【摘 要】
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目的:克隆湖北白猪CD154基因,并在大肠杆菌及HeLa细胞中表达.方法:利用RT-PCR方法从湖北白猪外周血单核细胞中扩增出猪CD154基因的完整编码区,进一步PCR扩增获得缺失信号肽、
【机 构】
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华中农业大学动物医学院病毒室,农业微生物学国家重点实验室
【基金项目】
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国家重点基础研究发展计划(973计划);
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目的:克隆湖北白猪CD154基因,并在大肠杆菌及HeLa细胞中表达.方法:利用RT-PCR方法从湖北白猪外周血单核细胞中扩增出猪CD154基因的完整编码区,进一步PCR扩增获得缺失信号肽、跨膜区的截短型CD154,将其克隆至原核表达载体pQE-80L的6×His下游,获得原核表达质粒pQE-tCD154,转化大肠杆菌DH5α进行诱导表达.同时,将完整CD154基因克隆至真核表达载体pEGFP-C1的EGFP基因下游,获得融合蛋白表达质粒pEGFP-C1-CD154,转染HeLa细胞进行表达.结果:原核表达质粒pQE-tCD154,转化大肠杆菌DH5α诱导表达出相对分子量(Mr)为29 000的融合表达蛋白6×His-tCD154,Western blot分析证实表达的融合蛋白能与抗6×His的单克隆抗体(mAb)发生特异性反应.融合蛋白表达质粒pEGFP-C1-CD154,转染HeLa细胞,荧光显微镜观察到EGFP-CD154融合蛋白的表达主要定位于细胞膜.结论:成功地克隆并表达了猪CD154基因.
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