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摘要
采用形态学结合分子系统学方法对引起贵州黄平县和六枝道地中药材种植基地太子参叶斑病的病原菌进行鉴定，并以菌丝生长法对75%百菌清可湿性粉剂、70%甲基硫菌靈可湿性粉剂、37%苯醚甲环唑可湿性粉剂、40%氟硅唑乳油以及1%申嗪霉素悬浮剂进行了室内药效筛选。结果表明：引起贵州太子参叶斑病的病原菌为Ascochyta versabilis，该病原菌为太子参病害新记录；5种杀菌剂除75%百菌清可湿性粉剂2 000倍对A.versabilis的抑菌率较低外（51.4%），其余4种供试杀菌剂均具有较强的抑菌作用。70%甲基硫菌灵可湿性粉剂2 000倍、37%苯醚甲环唑可湿性粉剂2 000倍和40%氟硅唑乳油2 000倍对A.versabilis的生长具有较强的抑制作用，其抑制率均高于90%；1%申嗪霉素悬浮剂2 000倍对该病原菌的抑制率为72.3%。
关键词
太子参； Ascochyta versabilis； 分子系统学； 药剂筛选
中图分类号：
S 435.67
文献标识码： A
DOI： 10.16688/j.zwbh.2017284
Pathogen identification of leaf spot on Pseudostellaria heterophylla and
screening of fungicides for its control
LI Shujiang， ZHOU Xuelin， YANG Youlian
（School of Biological Sciences and Technology， Liupanshui Normal University， Liupanshui 553004， China）
Abstract
Based on morphological characteristics and ITS phylogeny analysis， the pathogen caused leaf spot on Pseudostellaria heterophylla was isolated and identified from Liuzhi and Huangping， Guizhou Province. The inhibition effects of chlorothalonil 75% WP， thiophanatemethyl 70% WP， difenoconazole 37% WP， flusilazole 40% EC， phenazino1carboxylic acid 1% SC on the pathogen of leaf spot were tested by mycelial growth method in laboratory. The results indicated that the pathogen was identified to be Ascochyta versabilis. Among the five fungicides， chlorothalonil 75% WP （2 000×） showed lower inhibition rates （51.4%） against A.versabilis， while the other four fungicides had good control efficacies， with the inhibition rates of more than 90% for difenoconazole 37% WP （2 000×）， thiophanatemethyl 70% WP （2 000×） and flusilazole 40% EC （2 000×）， and 72.3% for phenazino1carboxylic acid 1% SC （2 000×）， respectively.
Key words
Pseudostellaria heterophylla； Ascochyta versabilis； molecular phylogeny； screening of fungicides
太子参Pseudostellaria heterophylla （Miq.） Pax为石竹科孩儿参属植物，又名孩儿参、异叶假繁缕，含有环肽类、氨基酸、皂苷类、糖类、醛类、醇类、脂类、微量元素、类黄酮等化学成分。太子参为一种名贵中药材，以块根入药，具有益气健脾、生津润肺之功效[1]。目前，太子参野生资源已经非常稀缺，市售太子参主要来自人工栽培。安徽、江苏、福建、贵州为全国四大栽培主产区[23]，其中贵州黔东南州太子参栽培面积达1.39万hm2[3]，主要集中在施秉县和黄平县。
由于市场对太子参需求的增加，太子参人工种植区域及面积逐年扩大[4]，真菌病害的危害日益凸显，严重影响了太子参的产量和品质[46]。叶斑病是太子参主要真菌病害之一，贵州种植区域内的太子参都有叶斑病发生，一般情况下病株率0.1%～15%，严重时病株率达70%以上，产量损失达50%以上[7]。本研究对引起贵州六枝特区道地中药材种植基地和黄平县种植基地太子参真菌病害的病原菌进行分离鉴定， 并进行了室内防治药剂筛选，旨在为太子参叶斑病的病原识别及有效防治奠定基础。
1 材料与方法
1.1 病原标本采集与分离
2012年8月和2013年8月分别从六枝特区道地中药材种植基地和黄平县一碗水乡太子参种植基地采集具有真菌感染特征的叶片（图1a），装入信封带回实验室，采用水琼脂培养基（WA）和马铃薯葡萄糖培养基（PDA）以单胞分离法[8]分离病原菌，分离菌株4℃斜面保存。 1.2 病原菌的鉴定
1.2.1 形态学鉴定
在体视显微镜下挑取病斑上的分生孢子器观察孢子及产孢结构的形态特征。用直径为5 mm的打孔器从PDA培养基25℃活化5 d的平板菌落边缘打取菌饼，移至新的PDA培养基上培养，每株菌株接5皿，在25℃下12 h黑光灯12 h黑暗交替培养。7 d后采取十字交叉法测定菌株生长速率、观察菌落及分生孢子等特征。
1.2.2 分子系统学分析
1.2.2.1 菌丝体收集、DNA提取及ITS扩增与测序
将供试菌株分别接种于PDA平板上，25℃恒温培养14 d，用无菌刀刮取菌丝体置于1.5 mL无菌离心管中，参考Chen等的方法提取基因组DNA[9]，并电泳检测。采用引物ITS1/ITS4 （CCGTAGGTGAACCTGCGG/TCCTCCGCTTATTGATATGC）对rDNA的ITS序列进行扩增，扩增产物送往北京诺赛基因有限公司测序。
1.2.2.2 ITS分子系统学分析
采用Clustal X 2.0.10对测得的ITS序列以及从GenBank下载的相关序列进行比对（图2）。为实现排序匹配的最优化，再用Bioedit 5.0.6软件手工校正。比对后的序列采用PAUP* 4.0 Beta 10软件以最大简约法（maximum parsimony， MP）进行分析，以启发式搜索法（heuristic search）获取系统发育树。其中，启发式搜索采用二等分再连接法（treebisectionreconnection， TBR）作为获取聚类树的方法。系统发育树的各个分支的支持强度通过1 000次重复的自展检验数值进行评估。
1.3 室内药效试验
供试药剂为75%百菌清WP，先正达苏州作物保护有限公司；70%甲基硫菌灵WP，上海沪联生物药企业有限公司；37%苯醚甲环唑WP，瑞士先正达作物有限公司；40%氟硅唑EC，上海科捷佳实业有限公司和1%申嗪霉素SC，上海农乐生物制品股份有限公司。
用约60℃的无菌PDA培养基将各药剂稀释2 000倍，制成含杀菌剂的PDA培养基备用。
采用生长速率法测定不同药剂对病原菌生长的影响。在含杀菌剂的PDA培养基中接入活化好的供试菌株菌饼（d=5 mm），置于25℃培养箱中黑暗培养，14 d后用“十字交叉法”测量菌落直径，用以下公式计算抑菌率[10]。每种药剂设4个重复，以无菌水作为对照。
抑菌率=对照菌落直径-处理菌落直径对照菌落直径-5×100%。
抑菌率以 SPSS 22.0 软件，采用Oneway ANOVA test方法通过 Duncan’s检验分析各药剂处理之间的差异显著性。
2 结果与分析
2.1 病症特征及病原菌分离
太子参感病后，初期叶片上出现近圆形病斑，水渍状，随后病斑增大并变成黄褐色枯斑，由内向外逐渐形成由分生孢子器形成的明显黑色轮纹（图1a）。采用单孢分离法共分离到5株病原菌，其中从六枝特区道地中药材种植基地分离到3株：LPSU2012200、LPSU2012201、LPSU2012202；从黄平县分离到2株：LPSU2013231、LPSU2013232。
2.2 病原菌鉴定
2.2.1 形态学特征
病原菌产生的分生孢子器在寄主叶片表皮下着生，黑色，随着孢子成熟，分生孢子器突破表皮明显隆起，具孔口（图1b～c）；分生孢子单孢，无色，短柱状或长椭圆形，偶略弯曲，两端钝圆，中部偶有缢缩，无色；大小（7.5～12）μm×（3～5.5）μm，平均（9.7±1.5）μm×（4.3±0.6）μm（n=50）（图1f）。在PDA培养基上培养10 d后，菌落正面绒毛状，圆形，墨绿色，边缘近白色略灰，紧贴培养基生长；反面墨绿色，圆形，边缘一圈白色略灰（图1d～e）。菌落平均直径3.3 cm，平均生长速度0.47 cm/d。在PDA上纯培养未见孢子形成。
2.2.2 分子系统学鉴定
结合纯培养菌落和显微形态特征，分离的5株菌株为同一病原菌，选择2株代表性菌株进行分子系统学分析。所选菌株ITS在GenBank的登录号为MF577046、MF577047。以PAUP*4.0 Beta 10软件构建的代表性菌株及相关序列的最大简约树如图2所示。从系统树可看出，供试菌株LPSU2012202和LPSU2012201与Ascochyta versabilis （GU237913和GU237909）聚成一簇，支持率为88%。
根据病原菌形态学特征和ITS分子系统学分析，引起黄平县及六枝太子参叶斑病的病原菌为Ascochyta versabilis （Boerema et al.） Q. Chen
采用形态学结合分子系统学方法对引起贵州黄平县和六枝道地中药材种植基地太子参叶斑病的病原菌进行鉴定，并以菌丝生长法对75%百菌清可湿性粉剂、70%甲基硫菌靈可湿性粉剂、37%苯醚甲环唑可湿性粉剂、40%氟硅唑乳油以及1%申嗪霉素悬浮剂进行了室内药效筛选。结果表明：引起贵州太子参叶斑病的病原菌为Ascochyta versabilis，该病原菌为太子参病害新记录；5种杀菌剂除75%百菌清可湿性粉剂2 000倍对A.versabilis的抑菌率较低外（51.4%），其余4种供试杀菌剂均具有较强的抑菌作用。70%甲基硫菌灵可湿性粉剂2 000倍、37%苯醚甲环唑可湿性粉剂2 000倍和40%氟硅唑乳油2 000倍对A.versabilis的生长具有较强的抑制作用，其抑制率均高于90%；1%申嗪霉素悬浮剂2 000倍对该病原菌的抑制率为72.3%。
关键词
太子参； Ascochyta versabilis； 分子系统学； 药剂筛选
中图分类号：
S 435.67
文献标识码： A
DOI： 10.16688/j.zwbh.2017284
Pathogen identification of leaf spot on Pseudostellaria heterophylla and
screening of fungicides for its control
LI Shujiang， ZHOU Xuelin， YANG Youlian
（School of Biological Sciences and Technology， Liupanshui Normal University， Liupanshui 553004， China）
Abstract
Based on morphological characteristics and ITS phylogeny analysis， the pathogen caused leaf spot on Pseudostellaria heterophylla was isolated and identified from Liuzhi and Huangping， Guizhou Province. The inhibition effects of chlorothalonil 75% WP， thiophanatemethyl 70% WP， difenoconazole 37% WP， flusilazole 40% EC， phenazino1carboxylic acid 1% SC on the pathogen of leaf spot were tested by mycelial growth method in laboratory. The results indicated that the pathogen was identified to be Ascochyta versabilis. Among the five fungicides， chlorothalonil 75% WP （2 000×） showed lower inhibition rates （51.4%） against A.versabilis， while the other four fungicides had good control efficacies， with the inhibition rates of more than 90% for difenoconazole 37% WP （2 000×）， thiophanatemethyl 70% WP （2 000×） and flusilazole 40% EC （2 000×）， and 72.3% for phenazino1carboxylic acid 1% SC （2 000×）， respectively.
Key words
Pseudostellaria heterophylla； Ascochyta versabilis； molecular phylogeny； screening of fungicides
太子参Pseudostellaria heterophylla （Miq.） Pax为石竹科孩儿参属植物，又名孩儿参、异叶假繁缕，含有环肽类、氨基酸、皂苷类、糖类、醛类、醇类、脂类、微量元素、类黄酮等化学成分。太子参为一种名贵中药材，以块根入药，具有益气健脾、生津润肺之功效[1]。目前，太子参野生资源已经非常稀缺，市售太子参主要来自人工栽培。安徽、江苏、福建、贵州为全国四大栽培主产区[23]，其中贵州黔东南州太子参栽培面积达1.39万hm2[3]，主要集中在施秉县和黄平县。
由于市场对太子参需求的增加，太子参人工种植区域及面积逐年扩大[4]，真菌病害的危害日益凸显，严重影响了太子参的产量和品质[46]。叶斑病是太子参主要真菌病害之一，贵州种植区域内的太子参都有叶斑病发生，一般情况下病株率0.1%～15%，严重时病株率达70%以上，产量损失达50%以上[7]。本研究对引起贵州六枝特区道地中药材种植基地和黄平县种植基地太子参真菌病害的病原菌进行分离鉴定， 并进行了室内防治药剂筛选，旨在为太子参叶斑病的病原识别及有效防治奠定基础。
1 材料与方法
1.1 病原标本采集与分离
2012年8月和2013年8月分别从六枝特区道地中药材种植基地和黄平县一碗水乡太子参种植基地采集具有真菌感染特征的叶片（图1a），装入信封带回实验室，采用水琼脂培养基（WA）和马铃薯葡萄糖培养基（PDA）以单胞分离法[8]分离病原菌，分离菌株4℃斜面保存。 1.2 病原菌的鉴定
1.2.1 形态学鉴定
在体视显微镜下挑取病斑上的分生孢子器观察孢子及产孢结构的形态特征。用直径为5 mm的打孔器从PDA培养基25℃活化5 d的平板菌落边缘打取菌饼，移至新的PDA培养基上培养，每株菌株接5皿，在25℃下12 h黑光灯12 h黑暗交替培养。7 d后采取十字交叉法测定菌株生长速率、观察菌落及分生孢子等特征。
1.2.2 分子系统学分析
1.2.2.1 菌丝体收集、DNA提取及ITS扩增与测序
将供试菌株分别接种于PDA平板上，25℃恒温培养14 d，用无菌刀刮取菌丝体置于1.5 mL无菌离心管中，参考Chen等的方法提取基因组DNA[9]，并电泳检测。采用引物ITS1/ITS4 （CCGTAGGTGAACCTGCGG/TCCTCCGCTTATTGATATGC）对rDNA的ITS序列进行扩增，扩增产物送往北京诺赛基因有限公司测序。
1.2.2.2 ITS分子系统学分析
采用Clustal X 2.0.10对测得的ITS序列以及从GenBank下载的相关序列进行比对（图2）。为实现排序匹配的最优化，再用Bioedit 5.0.6软件手工校正。比对后的序列采用PAUP* 4.0 Beta 10软件以最大简约法（maximum parsimony， MP）进行分析，以启发式搜索法（heuristic search）获取系统发育树。其中，启发式搜索采用二等分再连接法（treebisectionreconnection， TBR）作为获取聚类树的方法。系统发育树的各个分支的支持强度通过1 000次重复的自展检验数值进行评估。
1.3 室内药效试验
供试药剂为75%百菌清WP，先正达苏州作物保护有限公司；70%甲基硫菌灵WP，上海沪联生物药企业有限公司；37%苯醚甲环唑WP，瑞士先正达作物有限公司；40%氟硅唑EC，上海科捷佳实业有限公司和1%申嗪霉素SC，上海农乐生物制品股份有限公司。
用约60℃的无菌PDA培养基将各药剂稀释2 000倍，制成含杀菌剂的PDA培养基备用。
采用生长速率法测定不同药剂对病原菌生长的影响。在含杀菌剂的PDA培养基中接入活化好的供试菌株菌饼（d=5 mm），置于25℃培养箱中黑暗培养，14 d后用“十字交叉法”测量菌落直径，用以下公式计算抑菌率[10]。每种药剂设4个重复，以无菌水作为对照。
抑菌率=对照菌落直径-处理菌落直径对照菌落直径-5×100%。
抑菌率以 SPSS 22.0 软件，采用Oneway ANOVA test方法通过 Duncan’s检验分析各药剂处理之间的差异显著性。
2 结果与分析
2.1 病症特征及病原菌分离
太子参感病后，初期叶片上出现近圆形病斑，水渍状，随后病斑增大并变成黄褐色枯斑，由内向外逐渐形成由分生孢子器形成的明显黑色轮纹（图1a）。采用单孢分离法共分离到5株病原菌，其中从六枝特区道地中药材种植基地分离到3株：LPSU2012200、LPSU2012201、LPSU2012202；从黄平县分离到2株：LPSU2013231、LPSU2013232。
2.2 病原菌鉴定
2.2.1 形态学特征
病原菌产生的分生孢子器在寄主叶片表皮下着生，黑色，随着孢子成熟，分生孢子器突破表皮明显隆起，具孔口（图1b～c）；分生孢子单孢，无色，短柱状或长椭圆形，偶略弯曲，两端钝圆，中部偶有缢缩，无色；大小（7.5～12）μm×（3～5.5）μm，平均（9.7±1.5）μm×（4.3±0.6）μm（n=50）（图1f）。在PDA培养基上培养10 d后，菌落正面绒毛状，圆形，墨绿色，边缘近白色略灰，紧贴培养基生长；反面墨绿色，圆形，边缘一圈白色略灰（图1d～e）。菌落平均直径3.3 cm，平均生长速度0.47 cm/d。在PDA上纯培养未见孢子形成。
2.2.2 分子系统学鉴定
结合纯培养菌落和显微形态特征，分离的5株菌株为同一病原菌，选择2株代表性菌株进行分子系统学分析。所选菌株ITS在GenBank的登录号为MF577046、MF577047。以PAUP*4.0 Beta 10软件构建的代表性菌株及相关序列的最大简约树如图2所示。从系统树可看出，供试菌株LPSU2012202和LPSU2012201与Ascochyta versabilis （GU237913和GU237909）聚成一簇，支持率为88%。
根据病原菌形态学特征和ITS分子系统学分析，引起黄平县及六枝太子参叶斑病的病原菌为Ascochyta versabilis （Boerema et al.） Q. Chen