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摘 要 希金斯刺盘孢（Colletotrichum higginsianum Sacc.）是一种世界性分布的重要植物病原真菌，可引起严重的十字花科植物炭疽病，影响作物品质并造成严重的经济损失。效应分子在植物病原真菌侵染寄主植物过程中发挥着重要的作用。根据已公布的希金斯刺盘孢的全基因组信息，以其全基因组蛋白序列为材料，通过生物信息学方法，对其候选效应分子及其功能进行了预测和分析。首先利用SignalP、TMHMM、Protcomp、big-PI Predictor 和TargetP程序依次预测出其分泌类型的蛋白，再通过其序列大小和半胱氨酸含量作进一步筛选，最后利用blastp工具与非冗余蛋白质数据库进行比对，找出数据库中没有蛋白同源性的序列，从而获得候选效应分子；同时对希金斯刺盘孢全基因组的16 150个蛋白序列进行分析，最终预测到135个符合条件的候选效应分子，而大多数都是功能未知的假定蛋白。本研究采用生物信息学分析方法预测出了希金斯刺盘孢的候选效应分子，为进一步研究这些效应分子的功能奠定了基础，其研究技术和手段也为其它真菌效应分子的预测提供了重要的参考资料。
关键词 希金斯刺盘孢；效应分子；信号肽；十字花科植物炭疽病；生物信息学
中图分类号 S436.34 文献标识码 A
Abstract Colletotrichum higginsianum Sacc. is one of the important phytopathogenic fungi worldwide， and often causes severe anthracnose disease on a wide range of cruciferous plants， which influences the quality of infected crops and causes serious economic losses. The effectors of phytopathogenic fungi play an important role during the infection process of fungal pathogens on their host plants. In this study， the candidate effectors and their functions were predicted and analyzed by using bioinformatic methods based on the published full-length genome sequence of C. higginsianum and on the derived protein sequences of C. higginsianum. Firstly，all secreted proteins were predicted with SignalP， TMHMM， Protcomp， big-PI Predictor and TargetP programs. And then， a further screening through the sequence size and the cysteine content of predicted proteins was carried out. Finally， the candidate effectors were aligned with the non-redundant protein database using blastp tools， and those sequences without protein homology in the database were identified so as to obtain the candidate effectors. As a result， 135 candidate effectors of C. higginsianum were predicted by analyzing 16 150 protein sequences of C. higginsianum， and most of them are the hypothetical proteins with unknown function. Taken together， the candidate effectors of C. higginsianum were predicted by using bioinformatic methods， which lay a foundation for the further study of the functions of these effectors， and the results can also provide reference for the prediction of other fungal effectors.
Key words Colletotrichum higginsianum； Effectors； Signal peptide； Crucifer anthracnose； Bioinformatics
刺盘孢属（Colletotrichum），俗称炭疽菌属，是一类世界性分布的、十分重要的植物病原真菌，其寄主范围非常广泛，能引起农作物、果树、蔬菜和林木等众多的植物炭疽病，给农林业生产造成严重危害，在热带、亚热带地区尤为严重[1-2]。其中的希金斯刺盘孢（C. higginsianum Sacc.），俗称十字花科炭疽菌，可引起严重的十字花科植物炭疽病[3]。
植物在与病原菌相互作用过程中，病原菌分泌效应分子到寄主植物细胞中，对寄主植物细胞的生理、生化过程及细胞代谢等产生显著的影响，并克服寄主植物的防卫反应，从而促进和完成对寄主植物的侵染[4]。效应分子一般具有以下特征[5-7]：（1）含有N-端信号肽；（2）无跨膜结构域；（3）无糖基磷脂酰肌醇锚定位点；（4）没有将蛋白输送至线粒体或其它胞内细胞器的预测定位信号；（5）氨基酸残基数量大约在50～300氨基酸；（6）富含半胱氨酸而且特异性高。关于病原菌效应分子的研究，目前已通过图位克隆分离克隆得到许多植物病原效应蛋白基因，并结合异源表达分析及结构生物物理手段对部分效应蛋白基因表达产物的功能进行了鉴定[8-10]。 迄今为止，国内外从细胞和分子水平上研究希金斯刺盘孢对十字花科植物致病机制的有关研究报道较少。其中多数研究是以拟南芥作为寄主植物进行研究的，因为其全基因组序列已经公布，并获得了大量的人工突变体，而希金斯刺盘孢（C. higginsianum）具有特别的营养方式的转变，且可进行遗传转化[11-12]。此外，构建由根癌农杆菌介导的希金斯刺盘孢T-DNA插入突变体库，通过将突变体的分生孢子接种到离体和活体的拟南芥叶片进行实验，从而揭示了希金斯刺盘孢与拟南芥互作的分子机制[13-14]。希金斯刺盘孢-拟南芥的互作系统已成为病原菌与寄主植物分子互作研究的一个典型模式[15]。最近对希金斯刺盘孢的序列和转录组分析显示，该病原菌的大多数候选效应分子具有种的特异性，而且通过对其侵染过程中的效应分子分析表明，大多数的效应分子是在其活体寄生的阶段被诱导的[16-17]。因此，以十字花科蔬菜-菜心（Brassica parachinensis Bailey）[18-19]作为希金斯刺盘孢的寄主植物材料，将更有利于分析该病原菌与十字花科蔬菜之间互作的本质及其致病的分子机制。本研究根据已公布的希金斯刺盘孢全基因组信息，通过生物信息学方法，对其中的候选效应分子及其功能进行了初步预测和分析，以期为下一步的希金斯刺盘孢效应分子的筛选及其功能研究并为阐明这些效应分子在致病过程中的作用提供重要的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
来自希金斯刺盘孢（C. higginsianum）基因组和转录组数据库（http：//www.broad-institute.org/annotation/genome/colletotrichum_group/MultiDownloads.html）中的该病菌全基因组的16 150条蛋白质的氨基酸序列。
1.2 方法
1.2.1 SignalP 4.1 Server SignalP 4.1 Server[20]（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）是信号肽预测的服务器，它的功能是预测给定的氨基酸序列中是否存在潜在的信号肽剪切位点及其所在位置，原核生物和真核生物都可以进行预测。目前服务器提供的是SignalP 4.1版本。以SignalP 4.1分析获得预测蛋白的 C、S 和 Y的最大值，以及位于N 端和被预测的剪切位点间的 S曲线的中间值，以此区分信号肽和非信号肽。而信号肽剪切位点则位于预测的含有信号肽蛋白的Y曲线的最大值处。本实验中使用默认设置。
1.2.2 TMHMM Server v. 2.0 TMHMM Server v. 2.0[21]（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）主要用于预测蛋白的跨膜结构域。
1.2.3 ProtComp v. 9.0 ProtComp v. 9.0[22]（http：//linux1.softberry.com/berry.phtml？topic=protcompa-n&group=programs& subgroup=proloc）主要是对动物或真菌中的蛋白的亚细胞定位进行预测，它可将蛋白按以下归属进行划分：细胞核、质膜、胞外分泌、细胞质、线粒体、内质网、过氧物酶体、溶酶体和高尔基体。
1.2.4 Big-PI Predictor Big-PI Predictor（http：//mendel.imp.ac.at/gpi/fungi_server.html）对在真菌GPI（糖基磷脂酰肌醇）修饰位点进行预测，判断预测蛋白是否有脂质锚定修饰。如果存在糖基磷脂酰肌醇脂质锚定修饰，真核生物中蛋白质需要在内质网中。
1.2.5 TargetP 1.1 Server TargetP 1.1 Server[23]（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）用于进一步确定预测蛋白的亚细胞定位，可将蛋白的定位归属于线粒体、叶绿体、胞外分泌以及其它亚细胞定位。位置分配是基于任何的N-末端的前序列预测存在：叶绿体转运肽（CTP），线粒体靶向肽（MTP）或分泌途径的信号肽（SP）。
1.2.6 CalMolWt CalMolWt（http：//www.cnhupo.cn/CalMW/MYMW.asp）蛋白质分子量、氨基酸组成的计算器。用于分析筛选出的序列的半胱氨酸含量。
1.2.7 LipoP 1.0 Server LipoP 1.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/LipoP）用来预测脂蛋白，也用来区分脂蛋白信号肽、其他信号肽和格兰氏阴性菌N端膜螺旋。
1.2.8 BLASTP BLASTP（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch &LINK_LOC=blasthome）是使用蛋白序列到蛋白数据库中查询的一种工具。每条所查序列能与数据库中已存在的每条已知序列进行序列比对，可以通过所得结果结合参数得到与此相关的信息。
2 结果与分析
2.1 希金斯刺盘孢效应分子全基因组预测
在希金斯刺盘孢（C. higginsianum）基因组和转录组数据库中下载全基因组序列，其中含有16 150条氨基酸序列，其基因组分析见表1。
SignalP v4.1 是用于预测原核及真核生物氨基酸序列中信号肽切割位点是否存在及其存在的具体位置，该软件综合了人工神经网络（Artificial Neural Networks）算法和隐马可夫模型（Hidden Markov Models）的功能[24]。根据上述的效应分子的6个特征，使用SignalP 4.1 Server对16 150个蛋白序列进行分析，预测得到有1 528个编码含N端信号肽的蛋白，占全基因组蛋白序列的9.46%；对所得的结果分析发现，长度小于450 aa的序列最多，占了全部的77.20%（图1）。 在含有信号肽的分泌型蛋白质序列中，如果含有跨膜区则表明该蛋白可能为膜受体，也可能是膜上的锚定蛋白或者离子通道蛋白。本研究使用TMHMM Server v. 2.0来预测蛋白序列的跨膜螺旋结构，排除具有跨膜结构域的蛋白序列。从蛋白跨膜结构域分析结果可以看到，在含信号肽的1 528个蛋白中，有89个蛋白序列含有两个或多个跨膜域，174个蛋白序列只含有1个跨膜域，而有1 265个蛋白序列则不含跨膜域。只含1个跨膜域的蛋白质，其所具有的跨膜结构域位置均位于N端，该区域可能为前期所预测的信号肽序列，而且服务器并不能完全对信号肽序列和所属跨膜域区序列进行区分。因此，本研究选择不含跨膜域和只含有1个跨膜域的1 439个蛋白序列进行下一步研究。
将上述初步筛选出的1 439个蛋白序列进一步用ProtComp v. 9.0进行分析，预测到共有782个信号肽分泌至胞外，17个转运至细胞核，177个转运至细胞质膜，88个转运至细胞质，207个转运至线粒体，55个转运至内质网，19个转运至过氧化物酶体，69个传输至溶酶体，20个转运至高尔基体，5个转运至液泡（图2）。继而进行GPI锚定蛋白的预测，以判断这些被初步推断为分泌蛋白是否为胞外蛋白。将782个分泌蛋白用big-PI Predictor 程序进行分析，发现有46个为GPI锚定蛋白，而736个为非GPI锚定蛋白。由于在真核细胞中，分泌蛋白的分泌目标有可能是胞内细胞器，而非胞外。因而需要进一步用 TargetP v1.1以排除非胞外分泌蛋白。对736个非GPI锚定的分泌蛋白的分析结果发现，其中有11个含有线粒体定位信号，2个含有其它定位信号，剩下723个蛋白序列都含有胞外定位信号。
由于效应分子的氨基酸残基数量一般在50～300 aa之间[25-26]，因此将这723个序列按照其长度进行排列，明确了其中有457个蛋白的氨基酸残基数量在50～300 aa之间。此外，根据效应分子富含半胱氨酸的特点，利用CalMolWt 计算所有候选序列的半胱氨酸含量。将不含半胱氨酸的序列排除之后，得到418个半胱氨酸残基含量在1～27数量不等的蛋白序列。最后，将上述符合条件的氨基酸序列在NCBI数据库中利用blastp工具与非冗余蛋白质数据库进行比对，找出那些与数据库中的没有同源性的序列，要求其E-value值小于1e-5。最终得到135个符合上述所有6个条件的候选效应分子，其中有30个蛋白序列在数据库了没有任何与之同源的序列，剩余的105个除了与刺盘孢属（Colletotrichum）的序列有同源性外，与其他物种都没有同源性。
2.2 希金斯刺盘孢候选效应分子信号肽特征分析
现已明确大多数物种的信号肽主要是通过 4 种类型的信号肽酶识别位点被信号肽酶所识别并被切割，从而使成熟蛋白穿过膜转运到细胞不同的部位[27]。本研究通过对135个候选效应分子所含的信号肽氨基酸长度进行分析，结果显示，含有信号肽长度为17～22 aa的蛋白质序列数量最多，所占比例为82.22%，其中尤以所含信号肽长度为19 aa的蛋白序列居多，所占比例为18.52%（图3）。
利用LipoP 1.0 Server对上述分泌蛋白进行信号肽酶识别位点的预测分析，结果显示119个蛋白序列含有SpI型信号肽识别位点，14个含有CYT型信号肽识别位点以及2个含有SpII型信号肽识别位点，所占比例分别为88.15%、10.37%和1.48%，说明希金斯刺盘孢中的候选效应分子大部分是由SpI型信号肽酶进行识别。
此外还对20种氨基酸在135个候选效应分子信号肽中出现的频率进行了分析（图4），结果表明，在组成信号肽的氨基酸中，丙氨酸（A）的数量为579，数量最多，占21.64%；其次为亮氨酸（L），486个，占全部的18.16%；其他的依次为丝氨酸（S）、 缬氨酸（V）、 苯丙氨酸（F）、 苏氨酸（T）、 蛋氨酸（M）、 异亮氨酸（I）、 甘氨酸（G）、 脯氨酸（P）、 精氨酸（R）、 谷氨酰胺（Q）、 赖氨酸（K）、 酪氨酸（Y）、 半胱氨酸（C）、 组氨酸（H）、 天冬酰胺（N）、 谷氨酸（E）、 色氨酸（W）和天冬氨酸（D），分别占9.34%、8.30%、7.14%、6.99%、5.49%、5.23%、2.99%、2.80%、2.50%、2.32%、1.94%、1.08%、1.05%、0.90%、0.82%、0.64%、0.45%和0.22%。统计分析发现，非极性、疏水的氨基酸出现频率最高（A、V、L、G、I和P），占59.12%；其次为有极性、不带电荷的氨基酸（S、T、C、M、N和Q），占26.01%；带负电荷的酸性氨基酸（A和E）占22.27%；带正电荷的碱性氨基酸（K、R和H）占5.34%；芳香族氨基酸（W、F和Y）占8.67%。
使用MEME[28]对希金斯刺盘孢候选效应分子信号肽序列进行基序（motif）分析，发现存在一种氨基酸组成模式为M[KR]FSTL[LA]L[AL][LA]的基序（图5）；对所有分泌蛋白进行基序分析发现，除了位于信号肽中的基序外，还存在另外2种基序，分别为P[GQ][LR][KR]E [SY][FR][CR]R和[HP][CQ][LS][RS] W [DG][LW]。
2.3 希金斯刺盘孢候选效应分子的功能分析
对预测获得的135个希金斯刺盘孢候选效应分子与GenBank的非冗余蛋白质数据库Nr和SWISS-PROT的uniprot_sprot数据库进行比对，以获得蛋白的参考功能信息。对比发现，11个效应分子具有预测功能（表2），其余124个效应分子皆为功能未知的假定蛋白。从表2中可以看出，大部分候选效应分子都为有预测功能的假定蛋白，但这些所列出的功能对于维持细胞正常生命活动都具有重要作用。然而，这些功能描述的仅仅是预测的结果，它们的真实性还有待通过有关实验作进一步的验证。此外，大多数预测出的希金斯刺盘孢候选效应分子均为功能未知的假定蛋白，也正是由于其具有特异性而形成的（正如效应蛋白的其中一个特征所示：富含半胱氨酸而且特异性高）。 3 讨论与结论
希金斯刺盘孢全基因组测序的完成和公布，为希金斯刺盘孢的分泌蛋白、致病因子和与植物之间互作的研究提供了重要的数据基础。本研究预测得到135个符合要求的希金斯刺盘孢候选效应分子，大多属于小型蛋白，其信号肽集中在17～22 aa且含有SpI型信号肽识别位点。对于希金斯刺盘孢候选效应分子功能的初步分析发现，预测出的92%候选效应分子为功能未知的假定蛋白。而且，其中大概有30%的希金斯刺盘孢的蛋白与禾生刺盘孢（C. graminicola，俗称禾谷炭疽病菌）的蛋白同源。一方面，说明了候选蛋白具有特异性，其未知功能需要进一步验证分析；另一方面，也可以为研究禾生刺盘孢的效应分子以及其它刺盘孢的效应分子的共性提供一个思路。此外，目前已发现在卵菌和真菌中含有RxLx、LxAR（x，代表任何氨基酸）等保守基序[25，29]。本研究试图通过对希金斯刺盘孢候选效应分子的基序进行研究，但无法找到上述类似的基序。虽然目前已有不少物种开展了效应分子的研究，但都没发现类似的基序。在刺盘孢属真菌里是否存在像卵菌一样有规律的保守基序，还需要通过实验研究才能够得出相应的结论。
本研究通过生物信息学手段，对希金斯刺盘孢候选效应分子进行了预测。与此同时，本研究也参考了前人利用生物信息学分析软件对粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）[30]、禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）[31]、稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）[32]、大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）[33]和米曲霉（Aspergillus oryzae）[34]等进行了蛋白类型的预测，根据真菌效应分子的特点，选择合适合理的预测服务器和相关软件进行分析，保证了预测结果的可靠性，但同时也可能在一定程度上漏掉一部分效应分子，特别是那些不符合效应分子特征但具有效应分子功能的蛋白[17，35]。因此，需要对预测的结果进行实验验证。本研究已将部分候选效应分子克隆出来，并进行了功能筛选，证明了预测结果的准确性（另文发表），为进一步研究希金斯刺盘孢效应分子的功能打下了基础。
Kleemann等[17]对希金斯刺盘孢进行了基因组和转录组分析，得到了较多具有酶和效应分子等功能的蛋白质，其中从不同细胞类型和侵染阶段相关的真菌转录组测序生成的表达序列标签（ESTs）中得到327个候选效应分子，但其中含有部分不含信号肽、不含半胱氨酸和没有特异性的蛋白。而O'Connell等[16]在UniProt数据库中，将希金斯刺盘孢测序得到的序列通过与刺盘孢属（Colletotrichum）之外的没有同源性的序列进行BLAST，从而得到365个候选效应分子，其中72%的候选效应分子是物种特异性的，与禾生刺盘孢（C. graminicola）的效应分子缺乏同源性。而本研究没有直接从ESTs或直接利用BLAST进行预测，而是试图先得到分泌蛋白，再进行同源比对而得到候选效应分子。根据真菌效应分子的特征，通过一个规范的流程得到的候选效应分子，更有利于对其进行共性的分析，也为其他真菌效应分子的预测提供参考。
随着更多的植物病原真菌全基因组序列的公布，将为进一步利用生物信息学手段和方法对这些病原真菌的效应分子进行分析提供了条件。如禾生刺盘孢（C. graminicola）已最终预测明确286个具有典型特征的效应分子[36]，而杨生褐盘二孢菌（Marsonina brunnea）最终预测得到106个候选效应因子[26]，稻瘟病菌（M. oryzae）通过候选基因进行表达分析和同源比对最终发现有42个符合条件的分泌蛋白基因[37]等。同时，基因组测序加快了功能基因的研究速度，可以根据某个基因的序列来推测其相应功能进而进行功能验证，这样就可以批量地研究生物基因的功能。当获得了预测得到的候选效应分子后，需通过原核表达及PCD（programmed cell death，细胞程序性死亡）检测才可以验证候选效应分子是否为效应分子，从而更好地研究其功能及其与寄主植物之间的相互作用。
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关键词 希金斯刺盘孢；效应分子；信号肽；十字花科植物炭疽病；生物信息学
中图分类号 S436.34 文献标识码 A
Abstract Colletotrichum higginsianum Sacc. is one of the important phytopathogenic fungi worldwide， and often causes severe anthracnose disease on a wide range of cruciferous plants， which influences the quality of infected crops and causes serious economic losses. The effectors of phytopathogenic fungi play an important role during the infection process of fungal pathogens on their host plants. In this study， the candidate effectors and their functions were predicted and analyzed by using bioinformatic methods based on the published full-length genome sequence of C. higginsianum and on the derived protein sequences of C. higginsianum. Firstly，all secreted proteins were predicted with SignalP， TMHMM， Protcomp， big-PI Predictor and TargetP programs. And then， a further screening through the sequence size and the cysteine content of predicted proteins was carried out. Finally， the candidate effectors were aligned with the non-redundant protein database using blastp tools， and those sequences without protein homology in the database were identified so as to obtain the candidate effectors. As a result， 135 candidate effectors of C. higginsianum were predicted by analyzing 16 150 protein sequences of C. higginsianum， and most of them are the hypothetical proteins with unknown function. Taken together， the candidate effectors of C. higginsianum were predicted by using bioinformatic methods， which lay a foundation for the further study of the functions of these effectors， and the results can also provide reference for the prediction of other fungal effectors.
Key words Colletotrichum higginsianum； Effectors； Signal peptide； Crucifer anthracnose； Bioinformatics
刺盘孢属（Colletotrichum），俗称炭疽菌属，是一类世界性分布的、十分重要的植物病原真菌，其寄主范围非常广泛，能引起农作物、果树、蔬菜和林木等众多的植物炭疽病，给农林业生产造成严重危害，在热带、亚热带地区尤为严重[1-2]。其中的希金斯刺盘孢（C. higginsianum Sacc.），俗称十字花科炭疽菌，可引起严重的十字花科植物炭疽病[3]。
植物在与病原菌相互作用过程中，病原菌分泌效应分子到寄主植物细胞中，对寄主植物细胞的生理、生化过程及细胞代谢等产生显著的影响，并克服寄主植物的防卫反应，从而促进和完成对寄主植物的侵染[4]。效应分子一般具有以下特征[5-7]：（1）含有N-端信号肽；（2）无跨膜结构域；（3）无糖基磷脂酰肌醇锚定位点；（4）没有将蛋白输送至线粒体或其它胞内细胞器的预测定位信号；（5）氨基酸残基数量大约在50～300氨基酸；（6）富含半胱氨酸而且特异性高。关于病原菌效应分子的研究，目前已通过图位克隆分离克隆得到许多植物病原效应蛋白基因，并结合异源表达分析及结构生物物理手段对部分效应蛋白基因表达产物的功能进行了鉴定[8-10]。 迄今为止，国内外从细胞和分子水平上研究希金斯刺盘孢对十字花科植物致病机制的有关研究报道较少。其中多数研究是以拟南芥作为寄主植物进行研究的，因为其全基因组序列已经公布，并获得了大量的人工突变体，而希金斯刺盘孢（C. higginsianum）具有特别的营养方式的转变，且可进行遗传转化[11-12]。此外，构建由根癌农杆菌介导的希金斯刺盘孢T-DNA插入突变体库，通过将突变体的分生孢子接种到离体和活体的拟南芥叶片进行实验，从而揭示了希金斯刺盘孢与拟南芥互作的分子机制[13-14]。希金斯刺盘孢-拟南芥的互作系统已成为病原菌与寄主植物分子互作研究的一个典型模式[15]。最近对希金斯刺盘孢的序列和转录组分析显示，该病原菌的大多数候选效应分子具有种的特异性，而且通过对其侵染过程中的效应分子分析表明，大多数的效应分子是在其活体寄生的阶段被诱导的[16-17]。因此，以十字花科蔬菜-菜心（Brassica parachinensis Bailey）[18-19]作为希金斯刺盘孢的寄主植物材料，将更有利于分析该病原菌与十字花科蔬菜之间互作的本质及其致病的分子机制。本研究根据已公布的希金斯刺盘孢全基因组信息，通过生物信息学方法，对其中的候选效应分子及其功能进行了初步预测和分析，以期为下一步的希金斯刺盘孢效应分子的筛选及其功能研究并为阐明这些效应分子在致病过程中的作用提供重要的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
来自希金斯刺盘孢（C. higginsianum）基因组和转录组数据库（http：//www.broad-institute.org/annotation/genome/colletotrichum_group/MultiDownloads.html）中的该病菌全基因组的16 150条蛋白质的氨基酸序列。
1.2 方法
1.2.1 SignalP 4.1 Server SignalP 4.1 Server[20]（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）是信号肽预测的服务器，它的功能是预测给定的氨基酸序列中是否存在潜在的信号肽剪切位点及其所在位置，原核生物和真核生物都可以进行预测。目前服务器提供的是SignalP 4.1版本。以SignalP 4.1分析获得预测蛋白的 C、S 和 Y的最大值，以及位于N 端和被预测的剪切位点间的 S曲线的中间值，以此区分信号肽和非信号肽。而信号肽剪切位点则位于预测的含有信号肽蛋白的Y曲线的最大值处。本实验中使用默认设置。
1.2.2 TMHMM Server v. 2.0 TMHMM Server v. 2.0[21]（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）主要用于预测蛋白的跨膜结构域。
1.2.3 ProtComp v. 9.0 ProtComp v. 9.0[22]（http：//linux1.softberry.com/berry.phtml？topic=protcompa-n&group=programs& subgroup=proloc）主要是对动物或真菌中的蛋白的亚细胞定位进行预测，它可将蛋白按以下归属进行划分：细胞核、质膜、胞外分泌、细胞质、线粒体、内质网、过氧物酶体、溶酶体和高尔基体。
1.2.4 Big-PI Predictor Big-PI Predictor（http：//mendel.imp.ac.at/gpi/fungi_server.html）对在真菌GPI（糖基磷脂酰肌醇）修饰位点进行预测，判断预测蛋白是否有脂质锚定修饰。如果存在糖基磷脂酰肌醇脂质锚定修饰，真核生物中蛋白质需要在内质网中。
1.2.5 TargetP 1.1 Server TargetP 1.1 Server[23]（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）用于进一步确定预测蛋白的亚细胞定位，可将蛋白的定位归属于线粒体、叶绿体、胞外分泌以及其它亚细胞定位。位置分配是基于任何的N-末端的前序列预测存在：叶绿体转运肽（CTP），线粒体靶向肽（MTP）或分泌途径的信号肽（SP）。
1.2.6 CalMolWt CalMolWt（http：//www.cnhupo.cn/CalMW/MYMW.asp）蛋白质分子量、氨基酸组成的计算器。用于分析筛选出的序列的半胱氨酸含量。
1.2.7 LipoP 1.0 Server LipoP 1.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/LipoP）用来预测脂蛋白，也用来区分脂蛋白信号肽、其他信号肽和格兰氏阴性菌N端膜螺旋。
1.2.8 BLASTP BLASTP（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch &LINK_LOC=blasthome）是使用蛋白序列到蛋白数据库中查询的一种工具。每条所查序列能与数据库中已存在的每条已知序列进行序列比对，可以通过所得结果结合参数得到与此相关的信息。
2 结果与分析
2.1 希金斯刺盘孢效应分子全基因组预测
在希金斯刺盘孢（C. higginsianum）基因组和转录组数据库中下载全基因组序列，其中含有16 150条氨基酸序列，其基因组分析见表1。
SignalP v4.1 是用于预测原核及真核生物氨基酸序列中信号肽切割位点是否存在及其存在的具体位置，该软件综合了人工神经网络（Artificial Neural Networks）算法和隐马可夫模型（Hidden Markov Models）的功能[24]。根据上述的效应分子的6个特征，使用SignalP 4.1 Server对16 150个蛋白序列进行分析，预测得到有1 528个编码含N端信号肽的蛋白，占全基因组蛋白序列的9.46%；对所得的结果分析发现，长度小于450 aa的序列最多，占了全部的77.20%（图1）。 在含有信号肽的分泌型蛋白质序列中，如果含有跨膜区则表明该蛋白可能为膜受体，也可能是膜上的锚定蛋白或者离子通道蛋白。本研究使用TMHMM Server v. 2.0来预测蛋白序列的跨膜螺旋结构，排除具有跨膜结构域的蛋白序列。从蛋白跨膜结构域分析结果可以看到，在含信号肽的1 528个蛋白中，有89个蛋白序列含有两个或多个跨膜域，174个蛋白序列只含有1个跨膜域，而有1 265个蛋白序列则不含跨膜域。只含1个跨膜域的蛋白质，其所具有的跨膜结构域位置均位于N端，该区域可能为前期所预测的信号肽序列，而且服务器并不能完全对信号肽序列和所属跨膜域区序列进行区分。因此，本研究选择不含跨膜域和只含有1个跨膜域的1 439个蛋白序列进行下一步研究。
将上述初步筛选出的1 439个蛋白序列进一步用ProtComp v. 9.0进行分析，预测到共有782个信号肽分泌至胞外，17个转运至细胞核，177个转运至细胞质膜，88个转运至细胞质，207个转运至线粒体，55个转运至内质网，19个转运至过氧化物酶体，69个传输至溶酶体，20个转运至高尔基体，5个转运至液泡（图2）。继而进行GPI锚定蛋白的预测，以判断这些被初步推断为分泌蛋白是否为胞外蛋白。将782个分泌蛋白用big-PI Predictor 程序进行分析，发现有46个为GPI锚定蛋白，而736个为非GPI锚定蛋白。由于在真核细胞中，分泌蛋白的分泌目标有可能是胞内细胞器，而非胞外。因而需要进一步用 TargetP v1.1以排除非胞外分泌蛋白。对736个非GPI锚定的分泌蛋白的分析结果发现，其中有11个含有线粒体定位信号，2个含有其它定位信号，剩下723个蛋白序列都含有胞外定位信号。
由于效应分子的氨基酸残基数量一般在50～300 aa之间[25-26]，因此将这723个序列按照其长度进行排列，明确了其中有457个蛋白的氨基酸残基数量在50～300 aa之间。此外，根据效应分子富含半胱氨酸的特点，利用CalMolWt 计算所有候选序列的半胱氨酸含量。将不含半胱氨酸的序列排除之后，得到418个半胱氨酸残基含量在1～27数量不等的蛋白序列。最后，将上述符合条件的氨基酸序列在NCBI数据库中利用blastp工具与非冗余蛋白质数据库进行比对，找出那些与数据库中的没有同源性的序列，要求其E-value值小于1e-5。最终得到135个符合上述所有6个条件的候选效应分子，其中有30个蛋白序列在数据库了没有任何与之同源的序列，剩余的105个除了与刺盘孢属（Colletotrichum）的序列有同源性外，与其他物种都没有同源性。
2.2 希金斯刺盘孢候选效应分子信号肽特征分析
现已明确大多数物种的信号肽主要是通过 4 种类型的信号肽酶识别位点被信号肽酶所识别并被切割，从而使成熟蛋白穿过膜转运到细胞不同的部位[27]。本研究通过对135个候选效应分子所含的信号肽氨基酸长度进行分析，结果显示，含有信号肽长度为17～22 aa的蛋白质序列数量最多，所占比例为82.22%，其中尤以所含信号肽长度为19 aa的蛋白序列居多，所占比例为18.52%（图3）。
利用LipoP 1.0 Server对上述分泌蛋白进行信号肽酶识别位点的预测分析，结果显示119个蛋白序列含有SpI型信号肽识别位点，14个含有CYT型信号肽识别位点以及2个含有SpII型信号肽识别位点，所占比例分别为88.15%、10.37%和1.48%，说明希金斯刺盘孢中的候选效应分子大部分是由SpI型信号肽酶进行识别。
此外还对20种氨基酸在135个候选效应分子信号肽中出现的频率进行了分析（图4），结果表明，在组成信号肽的氨基酸中，丙氨酸（A）的数量为579，数量最多，占21.64%；其次为亮氨酸（L），486个，占全部的18.16%；其他的依次为丝氨酸（S）、 缬氨酸（V）、 苯丙氨酸（F）、 苏氨酸（T）、 蛋氨酸（M）、 异亮氨酸（I）、 甘氨酸（G）、 脯氨酸（P）、 精氨酸（R）、 谷氨酰胺（Q）、 赖氨酸（K）、 酪氨酸（Y）、 半胱氨酸（C）、 组氨酸（H）、 天冬酰胺（N）、 谷氨酸（E）、 色氨酸（W）和天冬氨酸（D），分别占9.34%、8.30%、7.14%、6.99%、5.49%、5.23%、2.99%、2.80%、2.50%、2.32%、1.94%、1.08%、1.05%、0.90%、0.82%、0.64%、0.45%和0.22%。统计分析发现，非极性、疏水的氨基酸出现频率最高（A、V、L、G、I和P），占59.12%；其次为有极性、不带电荷的氨基酸（S、T、C、M、N和Q），占26.01%；带负电荷的酸性氨基酸（A和E）占22.27%；带正电荷的碱性氨基酸（K、R和H）占5.34%；芳香族氨基酸（W、F和Y）占8.67%。
使用MEME[28]对希金斯刺盘孢候选效应分子信号肽序列进行基序（motif）分析，发现存在一种氨基酸组成模式为M[KR]FSTL[LA]L[AL][LA]的基序（图5）；对所有分泌蛋白进行基序分析发现，除了位于信号肽中的基序外，还存在另外2种基序，分别为P[GQ][LR][KR]E [SY][FR][CR]R和[HP][CQ][LS][RS] W [DG][LW]。
2.3 希金斯刺盘孢候选效应分子的功能分析
对预测获得的135个希金斯刺盘孢候选效应分子与GenBank的非冗余蛋白质数据库Nr和SWISS-PROT的uniprot_sprot数据库进行比对，以获得蛋白的参考功能信息。对比发现，11个效应分子具有预测功能（表2），其余124个效应分子皆为功能未知的假定蛋白。从表2中可以看出，大部分候选效应分子都为有预测功能的假定蛋白，但这些所列出的功能对于维持细胞正常生命活动都具有重要作用。然而，这些功能描述的仅仅是预测的结果，它们的真实性还有待通过有关实验作进一步的验证。此外，大多数预测出的希金斯刺盘孢候选效应分子均为功能未知的假定蛋白，也正是由于其具有特异性而形成的（正如效应蛋白的其中一个特征所示：富含半胱氨酸而且特异性高）。 3 讨论与结论
希金斯刺盘孢全基因组测序的完成和公布，为希金斯刺盘孢的分泌蛋白、致病因子和与植物之间互作的研究提供了重要的数据基础。本研究预测得到135个符合要求的希金斯刺盘孢候选效应分子，大多属于小型蛋白，其信号肽集中在17～22 aa且含有SpI型信号肽识别位点。对于希金斯刺盘孢候选效应分子功能的初步分析发现，预测出的92%候选效应分子为功能未知的假定蛋白。而且，其中大概有30%的希金斯刺盘孢的蛋白与禾生刺盘孢（C. graminicola，俗称禾谷炭疽病菌）的蛋白同源。一方面，说明了候选蛋白具有特异性，其未知功能需要进一步验证分析；另一方面，也可以为研究禾生刺盘孢的效应分子以及其它刺盘孢的效应分子的共性提供一个思路。此外，目前已发现在卵菌和真菌中含有RxLx、LxAR（x，代表任何氨基酸）等保守基序[25，29]。本研究试图通过对希金斯刺盘孢候选效应分子的基序进行研究，但无法找到上述类似的基序。虽然目前已有不少物种开展了效应分子的研究，但都没发现类似的基序。在刺盘孢属真菌里是否存在像卵菌一样有规律的保守基序，还需要通过实验研究才能够得出相应的结论。
本研究通过生物信息学手段，对希金斯刺盘孢候选效应分子进行了预测。与此同时，本研究也参考了前人利用生物信息学分析软件对粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）[30]、禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）[31]、稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）[32]、大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）[33]和米曲霉（Aspergillus oryzae）[34]等进行了蛋白类型的预测，根据真菌效应分子的特点，选择合适合理的预测服务器和相关软件进行分析，保证了预测结果的可靠性，但同时也可能在一定程度上漏掉一部分效应分子，特别是那些不符合效应分子特征但具有效应分子功能的蛋白[17，35]。因此，需要对预测的结果进行实验验证。本研究已将部分候选效应分子克隆出来，并进行了功能筛选，证明了预测结果的准确性（另文发表），为进一步研究希金斯刺盘孢效应分子的功能打下了基础。
Kleemann等[17]对希金斯刺盘孢进行了基因组和转录组分析，得到了较多具有酶和效应分子等功能的蛋白质，其中从不同细胞类型和侵染阶段相关的真菌转录组测序生成的表达序列标签（ESTs）中得到327个候选效应分子，但其中含有部分不含信号肽、不含半胱氨酸和没有特异性的蛋白。而O'Connell等[16]在UniProt数据库中，将希金斯刺盘孢测序得到的序列通过与刺盘孢属（Colletotrichum）之外的没有同源性的序列进行BLAST，从而得到365个候选效应分子，其中72%的候选效应分子是物种特异性的，与禾生刺盘孢（C. graminicola）的效应分子缺乏同源性。而本研究没有直接从ESTs或直接利用BLAST进行预测，而是试图先得到分泌蛋白，再进行同源比对而得到候选效应分子。根据真菌效应分子的特征，通过一个规范的流程得到的候选效应分子，更有利于对其进行共性的分析，也为其他真菌效应分子的预测提供参考。
随着更多的植物病原真菌全基因组序列的公布，将为进一步利用生物信息学手段和方法对这些病原真菌的效应分子进行分析提供了条件。如禾生刺盘孢（C. graminicola）已最终预测明确286个具有典型特征的效应分子[36]，而杨生褐盘二孢菌（Marsonina brunnea）最终预测得到106个候选效应因子[26]，稻瘟病菌（M. oryzae）通过候选基因进行表达分析和同源比对最终发现有42个符合条件的分泌蛋白基因[37]等。同时，基因组测序加快了功能基因的研究速度，可以根据某个基因的序列来推测其相应功能进而进行功能验证，这样就可以批量地研究生物基因的功能。当获得了预测得到的候选效应分子后，需通过原核表达及PCD（programmed cell death，细胞程序性死亡）检测才可以验证候选效应分子是否为效应分子，从而更好地研究其功能及其与寄主植物之间的相互作用。
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