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摘 要：探究橄榄种子休眠生理与层积对种子萌发和幼苗生长的影响效应，为橄榄及其他核果类果树种子休眠生理研究和种苗繁育提供参考。以未层积种子（层积0 d）为对照，对橄榄种子进行不同时间（每10 d一处理，共10个处理）的层积处理，研究橄榄种子在层积过程中營养物质、激素水平等生理生化变化，以及不同层积时间种子的萌发和幼苗生长情况。结果表明：层积处理缩短了橄榄种子发芽启动时间，对橄榄种子萌发均有促进作用。层积90 d和100 d的橄榄种子发芽率最高，均为82.22%，比CK种子（53.33%）高54.17%，发芽指数也显著高于其他处理时间，层积100 d的橄榄种子发芽指数是CK的8.5倍（P<0.05）。层积能提高橄榄幼苗地上部生物量，以90、100 d处理的橄榄幼苗生长最好。橄榄种子的主要营养贮藏物质是粗脂肪（70.85%～81.67%），在层积过程中呈先升后降的趋势。新鲜橄榄种子（CK）中ABA含量较高（16.64 ng/g），而GA3未检测到。随层积时间延长，ABA与SA含量快速下降，GA3含量增加，IAA/ABA升高，利于种子休眠解除。层积处理橄榄种子有利于其营养物质达到萌发所需水平，加快内源激素变化，促进种子发芽和幼苗地上部生长，以层积90～100 d最佳。
关键词：橄榄;层积;内源激素;营养物质;休眠;发芽
中图分类号：Q945.35;S667.5 文献标识码：A
Dormancy Physiology and Stratification Effects of Chinese Olive [Canarium album （Lour.） Raeusch.] Seeds
YE Qinghua， WANG Wei， XIE Qian， CHEN Qingxi
College of Horticulture， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China
Abstract： The objective of the work was to explore the dormancy physiological of Chinese olive [Canarium album （Lour.） Raeusch.] seeds and the effects of stratification on seed germination and seedling growth， and to provide references for seed physiology research and seedling breeding of Chinese olive and other stone fruit trees. Unstratified seeds （stratified for 0 d） were used as the control （CK）， and the relevant indicators of the seeds with different stratification treatments （every 10 days as a treatment， a total of 10 treatments） were determined to study the physiological and biochemical changes of nutrients， hormone levels， the germination， and seedling growth. Results showed that the stratification treatment could shorten the initiation time of germination， different stratification treatments promoted the germination of Chinese olive seed. The germination rate of the stratified seeds was significantly higher than that of the unstratified （CK） seeds. The germination rate of the Chinese olive seeds with 90 d and 100 d stratification was the highest （82.22%）， which was 54.17% higher than that of CK （53.33%）. The germination index of 90 d and 100 d stratification was also significantly higher than that of other treatments. The germination index of stratified for 100 d was 8.5 times that of the CK seeds （P<0.05）. By considering the growth of the Chinese olive seedlings， the stratification treatment could improve the biomass of the aboveground part. The Chinese olive seedlings with 90 d and 100 d stratification treatment grew best. The main nutrient storage substance of Chinese olive seed was crude fat （70.85%～81.67%）， which tended to rise first and then fall during the stratification process. ABA content in the fresh Chinese olive seed was the highest （16.64 ng/g）， while GA3 was not detected. With the prolongation of the stratification time， the content of ABA and SA decreased rapidly， while the GA3 content and IAA/ABA increased， which was beneficial to the release from seed dormancy. As a result， stratification is advantageous for Chinese olive seeds to reach the required nutritional level for germination， accelerate endogenous hormone changes， promote seed germination and aboveground part growth of seedlings， and 90～100 days stratification treatment for C.album is the best solution for practical seedling breeding. Keywords： Chinese olive [Canarium album （Lour.） Raeusch.]; stratification; endogenous hormone; nutrient substance; dormancy; germination
DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.06.020
橄欖[Canarium album （Lour.） Raeusch.]为分布于热带、亚热带地区的常绿果树[1-2]，果实富含酚类化合物和萜类物质，在抗氧化、清除自由基、抑菌、抗病毒方面作用显著[3-5]。目前，橄榄砧木培育多为实生繁育，种子存在明显的休眠期，生产上通常采用橄榄果实自然腐烂或对种子进行层积处理，破除休眠。研究表明，未层积或置于自然通风处的橄榄种子出苗率仅为36.3%和4.5%，自然腐烂或层积后的橄榄种子发芽率可达76.7%和69.3%[6-7]。橄榄种子存在发芽率低，对脱水敏感，幼苗出苗时间不一致、长势参差不齐等问题[7]，极大地限制了橄榄的种苗繁育和品种选育进程。
种子休眠是植物在长期进化中形成的一种生态适应性，但在生产上却降低了种子的利用价值，播种时休眠会降低种子发芽率、影响出苗整齐度，并严重制约大规模常规育种和种苗生产[8-9]，尤其是核果类果树等的种子，如何解除果树种子休眠是当今生物学和农学研究的热点之一，而种子休眠的生理机制更是被众多研究者关注。层积处理是解除休眠最常用的方法，使种子在此期间内完成一系列生理变化和后熟过程，缩短发芽时间，提高发芽整齐度和发芽率，如桃[10]、核桃[11]、开心果[12]、苹果[13]、黄栌[14]、茶树[15]等的种子利用低温层积处理催芽较为有效。
目前，橄榄种子在实际生产中采用冬季层积处理，翌春播种。然而，其休眠期间的生理生化变化尚不明确，且不同层积时间对种子萌发及种苗生长是否有影响亦不得而知。故本研究对橄榄种子进行湿沙层积，研究橄榄种子在层积过程中的休眠生理及层积对种子萌发和幼苗生长的效应，旨在了解橄榄种子休眠解除的生理代谢及萌发特性，对橄榄实生繁育及种苗生产具有重要意义，亦能为其他果树种子的休眠生理研究等提供一定参考。
1 材料与方法
1.1 材料
以福建省橄榄主栽品种‘长营’为试材，采集11月份成熟果实，剔除病虫果、畸形果，取出种子洗净备用。
1.2 方法
1.2.1 层积处理 于2015年11月至2016年4月在设施大棚内进行模拟冬季层积处理试验，当地日气温如图1所示。在长宽高=1.2 m1.2 m 1.0 m的木箱内，以含水60%的河沙（用手紧握河沙，可成团而不滴水为度）进行种子层积。木箱底部有透水孔，底层沙厚20～30 cm;顶层沙厚20～30 cm，覆盖薄膜;中部为蒸馏水吸胀（24 h）后的橄榄种子1层、河沙1层，如此相间堆放5～7层。层积期间，及时喷水保湿。于层积0 d（对照，CK）、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 d取出种子，洗净。其中敲取至少200颗果核内的种胚，液氮处理后，保存于?80 ℃冰箱，用于相关指标测定，重复3次;另取90颗平播于苗床河沙中，覆沙2 cm，萌发期间，保证种子的光照、浇水等管理措施一致，田间持水量为70%～ 80%。观测记录不同层积时间橄榄种子萌发情况，计算发芽启动时间、发芽持续时间、发芽率、发芽指数。发芽结束20 d后，取正常生长的幼苗10株，测定幼苗生长量。每处理3次重复。
1.2.2 橄榄种子萌发及幼苗生长指标测定 发芽启动时间为种子播种到第一颗种子开始萌发所需时间，发芽持续时间为第一颗种子开始萌发至发芽结束时的总天数[15]。由于橄榄种子具有0～4个胚[17]，能萌发0～4株幼苗不等，故只要种子有一胚轴伸出土时，即认定该种子为发芽种子。当连续3 d每天的发芽率不超过重复粒数1%时即认为发芽结束。发芽率是衡量种子发芽能力的指标，发芽指数是种子活力指标，分别按以下公式计算[18]：
发芽率（GR，germination rate）=n/N100%
发芽指数（GI，germination index）=（Gt/Dt）
其中，n为发芽种子数，N为供试种子数，Gt为t日内的发芽数，Dt为相对应的种子发芽天数。
橄榄幼苗株高、茎粗分别用尺子、游标卡尺进行测量;叶面积采用扫描法测量;用电子天平测定地上部和地下部根系鲜重。
1.2.3 橄榄种子营养物质含量的测定 种子可溶性总糖（蒽酮比色法）、可溶性蛋白质（考马斯亮蓝法）、粗脂肪（索氏提取法）含量测定参照王学奎[19]的方法。
1.2.4 橄榄种子内源激素含量的测定 内源激素赤霉素（GA3）、脱落酸（ABA）、生长素（IAA）、水杨酸（SA）含量采用超高效液相色谱质谱法（UPLC-MS）测定。
（1）激素提取：将种子样品用液氮研磨，加入70%甲醇和同位素内标激素，4 ℃超声提取30 min，上清液离心浓缩后，用Oasis MCX柱进行固相萃取，萃取样品进行上机测定。
（2）测定：采用Waters XEVO-TQS高效液相色谱仪进行测定，色谱柱为Waters BEH C18（100 mm×2.1 mm 1.7 μm）;柱温：40 ℃;流动相A：5 mmol/L甲酸铵水溶液，流动相B：甲醇;洗脱程序：0～13 min，5%～100%B;13～17 min，100%B;17～20 min，100%～5%B;进样体积：5 μL;流速：0.3 mL/min。条件如下：正离子模式参数：毛细管电压1.00 kV;锥孔电压30 V;离子源温度150 ℃;锥孔气流量150 L/Hr;脱溶剂气流量800 L/Hr;脱溶剂气温度400 ℃。负离子模式参数：毛细管电压1.00 kV;锥孔电压30 V;离子源温度150 ℃;锥孔气流量150 L/Hr;脱溶剂气流量800 L/Hr;脱溶剂气温度400 ℃。 1.3 数据处理
数据采用Excel 2016软件处理，Graph prism 7.0软件制图，利用SPSS 19.0软件进行单因素方差（ANOVA）分析，用LSD检验法对显著性差异（P<0.05）进行多重比较，数据表示为平均值标准误差。
2 结果与分析
2.1 层积处理对橄榄种子萌发的影响
由不同层积处理的橄榄种子萌发时间（表1）可知，发芽启动时间随层积时间增加而缩短。层积时间越长，则发芽启动所需时间越短，层积100 d种子，播种后15 d开始萌发，比0 d种子缩短了105 d。而各处理发芽持续时间差异不大（25～30 d）。将层积时间与萌发启动时间相加，即萌发启动所需总天数，以层积至发芽结束的时间为横坐标，观察不同处理的种子萌发过程（图2），可知，橄榄种子从层积处理需经过115～125 d开始萌发，145～150 d萌发结束。其中，层积60、80、90、100 d处理的种子在145 d即可提早结束发芽，且具有较大出苗数（>80株）。从萌发过程看，层积90、100 d出苗时间短而集中，具有较好效果。
由图3可知，层积处理10～100 d对橄榄种子萌发均有促进作用，萌发率显著高于CK种子。其中，层积90 d和100 d的发芽率最高，均为82.22%，比CK（53.33%）高出54.17%。由于橄榄种子发芽启动天数较长，故发芽指数较一般种子低，仅为0.15～1.29，但随着层积时间增加，发
芽指数逐渐上升。层积90、100 d时，发芽指数迅速升高，显著高于其他时期（P<0.05），100 d时达最高，为CK的8.5倍，表明该时期的种子活力高。
2.2 层积处理对橄榄种苗生长的影响
不同层积时间橄榄种苗生长情况如表2，幼苗株高在10.96～12.78 cm范围内，以层积70、90、100 d最高，显著高于CK（P<0.05）;不同处理幼苗茎粗在1.69～2.11 mm范围内，总体差异不大;而幼苗叶面积、地上部鲜重均以层积100 d最大，分别比CK高出45.13%、31.57%（P<0.05）;而层积时间长短对地下部生长影响不大。表明，层积处理能提高橄榄幼苗地上部生物量水平，以100 d处理的橄榄幼苗生物量最多，植株生长最好，而90 d与100 d处理的幼苗总体差异不显著。
2.3 层积过程中橄榄种子营养物质变化
糖类、蛋白质和脂肪是种子休眠解除和萌发的重要营养来源，由图4可知，橄榄种子主要贮藏营养物质为粗脂肪，含量达70.85%～81.67%。层积过程中，其可溶性糖含量相对稳定;而蛋白质含量整体处于升-降-升-降趋势，层积50 d时最高，显著高于50 d之前（P<0.05），比新鲜种子（0 d）的蛋白含量高出21.36%，而后下降。粗脂肪随层积时间延长呈先升后降趋势，层积50 d时，含量最高，比新鲜种子（0 d）显著高出15.27%，随后呈现逐步降低趋势。
2.4 层积过程中橄榄种子内源激素的变化
植物激素在种子的休眠与萌发中起到重要作
用，由图5可知，新鲜橄榄种子中ABA含量较高（16.64 ng/g），分别是IAA、SA的43.29、3.74倍。随层积时间延长，ABA与SA趋势相同，含量快速下降后趋于平缓。ABA与SA含量降低，解除了其对橄榄种子休眠的抑制作用。而IAA含量總体较低，首先下降，后期波动变化。新鲜种子未检测到GA3，而层积过程中GA3含量变化为双峰趋势，层积30 d、90 d时具有极大值。
种子休眠解除与否除了与激素的绝对含量有关外，也与激素间的平衡有关[20]。由图6可知，层积过程中，SA/ABA表现为先升后降再升趋势，而IAA/ABA整体呈上升趋势，有利于种子休眠解除;GA3/ABA与GA3趋势相近，在层积30 d及90 d时有极大值。
3 讨论
层积处理是一种广泛使用且有效的打破种子休眠的方法，层积处理期间，种子抑制物含量下降，营养物质达到一定水平，种胚发育后熟，有助于打破桃[10]、苹果[13]、欧洲李[21]等核果类果树种子的生理休眠，为发芽提供了有利条件。本研究表明，层积处理能在不同程度上提高橄榄种子发芽率，但不同层积时间对发芽率影响各有不同，以层积90 d、100 d处理最高（82.22%），比未层积（53.33%）的种子高出54.17%。对发芽指数影响更为明显，表明层积时间越长，种子活力越高。虽然层积10 d与层积100 d的种子发芽率差异不显著，但层积100 d种子发芽指数显著高于层积10 d的种子，且发芽启动天数缩短了96 d，表明层积100 d的橄榄种子发芽集中、迅速而整齐。层积处理对幼苗株高和叶面积有一定促进作用，从而增大了地上部鲜重，层积90 d、100 d处理效果较好。层积时间越长，发芽启动所需时间越短，表明层积处理能加快橄榄种子发芽启动。本试验是模拟冬季层积，与实际贴合，可为生产实践提供一定参考。对于休眠机理方面，虽控制所有种子的温湿及管理条件一致，但可能涉及的生物钟和温周期效应应在未来研究中加以深入。
层积的湿沙环境给橄榄种子提供了一个继续完成生理后熟的环境条件，有利于大分子营养物质进行水解与转化。碳水化合物、蛋白质和脂质等主要贮藏物质是大多数种子休眠解除，促进萌发生长必需的营养物质和幼苗早期生长的能量来源[22]。当种子从休眠状态进入吸胀萌动阶段，细胞内部发生一系列生理生化变化，生长首先动用胚或胚轴中的可溶性糖和蛋白质，而后贮藏组织中的大分子物质（贮藏蛋白、脂肪等），在其相关代谢酶（蛋白酶、脂肪酶等）的催化作用下被分解成可溶性小分子，然后输送到胚的生长部位被继续分解和利用。而种子贮藏物质对休眠解除和萌发的影响取决于储备量和植物种类，如藜、苜蓿种子的发芽与可溶性糖含量正相关[23]，蛋白质在豆科植物种子萌发期间起动员作用[24]，向日葵种子萌发期间，油酸和蛋白质含量均显著降低[25]。层积对种子内部营养代谢环节方面有很好的促进作用[26， 27]。成熟和休眠的种子中存在贮藏油脂分解代谢所需的多种酶，在拟南芥和油菜种子发育过程中，脂质显著分解，在种子成熟最后阶段，油含量下降，控制种子休眠进程[28]。而脂肪水解释放出脂肪酸和甘油，并经历进一步的分解代谢以提供能量和碳骨架用作呼吸的底物，促进种子发芽生长。橄榄种子生理代谢物质以脂肪为主，其他物质含量较低。被子植物种子的主要贮藏脂类是三酰基甘油（Triacylglycerols，TAGs），是碳源和能量的高效储备来源，为种子发芽提供能量。种子TAGs合成于质体外，可能与内质网和油体有关，而脂肪酸则在质体中合成，质体中产生的脂肪酸并不总能立即用于TAG的生物合成。而且，对于不同物种，油体在种子不同组织中的丰度和位置也有很大差异[29， 30]。本研究层积处理早期，橄榄种子粗脂肪含量首先上升，可能与油体位置和脂质在种子不同部位间的转移有关，或新鲜种子中的游离脂肪酸含量较高，层积处理前期先将脂肪酸转化为TAGs进行贮藏，完成生理后熟作用。后续可测定游离脂肪酸、脂肪合成酶、酰基转移酶等相关酶活性进一步深入研究。 植物激素参与种子休眠与萌发的调控，如萌发促进物质赤霉素、细胞分裂素和萌发抑制物质脱落酸之间的相互作用决定种子的休眠与萌发，愈来愈多研究表明种子休眠不仅由多种激素调节，也与激素间的平衡关系以及细胞对激素的敏感性有关[31-34]。其中，ABA和GA是主要激素，ABA/GA平衡决定了种子命运，高内源ABA和低水平GA导致种子休眠和出苗率低，ABA参与GA生物合成的抑制作用，而GA也负反馈调节ABA生物合成[35]。种子不同组织部位在决定发芽方面具有不同作用，ABA主要在胚乳中产生，然后由特定转运蛋白输出到胚中，而休眠解除期间GA由胚产生，引发储存在种子中的碳水化合物分解代谢[32]。因此，种子中的激素水平不仅取决于激素的生物合成和分解代谢，也与激素及其前体在种子中不同组织部位的转运有关。在橄榄种子中，高浓度ABA及低浓度GA是导致其休眠的主要因素，新鲜种子含有丰富的ABA，而未检测到GA3。层积处理促进了萌发促进性激素（GA3）水平的提高，降低了萌发抑制性激素（ABA、SA）含量，增大GA3/ABA、IAA/ABA，提高了种子激素代谢活动。随层积时间延长，ABA降低，为其他内源激素发挥作用提供环境条件。而GA浓度在整个层积过程中呈现双峰趋势，可能与其生物合成基因GA3ox及信号传导的DELLA蛋白等有关[36]。研究表明，生长素IAA与ABA信号通路发生串扰[37]，橄榄种子层积后期，IAA含量波动变化，而IAA/ABA随着层积时间的延长呈上升趋势，对萌发具有促进作用，与红豆杉种子相类似[27]。SA是一种与各种防御途径相关的植物激素，能够抑制种子发芽[38]。层积后的橄榄种子SA与ABA变化趋势相同，SA的降低使种子休眠得到解除。除了植物激素外，其他内源信号因子如活性氧（ROS）[39-40]、一氧化氮（NO）[13]和光[41]、温度[42]等环境因子也会影响ABA和GA之间的平衡，进而影响种子的休眠和萌发。
4 结论
橄榄种子主要贮藏的营养物质为粗脂肪，高浓度ABA和低浓度的GA3导致了种子休眠。层积处理有利于橄榄种子营养物质提高达到萌发所需水平，促进内源激素转化，利于种子萌发;同时，对橄榄幼苗地上部生长具有一定促进作用。与未层积相比，层积处理90、100 d能加快橄榄种子发芽启动，提高发芽指数，使种子发芽迅速而整齐，幼苗生长效果最佳。从实际生产的角度考虑，对橄榄种子先进行层积处理90～100 d后再播种，与直接播种相比，能够节约管理成本与劳动强度，是橄榄实生苗繁育及种苗生产较为便捷有效的措施。
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責任编辑：白 净
关键词：橄榄;层积;内源激素;营养物质;休眠;发芽
中图分类号：Q945.35;S667.5 文献标识码：A
Dormancy Physiology and Stratification Effects of Chinese Olive [Canarium album （Lour.） Raeusch.] Seeds
YE Qinghua， WANG Wei， XIE Qian， CHEN Qingxi
College of Horticulture， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China
Abstract： The objective of the work was to explore the dormancy physiological of Chinese olive [Canarium album （Lour.） Raeusch.] seeds and the effects of stratification on seed germination and seedling growth， and to provide references for seed physiology research and seedling breeding of Chinese olive and other stone fruit trees. Unstratified seeds （stratified for 0 d） were used as the control （CK）， and the relevant indicators of the seeds with different stratification treatments （every 10 days as a treatment， a total of 10 treatments） were determined to study the physiological and biochemical changes of nutrients， hormone levels， the germination， and seedling growth. Results showed that the stratification treatment could shorten the initiation time of germination， different stratification treatments promoted the germination of Chinese olive seed. The germination rate of the stratified seeds was significantly higher than that of the unstratified （CK） seeds. The germination rate of the Chinese olive seeds with 90 d and 100 d stratification was the highest （82.22%）， which was 54.17% higher than that of CK （53.33%）. The germination index of 90 d and 100 d stratification was also significantly higher than that of other treatments. The germination index of stratified for 100 d was 8.5 times that of the CK seeds （P<0.05）. By considering the growth of the Chinese olive seedlings， the stratification treatment could improve the biomass of the aboveground part. The Chinese olive seedlings with 90 d and 100 d stratification treatment grew best. The main nutrient storage substance of Chinese olive seed was crude fat （70.85%～81.67%）， which tended to rise first and then fall during the stratification process. ABA content in the fresh Chinese olive seed was the highest （16.64 ng/g）， while GA3 was not detected. With the prolongation of the stratification time， the content of ABA and SA decreased rapidly， while the GA3 content and IAA/ABA increased， which was beneficial to the release from seed dormancy. As a result， stratification is advantageous for Chinese olive seeds to reach the required nutritional level for germination， accelerate endogenous hormone changes， promote seed germination and aboveground part growth of seedlings， and 90～100 days stratification treatment for C.album is the best solution for practical seedling breeding. Keywords： Chinese olive [Canarium album （Lour.） Raeusch.]; stratification; endogenous hormone; nutrient substance; dormancy; germination
DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.06.020
橄欖[Canarium album （Lour.） Raeusch.]为分布于热带、亚热带地区的常绿果树[1-2]，果实富含酚类化合物和萜类物质，在抗氧化、清除自由基、抑菌、抗病毒方面作用显著[3-5]。目前，橄榄砧木培育多为实生繁育，种子存在明显的休眠期，生产上通常采用橄榄果实自然腐烂或对种子进行层积处理，破除休眠。研究表明，未层积或置于自然通风处的橄榄种子出苗率仅为36.3%和4.5%，自然腐烂或层积后的橄榄种子发芽率可达76.7%和69.3%[6-7]。橄榄种子存在发芽率低，对脱水敏感，幼苗出苗时间不一致、长势参差不齐等问题[7]，极大地限制了橄榄的种苗繁育和品种选育进程。
种子休眠是植物在长期进化中形成的一种生态适应性，但在生产上却降低了种子的利用价值，播种时休眠会降低种子发芽率、影响出苗整齐度，并严重制约大规模常规育种和种苗生产[8-9]，尤其是核果类果树等的种子，如何解除果树种子休眠是当今生物学和农学研究的热点之一，而种子休眠的生理机制更是被众多研究者关注。层积处理是解除休眠最常用的方法，使种子在此期间内完成一系列生理变化和后熟过程，缩短发芽时间，提高发芽整齐度和发芽率，如桃[10]、核桃[11]、开心果[12]、苹果[13]、黄栌[14]、茶树[15]等的种子利用低温层积处理催芽较为有效。
目前，橄榄种子在实际生产中采用冬季层积处理，翌春播种。然而，其休眠期间的生理生化变化尚不明确，且不同层积时间对种子萌发及种苗生长是否有影响亦不得而知。故本研究对橄榄种子进行湿沙层积，研究橄榄种子在层积过程中的休眠生理及层积对种子萌发和幼苗生长的效应，旨在了解橄榄种子休眠解除的生理代谢及萌发特性，对橄榄实生繁育及种苗生产具有重要意义，亦能为其他果树种子的休眠生理研究等提供一定参考。
1 材料与方法
1.1 材料
以福建省橄榄主栽品种‘长营’为试材，采集11月份成熟果实，剔除病虫果、畸形果，取出种子洗净备用。
1.2 方法
1.2.1 层积处理 于2015年11月至2016年4月在设施大棚内进行模拟冬季层积处理试验，当地日气温如图1所示。在长宽高=1.2 m1.2 m 1.0 m的木箱内，以含水60%的河沙（用手紧握河沙，可成团而不滴水为度）进行种子层积。木箱底部有透水孔，底层沙厚20～30 cm;顶层沙厚20～30 cm，覆盖薄膜;中部为蒸馏水吸胀（24 h）后的橄榄种子1层、河沙1层，如此相间堆放5～7层。层积期间，及时喷水保湿。于层积0 d（对照，CK）、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 d取出种子，洗净。其中敲取至少200颗果核内的种胚，液氮处理后，保存于?80 ℃冰箱，用于相关指标测定，重复3次;另取90颗平播于苗床河沙中，覆沙2 cm，萌发期间，保证种子的光照、浇水等管理措施一致，田间持水量为70%～ 80%。观测记录不同层积时间橄榄种子萌发情况，计算发芽启动时间、发芽持续时间、发芽率、发芽指数。发芽结束20 d后，取正常生长的幼苗10株，测定幼苗生长量。每处理3次重复。
1.2.2 橄榄种子萌发及幼苗生长指标测定 发芽启动时间为种子播种到第一颗种子开始萌发所需时间，发芽持续时间为第一颗种子开始萌发至发芽结束时的总天数[15]。由于橄榄种子具有0～4个胚[17]，能萌发0～4株幼苗不等，故只要种子有一胚轴伸出土时，即认定该种子为发芽种子。当连续3 d每天的发芽率不超过重复粒数1%时即认为发芽结束。发芽率是衡量种子发芽能力的指标，发芽指数是种子活力指标，分别按以下公式计算[18]：
发芽率（GR，germination rate）=n/N100%
发芽指数（GI，germination index）=（Gt/Dt）
其中，n为发芽种子数，N为供试种子数，Gt为t日内的发芽数，Dt为相对应的种子发芽天数。
橄榄幼苗株高、茎粗分别用尺子、游标卡尺进行测量;叶面积采用扫描法测量;用电子天平测定地上部和地下部根系鲜重。
1.2.3 橄榄种子营养物质含量的测定 种子可溶性总糖（蒽酮比色法）、可溶性蛋白质（考马斯亮蓝法）、粗脂肪（索氏提取法）含量测定参照王学奎[19]的方法。
1.2.4 橄榄种子内源激素含量的测定 内源激素赤霉素（GA3）、脱落酸（ABA）、生长素（IAA）、水杨酸（SA）含量采用超高效液相色谱质谱法（UPLC-MS）测定。
（1）激素提取：将种子样品用液氮研磨，加入70%甲醇和同位素内标激素，4 ℃超声提取30 min，上清液离心浓缩后，用Oasis MCX柱进行固相萃取，萃取样品进行上机测定。
（2）测定：采用Waters XEVO-TQS高效液相色谱仪进行测定，色谱柱为Waters BEH C18（100 mm×2.1 mm 1.7 μm）;柱温：40 ℃;流动相A：5 mmol/L甲酸铵水溶液，流动相B：甲醇;洗脱程序：0～13 min，5%～100%B;13～17 min，100%B;17～20 min，100%～5%B;进样体积：5 μL;流速：0.3 mL/min。条件如下：正离子模式参数：毛细管电压1.00 kV;锥孔电压30 V;离子源温度150 ℃;锥孔气流量150 L/Hr;脱溶剂气流量800 L/Hr;脱溶剂气温度400 ℃。负离子模式参数：毛细管电压1.00 kV;锥孔电压30 V;离子源温度150 ℃;锥孔气流量150 L/Hr;脱溶剂气流量800 L/Hr;脱溶剂气温度400 ℃。 1.3 数据处理
数据采用Excel 2016软件处理，Graph prism 7.0软件制图，利用SPSS 19.0软件进行单因素方差（ANOVA）分析，用LSD检验法对显著性差异（P<0.05）进行多重比较，数据表示为平均值标准误差。
2 结果与分析
2.1 层积处理对橄榄种子萌发的影响
由不同层积处理的橄榄种子萌发时间（表1）可知，发芽启动时间随层积时间增加而缩短。层积时间越长，则发芽启动所需时间越短，层积100 d种子，播种后15 d开始萌发，比0 d种子缩短了105 d。而各处理发芽持续时间差异不大（25～30 d）。将层积时间与萌发启动时间相加，即萌发启动所需总天数，以层积至发芽结束的时间为横坐标，观察不同处理的种子萌发过程（图2），可知，橄榄种子从层积处理需经过115～125 d开始萌发，145～150 d萌发结束。其中，层积60、80、90、100 d处理的种子在145 d即可提早结束发芽，且具有较大出苗数（>80株）。从萌发过程看，层积90、100 d出苗时间短而集中，具有较好效果。
由图3可知，层积处理10～100 d对橄榄种子萌发均有促进作用，萌发率显著高于CK种子。其中，层积90 d和100 d的发芽率最高，均为82.22%，比CK（53.33%）高出54.17%。由于橄榄种子发芽启动天数较长，故发芽指数较一般种子低，仅为0.15～1.29，但随着层积时间增加，发
芽指数逐渐上升。层积90、100 d时，发芽指数迅速升高，显著高于其他时期（P<0.05），100 d时达最高，为CK的8.5倍，表明该时期的种子活力高。
2.2 层积处理对橄榄种苗生长的影响
不同层积时间橄榄种苗生长情况如表2，幼苗株高在10.96～12.78 cm范围内，以层积70、90、100 d最高，显著高于CK（P<0.05）;不同处理幼苗茎粗在1.69～2.11 mm范围内，总体差异不大;而幼苗叶面积、地上部鲜重均以层积100 d最大，分别比CK高出45.13%、31.57%（P<0.05）;而层积时间长短对地下部生长影响不大。表明，层积处理能提高橄榄幼苗地上部生物量水平，以100 d处理的橄榄幼苗生物量最多，植株生长最好，而90 d与100 d处理的幼苗总体差异不显著。
2.3 层积过程中橄榄种子营养物质变化
糖类、蛋白质和脂肪是种子休眠解除和萌发的重要营养来源，由图4可知，橄榄种子主要贮藏营养物质为粗脂肪，含量达70.85%～81.67%。层积过程中，其可溶性糖含量相对稳定;而蛋白质含量整体处于升-降-升-降趋势，层积50 d时最高，显著高于50 d之前（P<0.05），比新鲜种子（0 d）的蛋白含量高出21.36%，而后下降。粗脂肪随层积时间延长呈先升后降趋势，层积50 d时，含量最高，比新鲜种子（0 d）显著高出15.27%，随后呈现逐步降低趋势。
2.4 层积过程中橄榄种子内源激素的变化
植物激素在种子的休眠与萌发中起到重要作
用，由图5可知，新鲜橄榄种子中ABA含量较高（16.64 ng/g），分别是IAA、SA的43.29、3.74倍。随层积时间延长，ABA与SA趋势相同，含量快速下降后趋于平缓。ABA与SA含量降低，解除了其对橄榄种子休眠的抑制作用。而IAA含量總体较低，首先下降，后期波动变化。新鲜种子未检测到GA3，而层积过程中GA3含量变化为双峰趋势，层积30 d、90 d时具有极大值。
种子休眠解除与否除了与激素的绝对含量有关外，也与激素间的平衡有关[20]。由图6可知，层积过程中，SA/ABA表现为先升后降再升趋势，而IAA/ABA整体呈上升趋势，有利于种子休眠解除;GA3/ABA与GA3趋势相近，在层积30 d及90 d时有极大值。
3 讨论
层积处理是一种广泛使用且有效的打破种子休眠的方法，层积处理期间，种子抑制物含量下降，营养物质达到一定水平，种胚发育后熟，有助于打破桃[10]、苹果[13]、欧洲李[21]等核果类果树种子的生理休眠，为发芽提供了有利条件。本研究表明，层积处理能在不同程度上提高橄榄种子发芽率，但不同层积时间对发芽率影响各有不同，以层积90 d、100 d处理最高（82.22%），比未层积（53.33%）的种子高出54.17%。对发芽指数影响更为明显，表明层积时间越长，种子活力越高。虽然层积10 d与层积100 d的种子发芽率差异不显著，但层积100 d种子发芽指数显著高于层积10 d的种子，且发芽启动天数缩短了96 d，表明层积100 d的橄榄种子发芽集中、迅速而整齐。层积处理对幼苗株高和叶面积有一定促进作用，从而增大了地上部鲜重，层积90 d、100 d处理效果较好。层积时间越长，发芽启动所需时间越短，表明层积处理能加快橄榄种子发芽启动。本试验是模拟冬季层积，与实际贴合，可为生产实践提供一定参考。对于休眠机理方面，虽控制所有种子的温湿及管理条件一致，但可能涉及的生物钟和温周期效应应在未来研究中加以深入。
层积的湿沙环境给橄榄种子提供了一个继续完成生理后熟的环境条件，有利于大分子营养物质进行水解与转化。碳水化合物、蛋白质和脂质等主要贮藏物质是大多数种子休眠解除，促进萌发生长必需的营养物质和幼苗早期生长的能量来源[22]。当种子从休眠状态进入吸胀萌动阶段，细胞内部发生一系列生理生化变化，生长首先动用胚或胚轴中的可溶性糖和蛋白质，而后贮藏组织中的大分子物质（贮藏蛋白、脂肪等），在其相关代谢酶（蛋白酶、脂肪酶等）的催化作用下被分解成可溶性小分子，然后输送到胚的生长部位被继续分解和利用。而种子贮藏物质对休眠解除和萌发的影响取决于储备量和植物种类，如藜、苜蓿种子的发芽与可溶性糖含量正相关[23]，蛋白质在豆科植物种子萌发期间起动员作用[24]，向日葵种子萌发期间，油酸和蛋白质含量均显著降低[25]。层积对种子内部营养代谢环节方面有很好的促进作用[26， 27]。成熟和休眠的种子中存在贮藏油脂分解代谢所需的多种酶，在拟南芥和油菜种子发育过程中，脂质显著分解，在种子成熟最后阶段，油含量下降，控制种子休眠进程[28]。而脂肪水解释放出脂肪酸和甘油，并经历进一步的分解代谢以提供能量和碳骨架用作呼吸的底物，促进种子发芽生长。橄榄种子生理代谢物质以脂肪为主，其他物质含量较低。被子植物种子的主要贮藏脂类是三酰基甘油（Triacylglycerols，TAGs），是碳源和能量的高效储备来源，为种子发芽提供能量。种子TAGs合成于质体外，可能与内质网和油体有关，而脂肪酸则在质体中合成，质体中产生的脂肪酸并不总能立即用于TAG的生物合成。而且，对于不同物种，油体在种子不同组织中的丰度和位置也有很大差异[29， 30]。本研究层积处理早期，橄榄种子粗脂肪含量首先上升，可能与油体位置和脂质在种子不同部位间的转移有关，或新鲜种子中的游离脂肪酸含量较高，层积处理前期先将脂肪酸转化为TAGs进行贮藏，完成生理后熟作用。后续可测定游离脂肪酸、脂肪合成酶、酰基转移酶等相关酶活性进一步深入研究。 植物激素参与种子休眠与萌发的调控，如萌发促进物质赤霉素、细胞分裂素和萌发抑制物质脱落酸之间的相互作用决定种子的休眠与萌发，愈来愈多研究表明种子休眠不仅由多种激素调节，也与激素间的平衡关系以及细胞对激素的敏感性有关[31-34]。其中，ABA和GA是主要激素，ABA/GA平衡决定了种子命运，高内源ABA和低水平GA导致种子休眠和出苗率低，ABA参与GA生物合成的抑制作用，而GA也负反馈调节ABA生物合成[35]。种子不同组织部位在决定发芽方面具有不同作用，ABA主要在胚乳中产生，然后由特定转运蛋白输出到胚中，而休眠解除期间GA由胚产生，引发储存在种子中的碳水化合物分解代谢[32]。因此，种子中的激素水平不仅取决于激素的生物合成和分解代谢，也与激素及其前体在种子中不同组织部位的转运有关。在橄榄种子中，高浓度ABA及低浓度GA是导致其休眠的主要因素，新鲜种子含有丰富的ABA，而未检测到GA3。层积处理促进了萌发促进性激素（GA3）水平的提高，降低了萌发抑制性激素（ABA、SA）含量，增大GA3/ABA、IAA/ABA，提高了种子激素代谢活动。随层积时间延长，ABA降低，为其他内源激素发挥作用提供环境条件。而GA浓度在整个层积过程中呈现双峰趋势，可能与其生物合成基因GA3ox及信号传导的DELLA蛋白等有关[36]。研究表明，生长素IAA与ABA信号通路发生串扰[37]，橄榄种子层积后期，IAA含量波动变化，而IAA/ABA随着层积时间的延长呈上升趋势，对萌发具有促进作用，与红豆杉种子相类似[27]。SA是一种与各种防御途径相关的植物激素，能够抑制种子发芽[38]。层积后的橄榄种子SA与ABA变化趋势相同，SA的降低使种子休眠得到解除。除了植物激素外，其他内源信号因子如活性氧（ROS）[39-40]、一氧化氮（NO）[13]和光[41]、温度[42]等环境因子也会影响ABA和GA之间的平衡，进而影响种子的休眠和萌发。
4 结论
橄榄种子主要贮藏的营养物质为粗脂肪，高浓度ABA和低浓度的GA3导致了种子休眠。层积处理有利于橄榄种子营养物质提高达到萌发所需水平，促进内源激素转化，利于种子萌发;同时，对橄榄幼苗地上部生长具有一定促进作用。与未层积相比，层积处理90、100 d能加快橄榄种子发芽启动，提高发芽指数，使种子发芽迅速而整齐，幼苗生长效果最佳。从实际生产的角度考虑，对橄榄种子先进行层积处理90～100 d后再播种，与直接播种相比，能够节约管理成本与劳动强度，是橄榄实生苗繁育及种苗生产较为便捷有效的措施。
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