC_Os09g25070）、bZIP转录因子（LOC_Os03g19370、LOC_Os05g49420、LOC_Os06g45140）、AP2/ERF转录因子（LOC_Os05g41760，LOC_Os01g58420）等基因，而信号通路无统计学意义。对敏感型水稻下调基因进行生物信息学分析，发现基因富集以酶活性为主，如葡糖激酶、己糖激酶等，信号通路则主要参与到糖代谢途径，包括己糖激酶OsHXK（LOC_Os01g71320、LOC_Os01g53930）等基因（表1）。 3结论与讨论
盐胁迫能够诱发渗透胁迫和离子胁迫从而抑制植物正常的生长发育，在盐胁迫下作物体内的主要生理过程都会受到影响，如光合作用、蛋白质合成、能量和油脂代谢等{8-9]。同时，盐胁迫会诱导多个相关基因的表达来提高植物的抗性，这些盐胁迫耐性相关基因包括参与信号传导和转录调控基因、渗透调节物质代谢相关的基因和转运蛋白基因等{10]。
该研究中耐受型、敏感型水稻的热激转录蛋白OsHsfA（LOC_Os02g32590）、乙醇脱氢酶基因Adh1（LOC_Os11g10480）等基因表达一致，这类基因不具有组织特异性。热激转录因子（Hsf）通过调控热激蛋白（HSP）在植物胁迫响应中起作用。Hsf基因在热和盐胁迫处理后显著上调表达，超量表达OsHsfB2b转基因植株对盐和干旱敏感，抑制表达OsHsfB2b则提高对盐和干旱的抗性{11]。
在耐受型水稻中乙醛脱氢酶OsALDH18B2、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶OsRBCS4等基因显著上调，而WRKY转录因子（OsWRKY47、OsWRKY62、OsWRKY97）、AP2/EREBP家族中转录因子（MFS1、OsERF3/OsAP37）、bZIP转录因子（OsbZIP27、OsbZIP45、OsbZIP52）等显著下调。研究表明，醛脱氢酶基因ALDH与逆境胁迫有关，在干旱和盐胁迫下水稻中的OsALDH2-4、OsALDH3-4、OsALDH7、OsALDH10-1和OsALDH18-2表达上调{12-13]。盐胁迫下OsRBCS4的表达增加，OsRBCS4是调节植物光合作用的关键酶，参与植物光合作用和光呼吸过程，其表达量的变化可影响一些关键酶的表达。AP2/EREBP转录因子与低温、高盐和干旱胁迫应答等密切相关，盐处理下OsERF3/OsAP37显著下调表达{14-15]。在筛选水稻的研究工作中发现转录因子WRKY参与逆境耐受的信号转导过程，在高盐、干旱、冷害、高温等逆境因子胁迫中不同程度地被诱导{16-17]。bZIP转录因子通过ABA信号途径在植物的非生物胁迫响应中起着重要的作用{18]。在水稻中约有100个bZIP成员，OsABI5的表达受ABA及高盐胁迫诱导，对该基因过表达发现其能导致转基因水稻对盐胁迫的更为敏感{19-20]。因此，耐受型水稻可能是通过促进这些酶基因的表达，而抑制转录因子来提高自身的耐盐能力。
该研究发现敏感型水稻中赖氨酸-酮戊二酸还原酶OsLKR/SDH、抗坏血酸过氧化物酶OsAPX2、细胞色素P450单加氧酶OsSL、锌指蛋白基因ZFP179等显著上调，而己糖激酶HXK顯著下调。赖氨酸是谷物中最缺乏的必需氨基酸，OsLKR/SDH是植物中控制游离赖氨酸含量的主要调节子之一{21]。在受到盐胁迫时植物体内的脯氨酸含量会迅速提高，调节植物细胞内渗透压与外界平衡，降低体细胞水势，维持盐胁迫条件下细胞的正常的渗透压和生理代谢{22]。OsAPX2表达受空间和发育时期调节，受干旱、冷害和盐胁迫诱导表达。OsAPX2通过清除活性氧保护幼苗免受非生物胁迫，在水稻生长和发育上起着重要作用{23]。锌指蛋白参与植物生长发育和胁迫应答的多种细胞生化过程。通过基因芯片分析鉴定了盐胁迫应答的锌指蛋白基因ZFP179，ZF179过量表达能够提高耐盐水平，ZPF179在植物体内对盐胁迫应答中发挥重要作用，其耐盐能力的增强在当前的转基因作物中非常有用{24-25]。HXK能磷酸化葡萄糖、果糖，甘露糖等，是联系植物糖和激素的关键元件，通过对拟南芥进行分析，发现植物可能通过调节葡萄糖水平，参与ABA介导并依赖己糖激酶的糖途径，实现从响应逆境到抵御逆境的跨越{26-27]。因此，敏感型水稻可能是通过促进基因以胁迫响应和信号转导相关酶基因的表达，而抑制己糖激酶途径来提高自身的耐盐能力。
该研究比较盐胁迫下不同水稻品种的基因应答，筛选到相关的耐盐基因，为耐盐研究提供了新的方向。随着水稻耐盐机制的研究不断深入，将会不断发掘出耐盐基因，人们可以利用转基因、分子标记等技术培育出耐盐品种、从而为提高盐碱地水稻的产量具有重要的指导意义。
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