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摘要 介绍了一种经济高效获取突变序列的方法。该方法克服了传统的基因定点突变样品双峰测序峰图分析工作量大、操作繁琐、结果判定周期长等问题，通过与野生型序列的对比分析，判定突变类型，直接获取突变型基因序列，从而为基因定点突变技术中快速筛选、确定阳性样品及其研究奠定理论基础。
关键词 序列分析；基因定点修饰技术；突变序列
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2016）34-0152-02
One Step Analysis of Mutation Sequences in Two Peak Sequencing Samples Obtained by the Site-directed Mutagenesis
LAI Ya-na1，ZHOU Zhou2*
（1.Nanjing Medical University， Nanjing， Jiangsu 211166；2.Nanjing Normal University， Nanjing， Jiangsu 210023）
Abstract A quick method to obtain the sequence of mutation was mtroduced. The traditional sequence analysis method of site-directed gene mutagenesis had the problems such as complicated operation， long result determination cycle and high cost of research.Mutations in the sequence and the type of mutation could be obtained by direct comparison with the wild type sequence. As a result， this method could obviously improve the work efficiency and also provided an economical and efficient sequence analysis for the selection of positive samples of gene site mutation technique for researchers.
Key words Sequence analysis；The site-directed mutagenesis；Mutatim sequence
近年來，随着DNA剪辑技术的快速发展，ZFN、TALENs、Crispr/Cas9等技术在越来越多的实验室得到运用和开展[1-5]。鉴别获取的突变样品表型是否有意义，首先要在目标基因靶点两端设计引物，进行PCR扩增并纯化，然后用PCR引物或新合成的引物对纯化后的样品进行测序，若结果显示目标靶点附近出现套峰，则判定为DNA剪辑技术作用过的样本。若要进一步明确具体的模板碱基改变是否有意义（移码或提前终止），可通过扩增获取测序套峰样品的目标基因片段PCR产物，将其克隆到质粒（如T载体），筛选阳性单克隆测序或将PCR产物进行PAGE胶纯化（片段大小差别大，至少琼脂糖充分电泳后能够实现切胶纯化）后再进行测序。
克隆测序存在操作繁琐、工作量大、周期长以及费用高等问题；而切胶纯化在实际操作时又存在很多困难，其原因在于基因剪辑技术得到的新基因型在序列缺失/增加碱基数量与野生型相差不大，因此切胶纯化仅针对一部分大片段剪辑缺失的样本进行操作。笔者通过总结近年来实际操作的经验，介绍一种快速、经济、便捷的方法。该方法通过直接对样品PCR产物测序双峰进行分析，无需其他试验操作，一步即能实现突变基因型序列的获取。
1 一步法从双峰图中获得突变序列的原理和步骤
样品在特定位点出现突变，当检测到测序位点时，由于该位点除野生型对应的碱基组成外还有与野生型不同突变型碱基组成。因此在该位点表现出2种或2种以上不同碱基组成对应的双峰或重叠峰。如果样品中仅有碱基替换引起的突变，测序峰图在突变位点除野生型在该位点为重叠峰，突变点上下游序列均与野生型一致的单一测序峰型；当样品中存在序列缺失/增加时，样品峰图在该位点前表现为单一测序峰型，该位点后由于突变造成整段后续序列的移码，因其与野生型碱基序列不同造成靶位点后均为双峰峰型。因此，操作者要得到突变序列，读取峰图时首先要辨别特定位点与野生型不同的碱基类型，当单峰因位点与野生型该位点的碱基类型相同即可直接记录，读到双峰时记录与野生型不同的碱基型，如此反复逐一记录即可获取靶位点后的完整突变碱基序列。
尽管通过上述原理的分析，可以采用机械的方法，获得仅存在一种碱基改变情况下的样品突变型序列。但实际工作中，序列获取在操作过程中有一定的技巧。通过突变类型的判断，根据碱基突变的类型（碱基替换、碱基的增加以及碱基的缺失），可以利用简单的方法，更快地获得所需要的突变序列。
2 实例分析
2.1 相同数量碱基替换引起的突变
基因定点编辑技术引起碱基改变后的序列与野生型对应序列的碱基数量相同，可视为个别碱基替换引起的突变。此类突变测序峰图的特征：测序序列的长度不变，峰图上下游因序列重合表现为大片段的单一峰，中间序列由于出现与野生型相同数量的碱基改变，而表现出短片段（通常几个碱基）双峰。表现形式为长片段单峰-短片段双峰-长片段单峰。
2.2 样品中个别碱基缺失引起的突变
在碱基缺失的情况下，由于突变序列比野生型序列短。因此，操作者在判断突变类型时，发现整段序列与野生型序列等长，即测序序列终止的位点与野生型序列应终止的位点一致，峰图上游是一段单峰序列，双峰的序列较长，从突变起始位置延续至测序峰图尾端，序列末端双峰结束后有一段单一序列。具体表现为长片段单峰-长片段双峰-短片段单峰（测序峰图结束位点与野生型序列等长）。 通过比较，即野生型与突变型峰末端的序列，突变型序列结束的位点在478 bp处，相比野生型482 bp的长度少4 bp，该突变类型可判断为碱基缺失。野生型序列为CGGGTGGAACTGTGTTAC，突变型部分序列为CGGAACTGTGTTAC，突变型比野生型序列少GTGG 4个碱基，向下游选取特定位置再进行验证，发现突变型整体序列相对于野生型均向前移动4个碱基，由此即可获取突变型整段基因序列。
2.3 样品中个别碱基增加引起的突变
在碱基增加的情况下，突变型序列获取的方式与碱基缺失引起突变的方式相似。由于突变序列比野生型序列长，在测序峰图上表现为双峰结束的位点比野生型序列应结束的位点长，而该位点下游有一段与野生型末端序列相同单一测序峰出现。具体表现为长片段单峰-长片段双峰（双峰结束位点与野生型序列等长）-短片段单峰。
3 讨论
该研究列举了3种典型表现形式的双峰测序峰图，符合其特征的峰图都可以按照其图谱特征，判定样品突变类型，获取完整突变序列。在实际工作中，有时会遇到其他类型的双峰突变，当样品中的2种突变均为碱基缺失时，峰图的整体特征是雙峰结束的位点在野生型序列应结束的位点上游，不同之处是下游单峰测序峰图的结束位点比野生型结束的位点短。样品中的2种突变均为碱基增加时，双峰结束的位点比野生型序列应结束的位点长。而当样品中的2种突变，一种为碱基增加而另一种为碱基减少时，峰图则表现为双峰结束的位点在野生型序列应结束位点上游，单峰测序峰图的结束位点在野生型结束位点的下游。应用过程中，仅需要通过观察峰图特征判断突变类型，再选取双峰下游几个位点进行验证，如均符合移码突变序列改变的规律，即可得到突变型基因的整段序列。
关于定点突变技术得到的品系样品，通过传统方法明确测序双峰阳性样品的突变序列还要进行大量的试验工作，通常要几天才能完成。而该方法对测序双峰样品图谱进行直接分析，即可在几分钟快速明确突变类型（碱基缺失、增加或者替换），获取具体改变的碱基数目和序列，大大缩短了试验步骤和周期，提高了工作效率，节约了试验成本，为开展基因定点突变提供了一种行之有效的分析方法。
参考文献
[1] MILLER J C，HOLMES M C，WANG J B，et al.An improved zinc-finger nuclease architecture for highly specific genome editing[J].Nat Biotechnol，2007，25（7）：778-785.
[2] HOCKEMEYER D，SOLDNER F，BEARD C，et al.Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases[J].Nat Biotechnol，2009，27（9）：851-857.
[3] GAJ T，GERSBACH C A，BARBAS C F.ZFN，TALEN，and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering[J].Trends Biotechnol，2013，31（7）：397-405.
[4] KIM H，KIM J S.A guide to genome engineering with programmable nucleases[J].Nat Rev Genet，2014，15（5）：321-334.
[5] CARLSON D F，TAN W F，LILLICO S G，et al.Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock[J].Proc Natl Acad Sci USA，2012，109（43）：17382-17387.
关键词 序列分析；基因定点修饰技术；突变序列
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2016）34-0152-02
One Step Analysis of Mutation Sequences in Two Peak Sequencing Samples Obtained by the Site-directed Mutagenesis
LAI Ya-na1，ZHOU Zhou2*
（1.Nanjing Medical University， Nanjing， Jiangsu 211166；2.Nanjing Normal University， Nanjing， Jiangsu 210023）
Abstract A quick method to obtain the sequence of mutation was mtroduced. The traditional sequence analysis method of site-directed gene mutagenesis had the problems such as complicated operation， long result determination cycle and high cost of research.Mutations in the sequence and the type of mutation could be obtained by direct comparison with the wild type sequence. As a result， this method could obviously improve the work efficiency and also provided an economical and efficient sequence analysis for the selection of positive samples of gene site mutation technique for researchers.
Key words Sequence analysis；The site-directed mutagenesis；Mutatim sequence
近年來，随着DNA剪辑技术的快速发展，ZFN、TALENs、Crispr/Cas9等技术在越来越多的实验室得到运用和开展[1-5]。鉴别获取的突变样品表型是否有意义，首先要在目标基因靶点两端设计引物，进行PCR扩增并纯化，然后用PCR引物或新合成的引物对纯化后的样品进行测序，若结果显示目标靶点附近出现套峰，则判定为DNA剪辑技术作用过的样本。若要进一步明确具体的模板碱基改变是否有意义（移码或提前终止），可通过扩增获取测序套峰样品的目标基因片段PCR产物，将其克隆到质粒（如T载体），筛选阳性单克隆测序或将PCR产物进行PAGE胶纯化（片段大小差别大，至少琼脂糖充分电泳后能够实现切胶纯化）后再进行测序。
克隆测序存在操作繁琐、工作量大、周期长以及费用高等问题；而切胶纯化在实际操作时又存在很多困难，其原因在于基因剪辑技术得到的新基因型在序列缺失/增加碱基数量与野生型相差不大，因此切胶纯化仅针对一部分大片段剪辑缺失的样本进行操作。笔者通过总结近年来实际操作的经验，介绍一种快速、经济、便捷的方法。该方法通过直接对样品PCR产物测序双峰进行分析，无需其他试验操作，一步即能实现突变基因型序列的获取。
1 一步法从双峰图中获得突变序列的原理和步骤
样品在特定位点出现突变，当检测到测序位点时，由于该位点除野生型对应的碱基组成外还有与野生型不同突变型碱基组成。因此在该位点表现出2种或2种以上不同碱基组成对应的双峰或重叠峰。如果样品中仅有碱基替换引起的突变，测序峰图在突变位点除野生型在该位点为重叠峰，突变点上下游序列均与野生型一致的单一测序峰型；当样品中存在序列缺失/增加时，样品峰图在该位点前表现为单一测序峰型，该位点后由于突变造成整段后续序列的移码，因其与野生型碱基序列不同造成靶位点后均为双峰峰型。因此，操作者要得到突变序列，读取峰图时首先要辨别特定位点与野生型不同的碱基类型，当单峰因位点与野生型该位点的碱基类型相同即可直接记录，读到双峰时记录与野生型不同的碱基型，如此反复逐一记录即可获取靶位点后的完整突变碱基序列。
尽管通过上述原理的分析，可以采用机械的方法，获得仅存在一种碱基改变情况下的样品突变型序列。但实际工作中，序列获取在操作过程中有一定的技巧。通过突变类型的判断，根据碱基突变的类型（碱基替换、碱基的增加以及碱基的缺失），可以利用简单的方法，更快地获得所需要的突变序列。
2 实例分析
2.1 相同数量碱基替换引起的突变
基因定点编辑技术引起碱基改变后的序列与野生型对应序列的碱基数量相同，可视为个别碱基替换引起的突变。此类突变测序峰图的特征：测序序列的长度不变，峰图上下游因序列重合表现为大片段的单一峰，中间序列由于出现与野生型相同数量的碱基改变，而表现出短片段（通常几个碱基）双峰。表现形式为长片段单峰-短片段双峰-长片段单峰。
2.2 样品中个别碱基缺失引起的突变
在碱基缺失的情况下，由于突变序列比野生型序列短。因此，操作者在判断突变类型时，发现整段序列与野生型序列等长，即测序序列终止的位点与野生型序列应终止的位点一致，峰图上游是一段单峰序列，双峰的序列较长，从突变起始位置延续至测序峰图尾端，序列末端双峰结束后有一段单一序列。具体表现为长片段单峰-长片段双峰-短片段单峰（测序峰图结束位点与野生型序列等长）。 通过比较，即野生型与突变型峰末端的序列，突变型序列结束的位点在478 bp处，相比野生型482 bp的长度少4 bp，该突变类型可判断为碱基缺失。野生型序列为CGGGTGGAACTGTGTTAC，突变型部分序列为CGGAACTGTGTTAC，突变型比野生型序列少GTGG 4个碱基，向下游选取特定位置再进行验证，发现突变型整体序列相对于野生型均向前移动4个碱基，由此即可获取突变型整段基因序列。
2.3 样品中个别碱基增加引起的突变
在碱基增加的情况下，突变型序列获取的方式与碱基缺失引起突变的方式相似。由于突变序列比野生型序列长，在测序峰图上表现为双峰结束的位点比野生型序列应结束的位点长，而该位点下游有一段与野生型末端序列相同单一测序峰出现。具体表现为长片段单峰-长片段双峰（双峰结束位点与野生型序列等长）-短片段单峰。
3 讨论
该研究列举了3种典型表现形式的双峰测序峰图，符合其特征的峰图都可以按照其图谱特征，判定样品突变类型，获取完整突变序列。在实际工作中，有时会遇到其他类型的双峰突变，当样品中的2种突变均为碱基缺失时，峰图的整体特征是雙峰结束的位点在野生型序列应结束的位点上游，不同之处是下游单峰测序峰图的结束位点比野生型结束的位点短。样品中的2种突变均为碱基增加时，双峰结束的位点比野生型序列应结束的位点长。而当样品中的2种突变，一种为碱基增加而另一种为碱基减少时，峰图则表现为双峰结束的位点在野生型序列应结束位点上游，单峰测序峰图的结束位点在野生型结束位点的下游。应用过程中，仅需要通过观察峰图特征判断突变类型，再选取双峰下游几个位点进行验证，如均符合移码突变序列改变的规律，即可得到突变型基因的整段序列。
关于定点突变技术得到的品系样品，通过传统方法明确测序双峰阳性样品的突变序列还要进行大量的试验工作，通常要几天才能完成。而该方法对测序双峰样品图谱进行直接分析，即可在几分钟快速明确突变类型（碱基缺失、增加或者替换），获取具体改变的碱基数目和序列，大大缩短了试验步骤和周期，提高了工作效率，节约了试验成本，为开展基因定点突变提供了一种行之有效的分析方法。
参考文献
[1] MILLER J C，HOLMES M C，WANG J B，et al.An improved zinc-finger nuclease architecture for highly specific genome editing[J].Nat Biotechnol，2007，25（7）：778-785.
[2] HOCKEMEYER D，SOLDNER F，BEARD C，et al.Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases[J].Nat Biotechnol，2009，27（9）：851-857.
[3] GAJ T，GERSBACH C A，BARBAS C F.ZFN，TALEN，and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering[J].Trends Biotechnol，2013，31（7）：397-405.
[4] KIM H，KIM J S.A guide to genome engineering with programmable nucleases[J].Nat Rev Genet，2014，15（5）：321-334.
[5] CARLSON D F，TAN W F，LILLICO S G，et al.Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock[J].Proc Natl Acad Sci USA，2012，109（43）：17382-17387.