【摘 要】
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目的 构建带有绿色荧光蛋白的中介素(IMD)真核表达质粒pIRES2-EGFP/IMD,并转染大鼠近端肾小管上皮细胞系(NRK-52E).方法 合成带有IMD基因片段的pMD19-T Simple/IMD质粒,将pMD
【基金项目】
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山西省科学技术发展计划项目;国家自然科学基金
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目的 构建带有绿色荧光蛋白的中介素(IMD)真核表达质粒pIRES2-EGFP/IMD,并转染大鼠近端肾小管上皮细胞系(NRK-52E).方法 合成带有IMD基因片段的pMD19-T Simple/IMD质粒,将pMD19-Tsimple/IMD质粒和pIRES2-EGFP载体双酶切之后进行高效连接.将IMD亚克隆至plRES2-EGFP上,对重组表达载体进行酶切、测序鉴定.采用FuGENE HD转染试剂转染NRK-52E细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白.提取细胞mRNA和蛋白,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测基因表达,Western检测IMD蛋白表达.结果 经限制性酶切鉴定及测序分析证实pIRES2-EGFP/IMD载体序列正确:荧光显微镜下可见转染的NRK-52E细胞有绿色荧光蛋白的表达,经RT-PCR和Western测定分析,转染细胞IMD基因及蛋白的表达增加.结论 pIRES2-EGFP/IMD载体构建成功,并在NRK-52E细胞内成功表达.
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