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摘 要：目的：观察利拉鲁肽对高脂饮食喂养大鼠血清炎症因子的影响，探讨利拉鲁肽对大动脉保护作用的机理。方法：60只清洁级SD雄性大鼠随机分为正常对照组、高脂饮食组、低剂量利拉鲁肽干预组、高剂量利拉鲁肽干预组，分别予以正常饮食、促动脉硬化高脂饮食、以及不同剂量利拉鲁肽处理12周后。酶联免疫ELISA法检测处理后血清hs-CRP、ICAM-1、VCAM-1水平，彩超及HE染色检测大鼠腹主动脉病变情况。结果：与对照组相比，促动脉硬化高脂饮食组大鼠体重增加，血清hs-CRP、ICAM-1、VCAM-1升高，腹主动脉内中膜厚度增厚；利拉鲁肽干预组大鼠体重增加不明显，血清hs-CRP、ICAM-1、VCAM-1水平及腹主动脉内中膜增厚情况有所减轻，以高剂量利拉鲁肽干预组改善更明显（P<0.05）。结论：1、利拉鲁肽对高脂饮食喂养大鼠的腹主动脉内中膜厚度有保护作用，该作用呈剂量依赖性。2、利拉鲁肽对高脂饮食诱导大血管损伤的大鼠血管的保护作用可能与改善血清炎症因子水平有关。
关键词：利拉鲁肽、血清炎症因子、高脂饮食、腹主动脉内中膜厚度。
Abstract：Objective： To observe the effects of liraglutide on the aortic intima-media thickness in rats fed with promoting atherosclerosis high fat diet， investigate its possible mechanism.Methods： 60 clean SD male rats were randomly divided into 4 groups：Normal diet group， promoting atherosclerosis high fat diet group， high fat diet +low-dose liraglutide group， high fat diet+ high-dose liraglutide group，correspondingly given ordinary diet or promoting atherosclerosis high fat diet for 12 weeks. The body weight，serum hs-CRP、ICAM-1、VCAM-1 were measured at the end of experiment. The intima mediathickness of abdominal aortic was detected by ultrasound. Kesults： Compared with the control group， the body weight， serum hs-CRP、ICAM-1、VCAM-1 level of rats on high fat diet was significantly increased. The abdominal aortic intima-media thickness was increased in rats fed with high fat diet. Liraglutide intervention ameliorated the abdominal aortic intima-media thickness in a dose dependent manner. The serum hs-CRP、ICAM-1、VCAM-1 level were decreased in all Liraglutide intervention groups.Conclusions： Liraglutide ameliorated the abdominal aortic intima-media thickness in rats fed with promoting atherosclerosis diet in a dose dependent manner. The protective effect of Liraglutide on macrovascular lesions may relate to an decrease of the serum inflammatory factors level.
Keywords： Liraglutide； serum inflammatory factors；High-fat diet；Macrovascular lesions
利拉鲁肽（Liraglutide）是一种长效GLP-1类似物，具有刺激胰岛素分泌、延缓胃排空、控制食欲、改善血脂谱，减轻体重以及抑制β细胞凋亡等多重益处，因而被广泛应用于2型糖尿病的治疗[1、2]。目前的研究显示GLP-1不仅具有降糖作用，还在抑制炎症反应、保护内皮细胞、改善心肌葡萄糖代谢、减少心肌梗死面积等方面发挥直接或间接的心血管保护效应[3、4]，为糖尿病合并心血管疾病的治疗提供了新的选择。本研究的目的，在于观察利拉鲁肽对高脂饮食喂养大鼠血清炎症因子的影响，并初步探讨其对大动脉内中膜厚度是否具有保护作用。
材料与方法
1 实验材料
1.1 实验动物
SD品系雄性清洁级大鼠60只（体重220～240g， 3～ 4 个月龄），由湖南省莱克景达实验动物有限公司提供。
1.2 实验饲料
基础饲料：41.47%的碳水化合物、14.42%的脂肪、21、06%的蛋白质。
高脂促动脉粥样硬化饲料配方：3%胆固醇，0.5%胆盐，0.2%丙硫氧嘧啶（PTU），5%白糖，10%猪油，81.3%基础饲料。
1.3 主要药品及试剂
利拉鲁肽（Liraglutide）购自诺和诺德中国制药有限公司；SP试剂盒（通用型）、DAB显色试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司；大鼠细胞间粘附分子1（ICAM-1/CD54）ELISA试剂盒、大鼠血管内皮细胞粘附分子1（VCAM-1/CD106）ELISA试剂盒、大鼠超敏C反应蛋白（hs-CRP）ELISA试剂盒购自上海工硕生物技术有限公司；丙硫氧嘧啶购自广东华南药业集团有限公司。 2 实验方法
2.1 动物分组及饲养、模型的建立
SD大鼠随机分为正常对照组（ND）、促动脉粥样硬化高脂饮食组（HFD）、高脂饮食+低剂量利拉鲁肽干预组（HFD+LLID），高脂饮食+高剂量利拉鲁肽干预组（HFD+HLID），每组各15只。每组联合肌肉注射维生素D3 （4×105U/Kg，每周给药一次，连续3周）。HFD+LLID组中利拉鲁肽以50ug/kg皮下注射，HFD+HLID组中利拉鲁肽以200ug/kg皮下注射，每天7：30AM及14：30PM各一次。ND及HFD组以等量生理盐水皮下注射。持续饲养3个月，每月称体重，测空腹血糖。
2.2模型的判定、标本的采集及处理
药物干预3月后予禁食一晚，第二天测体重、空腹血糖。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，予四维彩超检测腹主动脉内中膜厚度情况。心尖处抽血约5ml，分离血清置于-20℃冰箱保存以检测炎症因子指标。分离出腹主动脉，置入10%的甲醛中固定以留作HE染色、免疫组化检测。以腹主动脉四维彩超检测及病理切片结果来判定高脂饮食并发大血管病变模型制备成功与否。
2.3 血生化指标测定
全自动生化分析仪测定空腹血糖及糖化血红蛋白，放射免疫分析法检测空腹胰岛素，计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）：FBG×FINS/22.5。根据2010 年美国糖尿病协会糖尿病指南的标准： HOMA-IR>2.69为有胰岛素抵抗的标准。
2.4 血清炎症因子测定
血清ICAM-1、VCAM-1及hs-CRP检测均采用酶联免疫吸附法（ELISA），操作严格按说明书进行，简述如下：系列稀释的ICAM-1、VCAM-1及hs-CRP标准品和稀释的待测血清100ul加入96孔酶标板，37℃温育2小时，再加生物素标记的抗ICAM-1、VCAM-1或hs-CRP抗体50ul，37℃温育1小时，洗涤液洗3次，每孔加100ul辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，室温下孵育20分钟。
2.5 结果判定 采用盲法评估。
2.5.1四维彩超结果分析
采用频率20-40MHz的四维彩超检测大鼠腹主动脉内中膜的厚度，根据IMT数值来判断促动脉粥样硬化饮食合并大血管病变模型建立成功与否以及利拉鲁肽对大鼠腹主动脉内中膜的影响。
2.6 统计学处理
用SPSS13.0统计分析软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（X± s）表示，两组间比较用独立样本t检验，各组之间比较用单因素方差分析（One-way ANOVA），方差齐时两组之间比较采用S-N-K检验，方差不齐时用Dunnet检验，多有结果均以P<0.05为差异有统计学意义。
结果
1、实验动物一般情况、糖化血红蛋白、胰岛素抵抗水平的比较
对照组大鼠一般情况良好，行动敏捷，皮毛有光泽；HFD组大鼠行动迟缓，精神萎靡，体重增加（P<0.05）；低剂量利拉鲁肽预组大鼠体重较HFD组有所减轻；高剂量利拉鲁肽干预组一般状况优于低剂量组，体重较低剂量组减轻。与对照组比较，HFD组大鼠糖化血红蛋白水平、胰岛素抵抗指数明显升高（P<0.05）；与HFD组比较，利拉鲁肽干预组相应指标均有降低（P<0.05），其中以高剂量利拉鲁肽干预组血糖水平降低更为显著（表1）。
表1 四组大鼠体重、糖化血红蛋白、HOMA-IR的比较（X± s）
注：a与ND组比较， P<0.05；b与HFD组比较， P<0.05；c与HFD+LLID组比较， P<0.05。
2、各组大鼠腹主动脉四维彩超检测结果
与对照组比较，HFD组大鼠腹主动脉内中膜厚度明显增加（P<0.05）；与HFD组比较，利拉鲁肽干预组腹主动脉内中膜厚度减少（P<0.05），其中高剂量利拉鲁肽干预组腹主动脉内中膜厚度减少更为明显（图1）。
图1 各组大鼠腹主动脉IMT四维彩超结果比较
注：a与ND组比较， P<0.05；b与HFD组比较， P<0.05；c与HFD+LLID组比较， P<0.05。
3、各组大鼠血清炎症因子检测结果
与对照组相比，高脂饮食组大鼠血清hs-CRP、ICAM-1、VCAM-1升高；与高脂饮食组相比，利拉鲁肽干预组大鼠血清hs-CRP、ICAM-1、VCAM-1水平有所减轻，以高剂量利拉鲁肽干预组改善更明显（P<0.05）（表2）。
表2 四组大鼠血清hs-CRP、ICAM-1、VCAM-1的比较（X± s）
注：a与ND组比较， P<0.05；b与HFD组比较， P<0.05；c与HFD+LLID组比较， P<0.05。
讨论
心脑血管疾病是2型糖尿病的主要并发症，而动脉粥样硬化是心脑血管疾病的主要病理基础。炎症反应贯穿动脉粥样硬化发生发展的整个过程：细胞间粘附分子（ICAM） 及血管细胞粘附分子（VCAM） 等炎症因子介导了单核细胞向内皮细胞迁移、粘附和穿越内皮的过程。血管内皮炎症的长期存在诱发了炎症反应的级联放大，促使血管平滑肌细胞增殖并越过内弹力板层进入动脉内膜，表达大量的细胞因子和粘附分子，进而恶化炎症反应，并促进动脉粥样硬化中细胞外基质形成。另外，炎症反应在动脉粥样硬化斑块破裂中也发挥着重要作用[5]。因此，抑制炎症反应是预防2型糖尿病大血管病变的有效途径。
利拉鲁肽是一种长效GLP-1类似物，在2型糖尿病患者控制体重、抑制食欲、调节血糖、延缓胰岛β细胞凋亡等方面发挥了独特的优势。近期多项的研究结果显示，利拉鲁肽可能通过降低血压、抑制氧化应激、调节血脂谱等多种机制发挥对心血管系统的保护作用[6]。本实验通过高脂饮食喂养的方法，复制了糖尿病大血管病变的大鼠模型。实验结果表明：利拉鲁肽能够降低高脂饮食喂养大鼠的糖化血红蛋白水平，改善胰岛素抵抗，并能够降低实验动物血清hs-CRP、ICAM-1、VCAM-1等炎症因子水平，从而可能发挥对大血管病变的保护作用，但其确切机制仍有待进一步研究。 参考文献：
[1] Sarruf DA，Thaler JP，Morton GJ，et al. Fibroblast growth factor 21 action in the brain increases energy expenditure and insulin sensitivity in obese rats [J]. Diabetes，2010，59：1817-1824.
[2] 洪涛 文芳 文格波，等.利拉鲁肽对高脂饮食喂养大鼠的血脂谱的调节作用[J].中国医药导报， 2012， 19：16-17.
[3] Varanasi A， Patel P， Makdissi A， et al. Clinical use of liraglutide in type 2 diabetes and its effects on cardiovascular risk factors. Endocr Pract. 2012 ， 18（2）：140-145.
[4] Arakawa M， Mita T， Azuma K， Ebato C， Goto H， Nomiyama T， Fujitani Y， Hirose T，Kawamori R， Watada H. Inhibition of monocyte adhesion to endothelial cells and attenuation of atherosclerotic lesion by a glucagon-like peptide-1 receptor agonist， exendin-4. Diabetes. 2010 Apr；59（4）：1030-7.
[5] Libby P， Okamoto Y， Rocha VZ， Folco E. Inflammation in atherosclerosis： transition from theory to practice. Circ J. 2010 Feb；74（2）：213-20.
[6] Shiraki A， Oyama J， Komoda H， Asaka M， Komatsu A， Sakuma M， Kodama K， Sakamoto Y， Kotooka N， Hirase T， Node K. The glucagon-like peptide 1 analog liraglutide reduces TNF-α-induced oxidative stress and inflammation in endothelial cells. Atherosclerosis. 2012 Apr；221（2）：375-82.
关键词：利拉鲁肽、血清炎症因子、高脂饮食、腹主动脉内中膜厚度。
Abstract：Objective： To observe the effects of liraglutide on the aortic intima-media thickness in rats fed with promoting atherosclerosis high fat diet， investigate its possible mechanism.Methods： 60 clean SD male rats were randomly divided into 4 groups：Normal diet group， promoting atherosclerosis high fat diet group， high fat diet +low-dose liraglutide group， high fat diet+ high-dose liraglutide group，correspondingly given ordinary diet or promoting atherosclerosis high fat diet for 12 weeks. The body weight，serum hs-CRP、ICAM-1、VCAM-1 were measured at the end of experiment. The intima mediathickness of abdominal aortic was detected by ultrasound. Kesults： Compared with the control group， the body weight， serum hs-CRP、ICAM-1、VCAM-1 level of rats on high fat diet was significantly increased. The abdominal aortic intima-media thickness was increased in rats fed with high fat diet. Liraglutide intervention ameliorated the abdominal aortic intima-media thickness in a dose dependent manner. The serum hs-CRP、ICAM-1、VCAM-1 level were decreased in all Liraglutide intervention groups.Conclusions： Liraglutide ameliorated the abdominal aortic intima-media thickness in rats fed with promoting atherosclerosis diet in a dose dependent manner. The protective effect of Liraglutide on macrovascular lesions may relate to an decrease of the serum inflammatory factors level.
Keywords： Liraglutide； serum inflammatory factors；High-fat diet；Macrovascular lesions
利拉鲁肽（Liraglutide）是一种长效GLP-1类似物，具有刺激胰岛素分泌、延缓胃排空、控制食欲、改善血脂谱，减轻体重以及抑制β细胞凋亡等多重益处，因而被广泛应用于2型糖尿病的治疗[1、2]。目前的研究显示GLP-1不仅具有降糖作用，还在抑制炎症反应、保护内皮细胞、改善心肌葡萄糖代谢、减少心肌梗死面积等方面发挥直接或间接的心血管保护效应[3、4]，为糖尿病合并心血管疾病的治疗提供了新的选择。本研究的目的，在于观察利拉鲁肽对高脂饮食喂养大鼠血清炎症因子的影响，并初步探讨其对大动脉内中膜厚度是否具有保护作用。
材料与方法
1 实验材料
1.1 实验动物
SD品系雄性清洁级大鼠60只（体重220～240g， 3～ 4 个月龄），由湖南省莱克景达实验动物有限公司提供。
1.2 实验饲料
基础饲料：41.47%的碳水化合物、14.42%的脂肪、21、06%的蛋白质。
高脂促动脉粥样硬化饲料配方：3%胆固醇，0.5%胆盐，0.2%丙硫氧嘧啶（PTU），5%白糖，10%猪油，81.3%基础饲料。
1.3 主要药品及试剂
利拉鲁肽（Liraglutide）购自诺和诺德中国制药有限公司；SP试剂盒（通用型）、DAB显色试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司；大鼠细胞间粘附分子1（ICAM-1/CD54）ELISA试剂盒、大鼠血管内皮细胞粘附分子1（VCAM-1/CD106）ELISA试剂盒、大鼠超敏C反应蛋白（hs-CRP）ELISA试剂盒购自上海工硕生物技术有限公司；丙硫氧嘧啶购自广东华南药业集团有限公司。 2 实验方法
2.1 动物分组及饲养、模型的建立
SD大鼠随机分为正常对照组（ND）、促动脉粥样硬化高脂饮食组（HFD）、高脂饮食+低剂量利拉鲁肽干预组（HFD+LLID），高脂饮食+高剂量利拉鲁肽干预组（HFD+HLID），每组各15只。每组联合肌肉注射维生素D3 （4×105U/Kg，每周给药一次，连续3周）。HFD+LLID组中利拉鲁肽以50ug/kg皮下注射，HFD+HLID组中利拉鲁肽以200ug/kg皮下注射，每天7：30AM及14：30PM各一次。ND及HFD组以等量生理盐水皮下注射。持续饲养3个月，每月称体重，测空腹血糖。
2.2模型的判定、标本的采集及处理
药物干预3月后予禁食一晚，第二天测体重、空腹血糖。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，予四维彩超检测腹主动脉内中膜厚度情况。心尖处抽血约5ml，分离血清置于-20℃冰箱保存以检测炎症因子指标。分离出腹主动脉，置入10%的甲醛中固定以留作HE染色、免疫组化检测。以腹主动脉四维彩超检测及病理切片结果来判定高脂饮食并发大血管病变模型制备成功与否。
2.3 血生化指标测定
全自动生化分析仪测定空腹血糖及糖化血红蛋白，放射免疫分析法检测空腹胰岛素，计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）：FBG×FINS/22.5。根据2010 年美国糖尿病协会糖尿病指南的标准： HOMA-IR>2.69为有胰岛素抵抗的标准。
2.4 血清炎症因子测定
血清ICAM-1、VCAM-1及hs-CRP检测均采用酶联免疫吸附法（ELISA），操作严格按说明书进行，简述如下：系列稀释的ICAM-1、VCAM-1及hs-CRP标准品和稀释的待测血清100ul加入96孔酶标板，37℃温育2小时，再加生物素标记的抗ICAM-1、VCAM-1或hs-CRP抗体50ul，37℃温育1小时，洗涤液洗3次，每孔加100ul辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，室温下孵育20分钟。
2.5 结果判定 采用盲法评估。
2.5.1四维彩超结果分析
采用频率20-40MHz的四维彩超检测大鼠腹主动脉内中膜的厚度，根据IMT数值来判断促动脉粥样硬化饮食合并大血管病变模型建立成功与否以及利拉鲁肽对大鼠腹主动脉内中膜的影响。
2.6 统计学处理
用SPSS13.0统计分析软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（X± s）表示，两组间比较用独立样本t检验，各组之间比较用单因素方差分析（One-way ANOVA），方差齐时两组之间比较采用S-N-K检验，方差不齐时用Dunnet检验，多有结果均以P<0.05为差异有统计学意义。
结果
1、实验动物一般情况、糖化血红蛋白、胰岛素抵抗水平的比较
对照组大鼠一般情况良好，行动敏捷，皮毛有光泽；HFD组大鼠行动迟缓，精神萎靡，体重增加（P<0.05）；低剂量利拉鲁肽预组大鼠体重较HFD组有所减轻；高剂量利拉鲁肽干预组一般状况优于低剂量组，体重较低剂量组减轻。与对照组比较，HFD组大鼠糖化血红蛋白水平、胰岛素抵抗指数明显升高（P<0.05）；与HFD组比较，利拉鲁肽干预组相应指标均有降低（P<0.05），其中以高剂量利拉鲁肽干预组血糖水平降低更为显著（表1）。
表1 四组大鼠体重、糖化血红蛋白、HOMA-IR的比较（X± s）
注：a与ND组比较， P<0.05；b与HFD组比较， P<0.05；c与HFD+LLID组比较， P<0.05。
2、各组大鼠腹主动脉四维彩超检测结果
与对照组比较，HFD组大鼠腹主动脉内中膜厚度明显增加（P<0.05）；与HFD组比较，利拉鲁肽干预组腹主动脉内中膜厚度减少（P<0.05），其中高剂量利拉鲁肽干预组腹主动脉内中膜厚度减少更为明显（图1）。
图1 各组大鼠腹主动脉IMT四维彩超结果比较
注：a与ND组比较， P<0.05；b与HFD组比较， P<0.05；c与HFD+LLID组比较， P<0.05。
3、各组大鼠血清炎症因子检测结果
与对照组相比，高脂饮食组大鼠血清hs-CRP、ICAM-1、VCAM-1升高；与高脂饮食组相比，利拉鲁肽干预组大鼠血清hs-CRP、ICAM-1、VCAM-1水平有所减轻，以高剂量利拉鲁肽干预组改善更明显（P<0.05）（表2）。
表2 四组大鼠血清hs-CRP、ICAM-1、VCAM-1的比较（X± s）
注：a与ND组比较， P<0.05；b与HFD组比较， P<0.05；c与HFD+LLID组比较， P<0.05。
讨论
心脑血管疾病是2型糖尿病的主要并发症，而动脉粥样硬化是心脑血管疾病的主要病理基础。炎症反应贯穿动脉粥样硬化发生发展的整个过程：细胞间粘附分子（ICAM） 及血管细胞粘附分子（VCAM） 等炎症因子介导了单核细胞向内皮细胞迁移、粘附和穿越内皮的过程。血管内皮炎症的长期存在诱发了炎症反应的级联放大，促使血管平滑肌细胞增殖并越过内弹力板层进入动脉内膜，表达大量的细胞因子和粘附分子，进而恶化炎症反应，并促进动脉粥样硬化中细胞外基质形成。另外，炎症反应在动脉粥样硬化斑块破裂中也发挥着重要作用[5]。因此，抑制炎症反应是预防2型糖尿病大血管病变的有效途径。
利拉鲁肽是一种长效GLP-1类似物，在2型糖尿病患者控制体重、抑制食欲、调节血糖、延缓胰岛β细胞凋亡等方面发挥了独特的优势。近期多项的研究结果显示，利拉鲁肽可能通过降低血压、抑制氧化应激、调节血脂谱等多种机制发挥对心血管系统的保护作用[6]。本实验通过高脂饮食喂养的方法，复制了糖尿病大血管病变的大鼠模型。实验结果表明：利拉鲁肽能够降低高脂饮食喂养大鼠的糖化血红蛋白水平，改善胰岛素抵抗，并能够降低实验动物血清hs-CRP、ICAM-1、VCAM-1等炎症因子水平，从而可能发挥对大血管病变的保护作用，但其确切机制仍有待进一步研究。 参考文献：
[1] Sarruf DA，Thaler JP，Morton GJ，et al. Fibroblast growth factor 21 action in the brain increases energy expenditure and insulin sensitivity in obese rats [J]. Diabetes，2010，59：1817-1824.
[2] 洪涛 文芳 文格波，等.利拉鲁肽对高脂饮食喂养大鼠的血脂谱的调节作用[J].中国医药导报， 2012， 19：16-17.
[3] Varanasi A， Patel P， Makdissi A， et al. Clinical use of liraglutide in type 2 diabetes and its effects on cardiovascular risk factors. Endocr Pract. 2012 ， 18（2）：140-145.
[4] Arakawa M， Mita T， Azuma K， Ebato C， Goto H， Nomiyama T， Fujitani Y， Hirose T，Kawamori R， Watada H. Inhibition of monocyte adhesion to endothelial cells and attenuation of atherosclerotic lesion by a glucagon-like peptide-1 receptor agonist， exendin-4. Diabetes. 2010 Apr；59（4）：1030-7.
[5] Libby P， Okamoto Y， Rocha VZ， Folco E. Inflammation in atherosclerosis： transition from theory to practice. Circ J. 2010 Feb；74（2）：213-20.
[6] Shiraki A， Oyama J， Komoda H， Asaka M， Komatsu A， Sakuma M， Kodama K， Sakamoto Y， Kotooka N， Hirase T， Node K. The glucagon-like peptide 1 analog liraglutide reduces TNF-α-induced oxidative stress and inflammation in endothelial cells. Atherosclerosis. 2012 Apr；221（2）：375-82.