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【摘要】 目的：对双歧杆菌属编码的Ⅱ类毒素-抗毒素（TA）系统MazEF进行分子进化分析。方法：利用PSI-BLAST在NCBI中搜索获得双歧杆菌编码的MazF分子序列，在NCBI蛋白数据库、核酸数据库分别下载其他菌属基因组编码的MazF蛋白序列和本研究所涉及菌属的16 S rRNA序列，应用Clustal X2和MEGA4软件对MazF做分子进化分析。结果：共搜索到双歧杆菌株染色体编码毒素蛋白MazF 26个。分子进化分析显示：整个双歧杆菌属的MazF保守性不好；MazF与16 S rRNA的共进化仅在个别菌种中发现，大部分MazF的聚类结果与相应菌种16 S rRNA的聚类结果不同。结论：双歧杆菌中的TA系统MazEF可能是通过基因的水平转移整合入基因组中，属于菌株非核心基因组部分。
【关键词】 MazEF； 毒素-抗毒素系统； 分子进化； 双歧杆菌
Ⅱ类毒素-抗毒素（TA）系统，最早在1982年于大肠埃希菌的低拷贝质粒中发现。其后发现，TA系统同样存在于细菌染色体上，也存在于一些外源DNA岛如噬菌体、转座子、超级内含子和质粒中，由于近年来发现其参与细菌的多种应激调控过程而被广泛关注[1]。生物信息学分析发现：多达750个细菌和古细菌的基因组中存在Ⅱ类TA系统；自生微生物的基因组中一般含有多个Ⅱ类TA系统编码基因，而在严格的胞内微生物基因组中未发现Ⅱ类TA系统编码基因；以上证据提示Ⅱ类TA系统对微生物的生存具有重要作用。主流观点认为：TA系统可能作为一个特殊的压力反应原件，在细菌对不利环境的应激调控过程中发挥重要作用[2-3]。根据TA系统中氨基酸序列的相似度，Ⅱ类TA中的毒素蛋白被分为9个家族，包括CcdB、RelE、MazF、ParE、Doc、VapC、ζ、HipA以及HigB[3]。根据毒素蛋白的分类，相应TA系统被分为9类。其中，MazEF是最早在大肠埃希菌基因组中发现、研究最为深入的Ⅱ类TA系统之一，参与细菌对营养饥饿、抗生素、高温、DNA损伤等应激反应调控[1，4]。
双歧杆菌（Bifidobacterium）是母乳喂养的婴儿肠道中的优势菌，具有对宿主多方面的益生作用，如拮抗肠道病原体、调节免疫、平衡肠道菌群等[5-20]。作为一种模式益生菌，双歧杆菌经常与其他乳酸菌一起用于益生菌制品的生产，在食品、医药、畜牧等领域应用广泛。作为益生菌使用的双歧杆菌在工业加工、储藏、运输以及进入宿主胃肠道的过程中会遭遇各种环境胁迫，如酸、热、氧气、营养匮乏和高渗透压等各种不利刺激。目前，已经有近40株双歧杆菌进行了全基因组测序，但是它们的基因组中是否存在MazEF、它们分子的进化关系如何、是否参与双歧杆菌对多种不利环境的应激调控均不清楚。由于构成TA系统的一对毒素蛋白（MazF）和抗毒素蛋白（MazE）处于共进化的状态，MazF的进化状态可以代表TA系统MazEF的进化状态[21]。因此，本研究通过对双歧杆菌MazF的进化分析间接研究MazEF的分子进化。作者在NCBI数据库中获得双歧杆菌编码的MazF，对其进行多序列比对；进一步将来自双歧杆菌属和其他菌属的毒素蛋白MazF和菌株16 S rRNA的进化分析结果进行比较，完成对双歧杆菌MazEF的分子进化分析。
1 资料与方法
1.1 一般资料 MazF蛋白和16 S rRNA序列菌株来源均下载自NCBI，包括B. longum，B. breve，B. stellenboschense，B.ruminantium， B. kashiwanohense， B. bifidum， Streptococcus mutans， Mycobacterium tuberculosis， Escherichia coli， Lactobacillus plantarum， Lactobacillus acidophilus和Lactobacillus johnsonii。
1.2 方法 MazF蛋白和16 S rRNA序列获取通过PSI-BLAST在NCBI中搜索，获得双歧杆菌染色体编码的MazF；通过NCBI蛋白数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/）下载其他菌属染色体编码的6个MazF序列；而16 S rRNA序列下载自NCBI核酸数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/）。
1.3 统计学处理 分别应用Clustal X2和MEGA4软件进行多序列比对和进化图绘制。
2 结果
2.1 双歧杆菌染色体编码MazF情况 共搜索到双歧杆菌染色体编码毒素蛋白MazF 26个。其中，21个MazF编码基因存在于B. longum、B. breve染色体上，其余位于其他5种双歧杆菌染色体中，见表1。双歧杆菌中MazF蛋白序列由99～129个氨基酸构成，见图1。
2.2 MazF分子进化分析 通过Clustal X2对26个双歧杆菌染色体上的MazF蛋白分子进行多序列比对，结果如图1。选取来自6种双歧杆菌的代表性MazF蛋白序列和其他菌株MazF进化分析，并将结果与16 S rRNA分子进化分析结果相比较见图2。
3 讨论
TA系统通常由处在同一个操纵子中紧密连锁的两个基因组成；其中一个基因编码不稳定的抗毒素蛋白或RNA，另一个基因编码相对稳定的毒素蛋白。根据抗毒素的成分不同，通常将TA系统分为三类：Ⅰ类的抗毒素为反义mRNA，Ⅱ类的抗毒素基因编码抗毒素蛋白。前者可以抑制毒素蛋白mRNA的翻译，从而阻止毒素蛋白发挥作用；后者可以与毒素蛋白结合形成蛋白复合体，达到抑制毒素的作用。而III类TA系统中的抗毒素虽然也是RNA，但是其抑制毒素作用的机制与Ⅱ类不同，它是通过抗毒素与毒素蛋白形成RNA-蛋白质结构发挥毒素抑制作用[22]。 MazEF是最早于大肠埃希菌基因组中发现的Ⅱ类TA系统，由处于同一操纵子、紧密连锁的两个基因mazE和mazF编码。上述两个基因均编码小分子蛋白，其中mazE编码不稳定的抗毒素蛋白，mazF编码相对稳定的毒素蛋白[23]。一般情况下，MazE和MazF形成蛋白复合体，处于动态平衡状态，细菌正常生长。由于MazE没有MazF稳定，需要不断的合成MazE维持平衡状态，因此在某些情况下，如氨基酸饥饿、抗生素等不利刺激下，MazE被降解或合成受到抑制，其含量相对于MazF减少，从而引起细菌的死亡或生长抑制[24]。研究发现：MazEF参与氨基酸饥饿、高温和DNA损伤等恶劣环境下菌株的应激调控，在细菌压力调控过程中发挥重要作用[1，24]。
双歧杆菌MazF多序列比对分析虽然发现了双歧杆菌MazF的保守区域（黑色、灰色区域），然而整个双歧杆菌属基因组上的MazF保守性不好，仅个别菌种内的MazF具有较好的保守性，如B. breve基因组上的MazF保守性较好。进一步分子进化分析显示：MazF的聚类结果与相应菌种16 S RNA的聚类结果不一致，MazF与16 S RNA的共进化仅在个别菌种中发现，如B. breve和B. longum中的MazF。上述结果提示：双歧杆菌中的MazEF可能是通过基因的水平转移整合入基因组中，属于菌株的非核心基因组部分，具有较大的流动性。上述编码MazEF的双歧杆菌株可能具有某些不利环境下的生存优势。
参考文献
[1] Hazan R S B， Engelberg-Kulka H. Escherichia coli mazEF-mediated cell death is triggered by various stressful conditions[J].J Bacteriol，2004，186（11）：3663-3669.
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[11]夏扬潮，刘宁，罗宜辉.益生菌联合谷参肠安治疗腹泻型肠易激综合征的疗效观察[J].中国医学创新，2012，9（13）：109.
[12]白俊华.双歧杆菌口服联合腹部抚触治疗早产儿喂养不耐受[J].中国医学创新，2013，10（1）：114-115.
[13]周伟.双歧杆菌与婴幼儿健康[J].实用儿科临床杂志，2002，17（3）：72-73.
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[16]廖镇宇，黄瑞文，肖艾青.双歧杆菌三联活菌胶囊防治低出生体重早产儿喂养不耐受疗效观察[J].儿科药学杂志，2013，13（3）：72-73. [17]杨莲，张国梅.双歧杆菌三联活菌胶囊治疗早产儿喂养不耐受疗效观察[J].中外健康文摘，2011，8（45）：110-111.
[18]周建，方锦平，蒋璐瑶.双歧杆菌三联活菌散治疗晚期早产儿喂养不耐受的效果[J].中国乡村医药，2014，5（11）：56-57.
[19]陈红芳，周建.双歧杆菌三联活菌散在晚期早产儿喂养不耐受中应用[J].健康必读（中旬刊），2013，12（6）：89-90.
[20]王华，乔林霞，朱文英，等.早期口服双歧杆菌三联活菌散对早产儿喂养不耐受的影响[J].中国血液流变学杂志，2013，5（2）：21-23.
[21] Zhang Y X，Li J，Guo X K，et al.Characterization of a novel toxin-antitoxin module， VapBC， encoded by Leptospira interrogans chromosome[J].Cell Res，2004，14（3）：208-216.
[22] Fineran P C，Blower T R，Foulds I J，et al.The phage abortive infection system， ToxIN， functions as a protein-RNA toxin-antitoxin pair[J].Proc Natl Acad Sci USA，2009，106（3）：894-899.
[23] Engelberg-Kulka H，Hazan R，Amitai S.mazEF： a chromosomal toxin-antitoxin module that triggers programmed cell death in bacteria[J].J Cell Sci，2005，118（19）：4327-4332.
[24] Lemos J A，Brown T A J r，Abranches J，et al.Characteristics of Streptococcus mutans strains lacking the MazEF and RelBE toxin-antitoxin modules[J].FEMS Microbiol Lett，2005，253（2）：251-257.
（收稿日期：2014-07-28） （本文编辑：王宇）
【关键词】 MazEF； 毒素-抗毒素系统； 分子进化； 双歧杆菌
Ⅱ类毒素-抗毒素（TA）系统，最早在1982年于大肠埃希菌的低拷贝质粒中发现。其后发现，TA系统同样存在于细菌染色体上，也存在于一些外源DNA岛如噬菌体、转座子、超级内含子和质粒中，由于近年来发现其参与细菌的多种应激调控过程而被广泛关注[1]。生物信息学分析发现：多达750个细菌和古细菌的基因组中存在Ⅱ类TA系统；自生微生物的基因组中一般含有多个Ⅱ类TA系统编码基因，而在严格的胞内微生物基因组中未发现Ⅱ类TA系统编码基因；以上证据提示Ⅱ类TA系统对微生物的生存具有重要作用。主流观点认为：TA系统可能作为一个特殊的压力反应原件，在细菌对不利环境的应激调控过程中发挥重要作用[2-3]。根据TA系统中氨基酸序列的相似度，Ⅱ类TA中的毒素蛋白被分为9个家族，包括CcdB、RelE、MazF、ParE、Doc、VapC、ζ、HipA以及HigB[3]。根据毒素蛋白的分类，相应TA系统被分为9类。其中，MazEF是最早在大肠埃希菌基因组中发现、研究最为深入的Ⅱ类TA系统之一，参与细菌对营养饥饿、抗生素、高温、DNA损伤等应激反应调控[1，4]。
双歧杆菌（Bifidobacterium）是母乳喂养的婴儿肠道中的优势菌，具有对宿主多方面的益生作用，如拮抗肠道病原体、调节免疫、平衡肠道菌群等[5-20]。作为一种模式益生菌，双歧杆菌经常与其他乳酸菌一起用于益生菌制品的生产，在食品、医药、畜牧等领域应用广泛。作为益生菌使用的双歧杆菌在工业加工、储藏、运输以及进入宿主胃肠道的过程中会遭遇各种环境胁迫，如酸、热、氧气、营养匮乏和高渗透压等各种不利刺激。目前，已经有近40株双歧杆菌进行了全基因组测序，但是它们的基因组中是否存在MazEF、它们分子的进化关系如何、是否参与双歧杆菌对多种不利环境的应激调控均不清楚。由于构成TA系统的一对毒素蛋白（MazF）和抗毒素蛋白（MazE）处于共进化的状态，MazF的进化状态可以代表TA系统MazEF的进化状态[21]。因此，本研究通过对双歧杆菌MazF的进化分析间接研究MazEF的分子进化。作者在NCBI数据库中获得双歧杆菌编码的MazF，对其进行多序列比对；进一步将来自双歧杆菌属和其他菌属的毒素蛋白MazF和菌株16 S rRNA的进化分析结果进行比较，完成对双歧杆菌MazEF的分子进化分析。
1 资料与方法
1.1 一般资料 MazF蛋白和16 S rRNA序列菌株来源均下载自NCBI，包括B. longum，B. breve，B. stellenboschense，B.ruminantium， B. kashiwanohense， B. bifidum， Streptococcus mutans， Mycobacterium tuberculosis， Escherichia coli， Lactobacillus plantarum， Lactobacillus acidophilus和Lactobacillus johnsonii。
1.2 方法 MazF蛋白和16 S rRNA序列获取通过PSI-BLAST在NCBI中搜索，获得双歧杆菌染色体编码的MazF；通过NCBI蛋白数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/）下载其他菌属染色体编码的6个MazF序列；而16 S rRNA序列下载自NCBI核酸数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/）。
1.3 统计学处理 分别应用Clustal X2和MEGA4软件进行多序列比对和进化图绘制。
2 结果
2.1 双歧杆菌染色体编码MazF情况 共搜索到双歧杆菌染色体编码毒素蛋白MazF 26个。其中，21个MazF编码基因存在于B. longum、B. breve染色体上，其余位于其他5种双歧杆菌染色体中，见表1。双歧杆菌中MazF蛋白序列由99～129个氨基酸构成，见图1。
2.2 MazF分子进化分析 通过Clustal X2对26个双歧杆菌染色体上的MazF蛋白分子进行多序列比对，结果如图1。选取来自6种双歧杆菌的代表性MazF蛋白序列和其他菌株MazF进化分析，并将结果与16 S rRNA分子进化分析结果相比较见图2。
3 讨论
TA系统通常由处在同一个操纵子中紧密连锁的两个基因组成；其中一个基因编码不稳定的抗毒素蛋白或RNA，另一个基因编码相对稳定的毒素蛋白。根据抗毒素的成分不同，通常将TA系统分为三类：Ⅰ类的抗毒素为反义mRNA，Ⅱ类的抗毒素基因编码抗毒素蛋白。前者可以抑制毒素蛋白mRNA的翻译，从而阻止毒素蛋白发挥作用；后者可以与毒素蛋白结合形成蛋白复合体，达到抑制毒素的作用。而III类TA系统中的抗毒素虽然也是RNA，但是其抑制毒素作用的机制与Ⅱ类不同，它是通过抗毒素与毒素蛋白形成RNA-蛋白质结构发挥毒素抑制作用[22]。 MazEF是最早于大肠埃希菌基因组中发现的Ⅱ类TA系统，由处于同一操纵子、紧密连锁的两个基因mazE和mazF编码。上述两个基因均编码小分子蛋白，其中mazE编码不稳定的抗毒素蛋白，mazF编码相对稳定的毒素蛋白[23]。一般情况下，MazE和MazF形成蛋白复合体，处于动态平衡状态，细菌正常生长。由于MazE没有MazF稳定，需要不断的合成MazE维持平衡状态，因此在某些情况下，如氨基酸饥饿、抗生素等不利刺激下，MazE被降解或合成受到抑制，其含量相对于MazF减少，从而引起细菌的死亡或生长抑制[24]。研究发现：MazEF参与氨基酸饥饿、高温和DNA损伤等恶劣环境下菌株的应激调控，在细菌压力调控过程中发挥重要作用[1，24]。
双歧杆菌MazF多序列比对分析虽然发现了双歧杆菌MazF的保守区域（黑色、灰色区域），然而整个双歧杆菌属基因组上的MazF保守性不好，仅个别菌种内的MazF具有较好的保守性，如B. breve基因组上的MazF保守性较好。进一步分子进化分析显示：MazF的聚类结果与相应菌种16 S RNA的聚类结果不一致，MazF与16 S RNA的共进化仅在个别菌种中发现，如B. breve和B. longum中的MazF。上述结果提示：双歧杆菌中的MazEF可能是通过基因的水平转移整合入基因组中，属于菌株的非核心基因组部分，具有较大的流动性。上述编码MazEF的双歧杆菌株可能具有某些不利环境下的生存优势。
参考文献
[1] Hazan R S B， Engelberg-Kulka H. Escherichia coli mazEF-mediated cell death is triggered by various stressful conditions[J].J Bacteriol，2004，186（11）：3663-3669.
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[19]陈红芳，周建.双歧杆菌三联活菌散在晚期早产儿喂养不耐受中应用[J].健康必读（中旬刊），2013，12（6）：89-90.
[20]王华，乔林霞，朱文英，等.早期口服双歧杆菌三联活菌散对早产儿喂养不耐受的影响[J].中国血液流变学杂志，2013，5（2）：21-23.
[21] Zhang Y X，Li J，Guo X K，et al.Characterization of a novel toxin-antitoxin module， VapBC， encoded by Leptospira interrogans chromosome[J].Cell Res，2004，14（3）：208-216.
[22] Fineran P C，Blower T R，Foulds I J，et al.The phage abortive infection system， ToxIN， functions as a protein-RNA toxin-antitoxin pair[J].Proc Natl Acad Sci USA，2009，106（3）：894-899.
[23] Engelberg-Kulka H，Hazan R，Amitai S.mazEF： a chromosomal toxin-antitoxin module that triggers programmed cell death in bacteria[J].J Cell Sci，2005，118（19）：4327-4332.
[24] Lemos J A，Brown T A J r，Abranches J，et al.Characteristics of Streptococcus mutans strains lacking the MazEF and RelBE toxin-antitoxin modules[J].FEMS Microbiol Lett，2005，253（2）：251-257.
（收稿日期：2014-07-28） （本文编辑：王宇）