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目的
确定问号钩端螺旋体vWF-A基因产物结合人胶原蛋白的作用与机制。
方法采用生物信息学软件分析问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株vWF-A基因(LA_0012、LA_0697和LA_4207)产物结构与功能。构建上述基因vWF-A功能结构域片段原核表达系统，采用SDS-PAGE和Ni-NTA亲和层析法检查目的重组蛋白rLep0012、rLep0697和rLep4207表达情况和提纯效果。采用ELISA和表面等离子共振法(SPR)检测目的重组蛋白与人Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅵ型胶原蛋白(hCOL1/3/4/6)的结合能力。采用实时荧光定量RT-PCR和Western blot检测问号钩端螺旋体赖株感染人和小鼠血管内皮细胞(HUVEC和EOMA)时vWF-A基因转录和表达水平变化。
结果vWF-A基因产物均为含vWF-A超家族结构域表面或跨膜蛋白，但LA_0697和LA_4207基因还含有金属离子依赖性黏附位点(MIDAS)。所构建的原核表达系统能有效表达目的重组蛋白，Ni-NTA亲和层析法提纯后SDS-PAGE检测均显示为单一蛋白条带。ELISA结果显示rLep0697与hCOL3/6、rLep4207与hCOL1/4呈强结合。SPR结果显示rLep0697快速结合hCOL3/6但快速解离(KD值＝5.71×10-8和5.89×10-8 mol/L)，rLep4207快速并稳定结合hCOL1/4(KD值＝6.4×10-9和3.2×10-9 mol/L)。感染HUVEC和EOMA细胞时，上述vWF-A基因转录和表达水平均显著升高(P<0.05)。
结论LA_0697和LA_4207基因产物可作为问号钩端螺旋体感染过程中的黏附因子。