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摘要[目的]对影响百蕊草愈伤组织培养的因素进行研究。[方法]以百蕊草幼嫩枝条和叶片为外植体，研究不同浓度6-BA、NAA、2，4-D或其组合，碳源以及pH等因素对百蕊草愈伤组织生长的影响。[结果]3种植物生长调节剂和碳源对愈伤组织的生长都有促进作用，对愈伤组织诱导生长的培养基最佳组合为MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.15 mg/L+2，4-D 0.1 mg/L，碳源中蔗糖显著促进了百蕊草愈伤组织的增长，以30 g/L的蔗糖为最佳；pH 5.8～6.0有利于愈伤组织的诱导和生长。[结论]该研究为后续研究百蕊草细胞悬浮培养体系的建立提供材料。
关键词百蕊草；愈伤组织；碳源；植物生长调节剂
中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2016）22-132-03
Abstract[Objective]The aim was tostudy factors influencing callus culture of Thesium chinense.[Method] Taking tender branches and leaves of T. chinense as explants， effects of different concentrations of 6BA， NAA， 2，4Dand their combinations，carbon soueces as well as pH on callus were investigatedby using the orthogonal experiments.[Result] The results showed that fitting concentration of plant growth regulators and carbon sources could all promote the growth of callus，the best medium for induction of callus is MS+mediumsupplemented with 6BA 1 mg/L+NAA 0.15 mg/L+2，4D 0.1 mg/L， in the carbon sources，sucrose markedly increased callus， the adding of 30 m/L sucrose was the best choice.The pH value was 5.8-6.0.[Conclusion] The study can provide materials for study on T.chinense cell suspension culture.
Key wordsThesium chinense Turcz.； Callus； carbon sources； Plant growth regulators
百蕊草（Thesium chinense Turcz.）为檀香科植物，具有重要的药用价值，被称为“植物抗生素”[1]。百蕊草素是其主要成分，已被制成针剂用于治疗多种感染性炎症，具有较好疗效[2]。百蕊草是一种半寄生植物，野生资源较少。近年来，掠夺式的采集使百蕊草资源锐减，已成为频危珍稀种属。为满足市场需求，人工栽培虽然可以减轻供求压力，但由于百蕊草植株较小，产量较低，广种薄收，百蕊草素的生产严重受限。植物组织培养大规模生产植物次生代谢产物，已成为生产某些高价值产品的重要途径。碳源作为细胞的主要能源来源，是组织培养不可缺少的成分，不同的培养细胞适合生长的碳源不同[3]，由于植物组织培养的条件下往往缺乏合成生长素和分裂素的能力，外源激素成为培养基中不可缺少的关键物质[4]；细胞悬浮培养是实现植物细胞工业化生产的途径，相比于固体培养，细胞悬浮培养能使细胞增殖速度加快，可以大规模培养，并能提供大量均匀一致的细胞培养物[5]。笔者通过对百芯草愈伤组织培养的影响因素进行探讨，以期为后续探索百蕊草细胞悬浮培养体系的建立提供材料。
1材料与方法
1.1材料
野生百蕊草植株取自贵州省贵阳市花溪区。
外植体为粗细均匀、健壮、无病虫害、无损伤的新生枝条和叶片。
1.2方法
1.2.1愈伤组织的诱导培养。
外植体经自来水冲洗干净后用0.1%的氯化汞溶液消毒5～8 min，再用无菌水冲洗3次，最后将枝条和叶片剪成约1.0 cm长的小段，接种于表1培养基中。30 d后统计各项数据，筛选最佳初代培养基配方。
1.2.2不同激素配比对愈伤组织诱导的影响。挑选长势较一致的初代诱导愈伤组织，按表2设置不同激素水
平的正交试验处理，每处理接种10瓶，每瓶接种相似愈伤组
织3块。连续培养30 d后，用吸水纸吸取愈伤组织表面水分，晾干后称其鲜重，分析愈伤组织生长情况。
1.2.3不同碳源对愈伤组织诱导的影响。
在上述最佳激素浓度组合培养基中分别附加0、10、20、30、40、50、60 g/L的蔗糖、葡萄糖。每浓度设置10瓶，每瓶接种相似愈伤组织3块，连续培养30 d后，用吸水纸吸取愈伤组织表面水分，晾干后称其鲜重，分析愈伤组织生长情况。
1.2.4不同pH对愈伤组织诱导的影响。挑选长势较一致的初代诱导愈伤组织，以MS为基本培养基，pH设置为50、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2，每处理接种10瓶，每瓶接种相似愈伤组织3块。连续培养30 d后，用吸水纸吸取愈伤组织表面水分，晾干后称其鲜重，分析愈伤组织生长情况。
1.2.5愈伤组织继代培养基的选择。
将初代培养得到的愈伤组织切成约0.5 cm×0.5 cm的小块，接种至正交试验结果表现较好的C2、C5、C6 3个培养基中继代增殖培养，每处理接种10瓶，每瓶接种3块愈伤组织。连续培养30 d后，用吸水纸吸取愈伤组织表面水分，晾干后称其鲜重，分析愈伤组织增殖、生长情况。 1.3培养条件
培养室温度（24±3）℃，光照时间10～12 h/d，光照强度1 500～1 800 lx。
2结果与分析
2.1不同激素对愈伤组织生长的影响
外植体接种14 d后腋芽开始萌动，切口处开始膨大形成愈伤组织。培养30 d时的生长情况见表3。由表3可知，随着激素浓度的增加，愈伤组织不断增长，生长量和增殖率都有一定的提高，当6-BA、NAA、2，4-D浓度分别添加至1.00、0.15，0.10 mg/L时，愈伤组织的生长量、增殖率达到最大，愈伤组织呈深绿色。随着培养时间的延长，愈伤组织的颜色渐变为浅绿色。当6-BA、NAA、2，4-D浓度分别为300、2.00、0.25 mg/L时，愈伤组织生长缓慢，且随着培养时间的延长发生褐变，颜色渐变为黄色，最终导致愈伤组织死亡。
2.2激素配比对愈伤组织生长的影响
由表5可知，C2、C5和C6诱导出愈伤组织的数量比其他处理理想。三者中C2处理相比C5和C6处理诱导愈伤组织的效果好，C6有少量苗出现。
2.3不同碳源对愈伤组织生长的影响
由表5可知，随着碳源浓度的增加，愈伤组织生长量都有不同程度的增加，碳源浓度从0提高到30 g/L时，愈伤组织生长量也增加，30 g/L时达到最大，愈伤组织呈深绿色，随着培养时间的延长，愈伤组织的颜色渐变为健康的浅绿色。当碳源浓度从30 g/L增加到60 g/L时，愈伤组织的生长量随着碳源浓度的增加而逐渐下降，生长缓慢，并随着培养时间的延长发生褐变，最终导致愈伤组织死亡。蔗糖为碳源时，愈伤组织的生长量、增殖率比葡萄糖均有一定的提高。综上所述，蔗糖和葡萄糖作为碳源都能影响愈伤组织的生长，随着碳源浓度的增加，愈伤组织都有不同程度的增长，蔗糖作用显著优于葡萄糖，且蔗糖价格低廉，有利于降低培养成本。
2.4不同pH对愈伤组织生长的影响
pH为5.8～6.0时愈伤组织长势较好，增长较快，颜色为健康的浅绿色，其他pH下愈伤组织生长缓慢，随着培养时间的延长发生褐变，
颜色渐变为黄色，最终导致愈伤组织死亡。说明pH过低或过高不适合愈伤组织培养，pH 5.8～6.0最为适宜。
2.5愈伤组织继代培养基的选择
由表6可知，不同处理愈伤组织的增长和分化程度不同。C2处理愈伤组织的分化较好，生长量和增殖率比其他2个处理高，且愈伤组织随着培养时间的延长基本未发生褐变，颜色为浅绿色，较健康；C5处理愈伤组织褐化程度比C2和C6处理严重，生长量和增殖率比C6处理理想，C6处理未出现严重的褐化，但愈伤组织分化生长不理想，且易分化出苗。综合各项指标，以C2处理MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.15 mg/L+2，4-D 0.1 mg/L最佳。
3结论
该试验结果表明，3种激素和碳源对愈伤组织生长均有促进作用，对愈伤组织诱导生长的培养基最佳组合为MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.15 mg/L+2，4-D 0.1 mg/L。碳源中蔗糖显著促进百蕊草愈伤组织的增长，以30 m/L的蔗糖为最佳；pH 5.8～6.0有利于愈伤组织的诱导和生长。
参考文献
[1] 国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草[M].上海：上海科学技术出版社，1999：595-597.
[2] 安徽省百蕊草研究协作小组.百蕊草治疗急性炎症疾患的临床观察[J].新医药学杂志，1972（2）：38-39.
[3] SMITH M A L，MADHAVI D L，FANG Y，et al.Continuous cell cultureand product recovery from wild Vaccinium pahalae gemplasm[J].Journal of plant physiology，1997，150（4）：462-466.
[4] 李代丽.白刺愈伤组织培养中外源激素对内源激素影响的研究[D].北京：北京林业大学，2007
[5] 张韧，秦玉明，陈文庆，等.悬浮培养技术在生物制药中的应用和展望[J].中国兽药杂志， 2011，45（3）：56-60.
[6] 颜敬昌.植物组织培养手册[M].上海：上海科学技术出版社，1999：63-67.
关键词百蕊草；愈伤组织；碳源；植物生长调节剂
中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2016）22-132-03
Abstract[Objective]The aim was tostudy factors influencing callus culture of Thesium chinense.[Method] Taking tender branches and leaves of T. chinense as explants， effects of different concentrations of 6BA， NAA， 2，4Dand their combinations，carbon soueces as well as pH on callus were investigatedby using the orthogonal experiments.[Result] The results showed that fitting concentration of plant growth regulators and carbon sources could all promote the growth of callus，the best medium for induction of callus is MS+mediumsupplemented with 6BA 1 mg/L+NAA 0.15 mg/L+2，4D 0.1 mg/L， in the carbon sources，sucrose markedly increased callus， the adding of 30 m/L sucrose was the best choice.The pH value was 5.8-6.0.[Conclusion] The study can provide materials for study on T.chinense cell suspension culture.
Key wordsThesium chinense Turcz.； Callus； carbon sources； Plant growth regulators
百蕊草（Thesium chinense Turcz.）为檀香科植物，具有重要的药用价值，被称为“植物抗生素”[1]。百蕊草素是其主要成分，已被制成针剂用于治疗多种感染性炎症，具有较好疗效[2]。百蕊草是一种半寄生植物，野生资源较少。近年来，掠夺式的采集使百蕊草资源锐减，已成为频危珍稀种属。为满足市场需求，人工栽培虽然可以减轻供求压力，但由于百蕊草植株较小，产量较低，广种薄收，百蕊草素的生产严重受限。植物组织培养大规模生产植物次生代谢产物，已成为生产某些高价值产品的重要途径。碳源作为细胞的主要能源来源，是组织培养不可缺少的成分，不同的培养细胞适合生长的碳源不同[3]，由于植物组织培养的条件下往往缺乏合成生长素和分裂素的能力，外源激素成为培养基中不可缺少的关键物质[4]；细胞悬浮培养是实现植物细胞工业化生产的途径，相比于固体培养，细胞悬浮培养能使细胞增殖速度加快，可以大规模培养，并能提供大量均匀一致的细胞培养物[5]。笔者通过对百芯草愈伤组织培养的影响因素进行探讨，以期为后续探索百蕊草细胞悬浮培养体系的建立提供材料。
1材料与方法
1.1材料
野生百蕊草植株取自贵州省贵阳市花溪区。
外植体为粗细均匀、健壮、无病虫害、无损伤的新生枝条和叶片。
1.2方法
1.2.1愈伤组织的诱导培养。
外植体经自来水冲洗干净后用0.1%的氯化汞溶液消毒5～8 min，再用无菌水冲洗3次，最后将枝条和叶片剪成约1.0 cm长的小段，接种于表1培养基中。30 d后统计各项数据，筛选最佳初代培养基配方。
1.2.2不同激素配比对愈伤组织诱导的影响。挑选长势较一致的初代诱导愈伤组织，按表2设置不同激素水
平的正交试验处理，每处理接种10瓶，每瓶接种相似愈伤组
织3块。连续培养30 d后，用吸水纸吸取愈伤组织表面水分，晾干后称其鲜重，分析愈伤组织生长情况。
1.2.3不同碳源对愈伤组织诱导的影响。
在上述最佳激素浓度组合培养基中分别附加0、10、20、30、40、50、60 g/L的蔗糖、葡萄糖。每浓度设置10瓶，每瓶接种相似愈伤组织3块，连续培养30 d后，用吸水纸吸取愈伤组织表面水分，晾干后称其鲜重，分析愈伤组织生长情况。
1.2.4不同pH对愈伤组织诱导的影响。挑选长势较一致的初代诱导愈伤组织，以MS为基本培养基，pH设置为50、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2，每处理接种10瓶，每瓶接种相似愈伤组织3块。连续培养30 d后，用吸水纸吸取愈伤组织表面水分，晾干后称其鲜重，分析愈伤组织生长情况。
1.2.5愈伤组织继代培养基的选择。
将初代培养得到的愈伤组织切成约0.5 cm×0.5 cm的小块，接种至正交试验结果表现较好的C2、C5、C6 3个培养基中继代增殖培养，每处理接种10瓶，每瓶接种3块愈伤组织。连续培养30 d后，用吸水纸吸取愈伤组织表面水分，晾干后称其鲜重，分析愈伤组织增殖、生长情况。 1.3培养条件
培养室温度（24±3）℃，光照时间10～12 h/d，光照强度1 500～1 800 lx。
2结果与分析
2.1不同激素对愈伤组织生长的影响
外植体接种14 d后腋芽开始萌动，切口处开始膨大形成愈伤组织。培养30 d时的生长情况见表3。由表3可知，随着激素浓度的增加，愈伤组织不断增长，生长量和增殖率都有一定的提高，当6-BA、NAA、2，4-D浓度分别添加至1.00、0.15，0.10 mg/L时，愈伤组织的生长量、增殖率达到最大，愈伤组织呈深绿色。随着培养时间的延长，愈伤组织的颜色渐变为浅绿色。当6-BA、NAA、2，4-D浓度分别为300、2.00、0.25 mg/L时，愈伤组织生长缓慢，且随着培养时间的延长发生褐变，颜色渐变为黄色，最终导致愈伤组织死亡。
2.2激素配比对愈伤组织生长的影响
由表5可知，C2、C5和C6诱导出愈伤组织的数量比其他处理理想。三者中C2处理相比C5和C6处理诱导愈伤组织的效果好，C6有少量苗出现。
2.3不同碳源对愈伤组织生长的影响
由表5可知，随着碳源浓度的增加，愈伤组织生长量都有不同程度的增加，碳源浓度从0提高到30 g/L时，愈伤组织生长量也增加，30 g/L时达到最大，愈伤组织呈深绿色，随着培养时间的延长，愈伤组织的颜色渐变为健康的浅绿色。当碳源浓度从30 g/L增加到60 g/L时，愈伤组织的生长量随着碳源浓度的增加而逐渐下降，生长缓慢，并随着培养时间的延长发生褐变，最终导致愈伤组织死亡。蔗糖为碳源时，愈伤组织的生长量、增殖率比葡萄糖均有一定的提高。综上所述，蔗糖和葡萄糖作为碳源都能影响愈伤组织的生长，随着碳源浓度的增加，愈伤组织都有不同程度的增长，蔗糖作用显著优于葡萄糖，且蔗糖价格低廉，有利于降低培养成本。
2.4不同pH对愈伤组织生长的影响
pH为5.8～6.0时愈伤组织长势较好，增长较快，颜色为健康的浅绿色，其他pH下愈伤组织生长缓慢，随着培养时间的延长发生褐变，
颜色渐变为黄色，最终导致愈伤组织死亡。说明pH过低或过高不适合愈伤组织培养，pH 5.8～6.0最为适宜。
2.5愈伤组织继代培养基的选择
由表6可知，不同处理愈伤组织的增长和分化程度不同。C2处理愈伤组织的分化较好，生长量和增殖率比其他2个处理高，且愈伤组织随着培养时间的延长基本未发生褐变，颜色为浅绿色，较健康；C5处理愈伤组织褐化程度比C2和C6处理严重，生长量和增殖率比C6处理理想，C6处理未出现严重的褐化，但愈伤组织分化生长不理想，且易分化出苗。综合各项指标，以C2处理MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.15 mg/L+2，4-D 0.1 mg/L最佳。
3结论
该试验结果表明，3种激素和碳源对愈伤组织生长均有促进作用，对愈伤组织诱导生长的培养基最佳组合为MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.15 mg/L+2，4-D 0.1 mg/L。碳源中蔗糖显著促进百蕊草愈伤组织的增长，以30 m/L的蔗糖为最佳；pH 5.8～6.0有利于愈伤组织的诱导和生长。
参考文献
[1] 国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草[M].上海：上海科学技术出版社，1999：595-597.
[2] 安徽省百蕊草研究协作小组.百蕊草治疗急性炎症疾患的临床观察[J].新医药学杂志，1972（2）：38-39.
[3] SMITH M A L，MADHAVI D L，FANG Y，et al.Continuous cell cultureand product recovery from wild Vaccinium pahalae gemplasm[J].Journal of plant physiology，1997，150（4）：462-466.
[4] 李代丽.白刺愈伤组织培养中外源激素对内源激素影响的研究[D].北京：北京林业大学，2007
[5] 张韧，秦玉明，陈文庆，等.悬浮培养技术在生物制药中的应用和展望[J].中国兽药杂志， 2011，45（3）：56-60.
[6] 颜敬昌.植物组织培养手册[M].上海：上海科学技术出版社，1999：63-67.