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[目的]本文基于自筛的金黄色葡萄球菌特异性靶基因ASL18＿04625（sa19）以及2种重要的毒素基因（A型和U型肠毒素，sea344和seu222）,建立一种同时检测金黄色葡萄球菌及其肠毒素的多重实时荧光PCR检测方法。[方法]通过优化引物浓度等因素，确定最适多重实时荧光PCR反应体系，并将此检测体系组装成试剂盒，对人工污染样品和实际样品进行检测。[结果]选用1.5×Syto9 Green作为荧光染料，优化后的反应体系为0.015 U·μL-1Taq酶，0.10 mmol·L-1 dNTP,终浓度分别为0.05、0.10和0.20μmol·L-1的3对引物。sa19的基因组灵敏度为40.7 pg·μL-1,sea344、seu222的基因组灵敏度均为4.07 pg·μL-1;sa19的菌液浓度灵敏度为1.19×10~3 CFU·mL-1,sea344、seu222的菌液浓度灵敏度均为1.19×10~4 CFU·mL-1。构建的试剂盒组内和组间重复率均为100%。在经历60次反复冻融、72 h泡沫箱储藏、-20℃储藏90 d、4℃储藏45 d后，试剂盒检测结果仍没有显著变化，同时具有良好的特异性与抗干扰能力。[结论]本研究针对食源性金黄色葡萄球菌建立的多重实时荧光PCR法，具有快速、特异性强、灵敏度高的优点，并组建成适用于实际检测应用的商品化试剂盒，在食品安全检测方面具有广阔的应用前景。