目的建立同时测定镇痛活络酊中香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、巴西苏木素和（±）原苏木素B含量的高效液相色谱法。方法采用依利特C18柱;流动相为乙腈（A）-0.5%磷酸溶液（B）,梯度洗脱;流速:1.3 mL/min;柱温:26℃;检测波长λ₁=254 nm（香蒲新苷及异鼠李素-3-O-新橙皮苷）,λ₂=285 nm[巴西苏木素和（±）原苏木素B]。结果香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、巴西苏木素和（±）原苏木素B的线性范围分别为4.62⁹2.40μg/mL（r=0.999 2）、5.70¹14.00μg/mL（r=0.999 6）、8.95¹79.00μg/mL（r=0.999 4）、7.79¹55.80μg/mL（r=0.999 7）;香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、巴西苏木素和（±）原苏木素B的平均加样回收率分别为97.81%、99.16%、97.23%、96.74%,其RSD分别为1.19%、0.84%、1.04%、1.08%。结论所建立的镇痛活络酊样品中,4种成分（香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、巴西苏木素和（±）原苏木素B）的含量测定方法准确、可靠。