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【摘 要】 目的：通过比较龙眼不同提取物的神经保护作用，探讨龙眼各部位的药效价值。方法：以H2O2诱导细胞损伤，以龙眼不同部位（肉、壳、核）提取物和龙眼肉不同极性（水、正丁醇、乙酸乙酯）提取物进行干预，倒置显微镜观察细胞形态，MTT法检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞凋亡。结果：正常组细胞贴壁良好，轴突明显，易成簇生长；模型组细胞形态不规整，突起肿胀破裂，有脱壁漂浮现象；给药组细胞形态趋于正常，结构较完整。龙眼不同部位中以龙眼肉提取物促进增殖最明显；龙眼肉不同极性提取物中，以乙酸乙酯提取物促进增殖最显著，其对细胞中晚期凋亡及坏死有明显抑制作用。结论：龙眼提取物具有神经保护作用，抑制细胞中晚期凋亡与坏死是其可能的神经保护作用机制。
【关键词】 龙眼；不同部位；不同极性；增殖；凋亡
【中图分类号】R-33 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2018）02-0048-04
Abstract：Objective The neuroprotective effects of different extracts from longan were studied to explore the pharmacodynamics of various parts of longan. Methods PC12 cells were induced by H2O2， the different parts of longan （longan meat， shell， nuclear） and longan meat with different polar solvents （water， n-butanol， ethyl acetate） extract were acting on the injured PC12 cells， the morphology of the cells was observed by inverted microscope， MTT assay was used to detect cell proliferation， flow cytometry was used to detect apoptosis. Results Normal cells adhere to a good， axillary obvious， easy clusters of growth； The cell morphology of H2O2 injury is irregular， the proliferation is slow， the swelling and rupture of the protrusion， The morphology of each group was normal， with protrusions and more complete structure. Longan different parts of the longan meat to promote the most obvious proliferation； Longan meat in different polar extracts， with ethyl acetate extract to promote the most significant proliferationm and it on cells in the late apoptosis and necrosis were significantly inhibited. Conclusion Longan extract has neuroprotective effect， inhibit the cell apoptosis and necrosis is the possible neuroprotective mechanism.
Keywords：Longan； Different parts； Different polarity； Proliferation； Apoptosis
龍眼俗名桂圆，其假种皮龙眼肉具有补益心脾、养血安神[1]等功效，并有改善记忆[2]、抗氧化[3]等作用。目前龙眼中仅龙眼肉作为药用部位，对龙眼壳、核等并无有效的开发利用。据报道，龙眼壳、核具有抗氧化、抗肿瘤[4-7]等作用，实验者认为其大量废弃不仅给炮制加工带来不便，同时造成了资源的浪费与环境的污染。本研究拟通过探讨龙眼不同提取物的神经保护作用，为龙眼的炮制加工及扩大应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂 龙眼购自大连金鸿润食品发展有限公司，经王添敏副教授鉴定为无患子科植物龙眼（Dimocarpus longan Lour.）的干燥成熟果实；PC12细胞（高分化），辽宁中医药大学药理实验室提供；DMEM高糖培养基（Gibco）；胰蛋白酶、双抗、Annexin V-FITC/PI双染试剂盒均购自Genview；NU-4750型二氧化碳培养箱（Nuaire）。
1.2 方法
1.2.1 龙眼不同部位的制备 干燥龙眼，分离肉、壳、核，分别称重、粉碎，各取100.00 g，按1∶12（m[KG*9]∶v）加入去离子水微沸提取1 h，提取3次，合并滤液，60℃减压浓缩成浸膏，即得龙眼肉、龙眼壳、龙眼核提取物，以下简称龙眼肉、壳、核。
1.2.2 龙眼肉不同极性提取物的制备 精密称取龙眼肉100.00 g，同上煎煮，向滤液中加入乙酸乙酯反复萃取至上层液体无色，收集合并上层溶液，得乙酸乙酯提取物；下层加入正丁醇反复萃取至上层无色，收集上、下层溶液，分别得正丁醇提取物和水提取物。60 ℃减压浓缩成浸膏。
1.2.3 MTT法检测细胞存活 取对数生长期的PC12细胞，以105/mL接种于96孔板， 待细胞贴壁后，随机分为正常组、模型组和给药组，每组3个复孔。除正常组外，各组细胞用200 μM H2O2处理12 h，给药组于造模12 h后加入不同浓度的受试药物（最小浓度分别是各提取物的最低有效浓度）。继续培养12 h后，采用MTT法于酶标仪490 nm处测定各孔吸光度（A）值，计算细胞存活率，实验平行重复3次。 1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡 取生长状态良好的PC12细胞，铺于6 cm培养皿中，随机分为正常组、模型组和龙眼肉组（乙酸乙酯提取物1.6 mg/mL）。除正常组外，其余各组加入200 μM H2O2孵育12h，龙眼肉组于造模前加药预处理2 h，流式细胞仪检测细胞凋亡，每组3个复孔。
1.2.5 统计学分析 采用SPSS 13.0统计软件进行统计。组间比较采用单因素方差分析和t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 龙眼不同部位对细胞增殖的影响 显微镜观察可见，正常组细胞贴壁良好，轴突明显；模型组细胞形态不规整，突起肿胀破裂，有脱壁漂浮现象；给药组细胞形态趋于正常，突起损伤减轻，结构较完整。各组代表性图片如图1A所示。MTT检测结果表明，细胞存活率模型组较正常组下降；龙眼肉、壳、核组较模型组升高（P<0.05，P<0.01，图2B-D），三者平均细胞存活率无统计学差异（P>0.05），但浓度相差悬殊（图2E）。综合评价，笔者认为龙眼肉提取物的神经保护作用最强。
2.2 龙眼肉不同极性提取物对细胞增殖的影响 不同极性提取物均有神经保护作用（图2A-C）；相同浓度下，乙酸乙酯提取物促进增殖最明显（图2D）。如图2所示。
2.3 龙眼肉乙酸乙酯提取物对细胞凋亡的影响 模型组较正常组活细胞数减少，凋亡及坏死细胞数增加（P<0.05，P<0.01，图3D-G）；龙眼肉组即龙眼肉乙酸乙酯提取物较模型组活细胞数增加，中晚期凋亡及坏死细胞减少（P<0.05，图3D、F、G），早期凋亡细胞无统计学差异（P>0.05），但有降低趋势（图3E）。如图3所示，
3 讨论
本论研究用H2O2诱导细胞损伤，并采用龙眼提取物进行预处理或治疗，结果表明，龙眼肉、壳、核提取物，均能提高受损细胞存活率，且以龙眼肉用量最小，龙眼壳促进增殖作用最显著。综合考虑三者的量效差异，认为龙眼肉作用效果最好；同时，龙眼中壳、核所占比重不小，二者有很强的作用，如果一并入药，可减少炮制加工，并扩大了龙眼的药用来源。另外，根据细胞凋亡检测结果推测，抑制中晚期细胞凋亡与坏死是龙眼神经保护作用的可能机制，值得进一步深入研究。
参考文献
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京：中国医药科技出版社， 2015.
[2]白亚娟， 刘磊， 张瑞芬， 等. 龙眼果肉提取物改善东莨菪碱诱导小鼠學习记忆功能[J]. 中国农业科学， 2016， 49（21）： 4203-4213.
[3]林耀盛， 张名位， 张瑞芬， 等. 不同品种龙眼果肉酚类物质的抗氧化活性比较[J]. 食品科学技术学报， 2016， 34（3）： 20-30.
[4]宋佳玉， 张清伟， 刘金宝， 等. 龙眼壳粗黄酮提取物体内外抗肿瘤研究[J]. 食品研究与开发， 2016， 37（3）： 40-43.
[5]刘焕云， 王海燕， 梁燕. 龙眼壳黄酮的微波提取及体外抗氧化活性研究[J]. 天然产物研究与开发， 2015， 27（3）： 434-441.
[6]郭倩倩， 张晓卫， 周暄宣， 等. 龙眼的化学成分与药理活性研究[J]. 现代生物医学进展， 2011， 11（23）： 4552-4555.
[7]周凯， 胡卓炎， 周沫霖， 等. 龙眼核提取物的体外抗氧化及抑菌活性研究[J]. 食品与机械， 2015 （4）： 167-171.
[8]胡爽， 滕利荣， 张峻榕， 等. 一种新型化合物的合成及对 PC12 高分化细胞的神经保护作用[J]. 高等学校化学学报， 2015， 36（11）： 2322-2328.
【关键词】 龙眼；不同部位；不同极性；增殖；凋亡
【中图分类号】R-33 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2018）02-0048-04
Abstract：Objective The neuroprotective effects of different extracts from longan were studied to explore the pharmacodynamics of various parts of longan. Methods PC12 cells were induced by H2O2， the different parts of longan （longan meat， shell， nuclear） and longan meat with different polar solvents （water， n-butanol， ethyl acetate） extract were acting on the injured PC12 cells， the morphology of the cells was observed by inverted microscope， MTT assay was used to detect cell proliferation， flow cytometry was used to detect apoptosis. Results Normal cells adhere to a good， axillary obvious， easy clusters of growth； The cell morphology of H2O2 injury is irregular， the proliferation is slow， the swelling and rupture of the protrusion， The morphology of each group was normal， with protrusions and more complete structure. Longan different parts of the longan meat to promote the most obvious proliferation； Longan meat in different polar extracts， with ethyl acetate extract to promote the most significant proliferationm and it on cells in the late apoptosis and necrosis were significantly inhibited. Conclusion Longan extract has neuroprotective effect， inhibit the cell apoptosis and necrosis is the possible neuroprotective mechanism.
Keywords：Longan； Different parts； Different polarity； Proliferation； Apoptosis
龍眼俗名桂圆，其假种皮龙眼肉具有补益心脾、养血安神[1]等功效，并有改善记忆[2]、抗氧化[3]等作用。目前龙眼中仅龙眼肉作为药用部位，对龙眼壳、核等并无有效的开发利用。据报道，龙眼壳、核具有抗氧化、抗肿瘤[4-7]等作用，实验者认为其大量废弃不仅给炮制加工带来不便，同时造成了资源的浪费与环境的污染。本研究拟通过探讨龙眼不同提取物的神经保护作用，为龙眼的炮制加工及扩大应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂 龙眼购自大连金鸿润食品发展有限公司，经王添敏副教授鉴定为无患子科植物龙眼（Dimocarpus longan Lour.）的干燥成熟果实；PC12细胞（高分化），辽宁中医药大学药理实验室提供；DMEM高糖培养基（Gibco）；胰蛋白酶、双抗、Annexin V-FITC/PI双染试剂盒均购自Genview；NU-4750型二氧化碳培养箱（Nuaire）。
1.2 方法
1.2.1 龙眼不同部位的制备 干燥龙眼，分离肉、壳、核，分别称重、粉碎，各取100.00 g，按1∶12（m[KG*9]∶v）加入去离子水微沸提取1 h，提取3次，合并滤液，60℃减压浓缩成浸膏，即得龙眼肉、龙眼壳、龙眼核提取物，以下简称龙眼肉、壳、核。
1.2.2 龙眼肉不同极性提取物的制备 精密称取龙眼肉100.00 g，同上煎煮，向滤液中加入乙酸乙酯反复萃取至上层液体无色，收集合并上层溶液，得乙酸乙酯提取物；下层加入正丁醇反复萃取至上层无色，收集上、下层溶液，分别得正丁醇提取物和水提取物。60 ℃减压浓缩成浸膏。
1.2.3 MTT法检测细胞存活 取对数生长期的PC12细胞，以105/mL接种于96孔板， 待细胞贴壁后，随机分为正常组、模型组和给药组，每组3个复孔。除正常组外，各组细胞用200 μM H2O2处理12 h，给药组于造模12 h后加入不同浓度的受试药物（最小浓度分别是各提取物的最低有效浓度）。继续培养12 h后，采用MTT法于酶标仪490 nm处测定各孔吸光度（A）值，计算细胞存活率，实验平行重复3次。 1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡 取生长状态良好的PC12细胞，铺于6 cm培养皿中，随机分为正常组、模型组和龙眼肉组（乙酸乙酯提取物1.6 mg/mL）。除正常组外，其余各组加入200 μM H2O2孵育12h，龙眼肉组于造模前加药预处理2 h，流式细胞仪检测细胞凋亡，每组3个复孔。
1.2.5 统计学分析 采用SPSS 13.0统计软件进行统计。组间比较采用单因素方差分析和t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 龙眼不同部位对细胞增殖的影响 显微镜观察可见，正常组细胞贴壁良好，轴突明显；模型组细胞形态不规整，突起肿胀破裂，有脱壁漂浮现象；给药组细胞形态趋于正常，突起损伤减轻，结构较完整。各组代表性图片如图1A所示。MTT检测结果表明，细胞存活率模型组较正常组下降；龙眼肉、壳、核组较模型组升高（P<0.05，P<0.01，图2B-D），三者平均细胞存活率无统计学差异（P>0.05），但浓度相差悬殊（图2E）。综合评价，笔者认为龙眼肉提取物的神经保护作用最强。
2.2 龙眼肉不同极性提取物对细胞增殖的影响 不同极性提取物均有神经保护作用（图2A-C）；相同浓度下，乙酸乙酯提取物促进增殖最明显（图2D）。如图2所示。
2.3 龙眼肉乙酸乙酯提取物对细胞凋亡的影响 模型组较正常组活细胞数减少，凋亡及坏死细胞数增加（P<0.05，P<0.01，图3D-G）；龙眼肉组即龙眼肉乙酸乙酯提取物较模型组活细胞数增加，中晚期凋亡及坏死细胞减少（P<0.05，图3D、F、G），早期凋亡细胞无统计学差异（P>0.05），但有降低趋势（图3E）。如图3所示，
3 讨论
本论研究用H2O2诱导细胞损伤，并采用龙眼提取物进行预处理或治疗，结果表明，龙眼肉、壳、核提取物，均能提高受损细胞存活率，且以龙眼肉用量最小，龙眼壳促进增殖作用最显著。综合考虑三者的量效差异，认为龙眼肉作用效果最好；同时，龙眼中壳、核所占比重不小，二者有很强的作用，如果一并入药，可减少炮制加工，并扩大了龙眼的药用来源。另外，根据细胞凋亡检测结果推测，抑制中晚期细胞凋亡与坏死是龙眼神经保护作用的可能机制，值得进一步深入研究。
参考文献
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