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【摘 要】目的：利用RT-PCR检测CK19mRNA技术，从分子水平探讨在青年结直肠肠癌患者区域淋巴结微转移的价值及临床意义。方法：采用RT-PCR扩增对角蛋白CK19检测，对30例结直肠癌患者的癌组织标本和108个淋巴结进行检测，检测良性疾病结直肠（结直肠息肉、憩室等）手术的20例患者的正常肠周淋巴结20枚作为对照组，同时行常规病理检查。结果：30例结直肠癌患者均有CK19mRNA表达 108个淋巴结中有47个存在CK19mRNA阳性表达，阳性率 43.5%；常规病理检查有25枚有癌转移，阳性率23.2 %；20例良性病变患者30枚淋巴结CK19mRNA表达为阴性。结论：RT-PCR扩增CK19mRNA检测结直肠癌区域淋巴结微转移是一种敏感而特异性检测方法，对青年结直肠肠癌患者指导治疗有较大的临床意义。
【关键词】青年结直肠癌；微转移；淋巴结；聚合酶链反应
【中图分类号】R56 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）03-0189-02
结直肠癌是世界上胃肠道恶性肿瘤的重要死因，在美国位居第一位【1】。，随着人们生活方式和饮食习惯的改变，在我国近20年来尤其在大城发病率明显上升，且有明显的年轻化趋势；临床工作发现，青年结直肠癌患者，发现晚、恶性程度高、预后差，对家庭、社会危害影响更大。因此对青年结直肠癌患者更应特别关注。目前外科手术治疗依旧结直肠癌患者首选方法，由于临床ⅠⅡ期病例尚缺乏全身辅助化疗对延长生存期有力证据，临床上多数不进行化疗。然而临床上有20%～30%的局限于肠壁、“无转移”的早期病例，虽然施行标准根治术，但术后易复发，影响了术后5年生存率。究其原因，最可能解释是微转移（micrometastasis，MM）将临床期Ⅲ的漏诊，而未行化疗。随着对于结直肠癌诊治的研究提高。逐渐认识到淋巴结转移是影响结直肠癌患者预后的最重要因素之一，近几年来，不少学者通过研究结直肠癌淋巴结的微转移来提高结直肠癌治疗效果以期改善预后，提高5年生存率。细胞角蛋白（cytokeratin，CK）是细胞骨架系统中间丝组成成分之一。广泛存在于上皮组织细胞中，而间叶组织中缺乏表达，故成为上皮肿瘤细胞较为敏感和特异的指标，由于它在正常淋巴结中不表达，因而最常用来检测微转移的标记物【2】。RT-PCR被认为是检测隐匿性癌转移的高度敏感的方法，本文探讨RT-PCR检测CK19mRNA在诊断青年（40岁以下）结直肠癌患者区域淋巴结微转移的价值及其临床应用。
1 材料与方法
1.1 病历选择 收集2007年9月至2011年9月在我科行结直肠根治性切除40岁以下结直肠癌患者30例行根治术，排除合并其它脏器肿瘤或者术前行辅助化疗的病例。其中男性17例，女性13例；所有病例临床病理特征根据1997年UICC 淋巴结分类Ⅰ期5例，Ⅱ期13例，Ⅲ期7例，Ⅳ期5例；共采集肿瘤标本的30例；淋巴结108个。另取同期因良性疾病结直肠（结直肠息肉、憩室等）手术的20例患者的正常肠周淋巴结20枚作为对照组。每个新鲜淋巴结标本平均分为两块（每次切开淋巴结之前，用生理盐水冲洗刀片，以免造成污染），一块用福尔马林固定，石蜡包埋后切片行常规病理检查（HE染色），另一块经液氮速冻后-
80℃ 保存用于提取RNA。对于常规病理检查无淋巴结转移患者的淋巴结标本提取RNA。
1.2 引物设计 引物由上海生工公司合成。CK19引物的序列设计见表1
1.3 总RNA抽提及鉴定 30例结直肠癌组织，108枚淋巴结和20例正常组织分别加入提起试剂（Invitrogen）1ml，电动匀浆1～2min，匀浆液室温放置5min后加氯仿200?l，震荡15s，12000r/min4℃离心15min；上层水相移人另一Eppendorf管中，加入异丙醇500?l混匀室温放置10 min。4℃12000 r/min离心15 min，弃掉上清，加1ml75%乙醇洗涤RNA沉淀，7500 r/min， 4℃离心5min，弃掉上清。
1.4 依据RT—PCR试剂盒说明书 在美国产MJ—Research扩增仪上，将反应体系混匀后进行扩增，逆转录体积为50?l。扩增步骤如下：（1）42℃孵育30min；（2）95℃孵育3min；（3）95℃预变性10s；（4）55℃预变性30s；（5）72℃ 1min ；（6）重复3～5步骤4次；（7）95℃预变性5s；（8）60℃预变性30s；（9）读取；（10）重复7～9步骤35次；（11）；40℃预变性1s。用紫外分光光度仪定量观察并照相记录结果。
2 结果
患者常规病理组织学方法检查确诊为结直肠癌患者，RT-PCR法同时检测30例结直肠癌患者大体标本均有CK19mRNA表达；108个淋巴结中有47个存在CK19mRNA阳性表达，阳性率 43.5%；常规病理检查有25枚有癌转移，阳性率23.2 % RT-PCR方法和常规病理方法比较差异有统计学意义；20例良性病变患者30枚淋巴结中CK19mRNA表达为阴性。CK19mRNA在结直肠癌组织及淋巴结中表达（图-1）
3 讨论
1980年由Sloane首先提出微转移细胞概念以来，大量的研究工作集中到各种上皮源性肿瘤患者的淋巴结，骨髓和血液微转移状况对预后的影响，目前微转移已逐渐被接受为一项有用的指标，用来确定癌症患者的肿瘤分期。结直肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一，在我国近20年来尤其在大城发病率明显上升，且有年轻化趋势。目前结直肠癌治疗疗效较过去已经明显提高，但转移和远处复发依旧是治疗失败的主要原因。探求高特异性的肿瘤转移潜力和临床预后的预测指标，并探讨高敏感的检测手段以指导临床综合治疗已成为临床肿瘤研究的特点。常规病理未发现淋巴结转移，术后复发率高达近一半【3】。最可能解释是微转移（micrometastasis，MM）将临床期Ⅲ的漏诊，而未行化疗。微转移是指在非血液系统恶性肿瘤的发展过程中，播散并存活于淋巴系统、骨髓、肝等组织器官中的微小瘤灶，常无临床表现，而这正是造成肿瘤转移或复发重要原因之一，也是目前肿瘤防治中被关注热点之一。目前研究认为可能是淋巴系统、骨髓、肝等组织器官中的微小瘤灶导致结直肠癌临床无法及时和正确治疗。故淋巴结转移是影响结直肠癌预后的最主要因素之一。传统病理学检查是通过对其具有代表性的一个切面经HE染色作普通光镜检查得知的，但阳性率较低，漏诊率较高。文献报道漏诊率高达10～30%【4】因此，寻求高特异性、高敏感性的及时准确判断淋巴结有无早期转移具有重要临床意义。随着分子生物技术发展，利用分子生物技术可以发现常规HE染色不能发现的单个癌细胞，由于这些微转移可能发展为致命显性，故微转移的检测目前为人们重视并成为肿瘤研究热点。 细胞角蛋白（cytokeratin CK）是上皮细胞骨架的组成成分，表达在正常的上皮及上皮源性肿瘤及其转移肿瘤细胞，CK家族由分子量为40×.103～68×103U不等的20个成员组成，CK19常见的角蛋白之一，其表达范围严格，它非常局限在胃肠上皮细胞，几乎所有结直肠癌都明显的表达，CK19是上皮细胞细胞的标志性基因，已有研究表CK19在结直肠癌细胞株的表达达100%；且在侵袭、转移、扩散到其它组织器官始终保持稳定。可作为结直肠在淋巴结、骨骼和外周血等间叶组织转移的标记物。正常骨髓、血液、淋巴组织中不表达，因其具有较高的敏感性和特异性而被应用于肿瘤微转移的检测，结直肠癌区域淋巴结阳性表达表示存在转移，通过检测CK19的表达可监测结直肠癌淋巴转移。
许多文献报道，通过免疫组织化学，检测某种上皮源性抗原，其淋巴结转移癌检出率比HE染色高，但这种方法多采用连续切片，既耗费时间又不切实际，临床病理常规检查难以实现，而且，免疫组织化学是对一个淋巴切面的检测。RT-PCR技术 具有敏感性高、特异性强，能够万倍的扩增特异性的DNA片段，具有简单快速的优点。可在106～107个正常细胞中检测出1个癌细胞【5，6】。通过这种方法，我们可以了解整个淋巴结的转移情况。其检测结果直观，易于判断，避免常规病理学检测时带有的主观性。结直肠癌是常见的来源于上皮组织的恶性肿瘤之一，本研究利用RT-PCR方法检测结直肠癌区域淋CK19的表达，应用RT-PCR检测CK19mRNA，对30例结直肠癌患者的癌组织标本和108个肠旁、系膜及系膜旁淋巴结转移情况进行检测，检测良性疾病结直肠（结直肠息肉、憩室等）手术的20例患者的正常肠周淋巴结20枚作为对照组。结果表明30例结直肠癌患者均有CK19mRNA表达， 108个淋巴结中有47个存在CK19mRNA阳性表达，阳性率 43.5%；常规病理检查有25枚有癌转移，阳性率23.2 %；20例良性病变患者30枚淋巴结CK19mRNA表达为阴性。提示RT-PCR方法对检测CK19mRNA具有很高特异性，应尽可能在临床上推广应用这一方法。本研究显示K19 mRNA在癌组织、有转移的淋巴结中有表达，而在非肿瘤的正常淋巴结不表达，说明K19mRNA特异性高，验证CK19可作为结直肠癌区域淋巴结微转移特异性。表明该技术对结直肠癌淋巴结微转移检测具有高敏感性，因结直肠癌淋巴结转移直接影响结直肠癌预后，提示手术中应规范行淋巴结切除，术后对高危患者要采取即时、适当的综合治疗，如对结直肠癌行新辅助放化疗及辅助化疗，规范化疗、联用靶向治疗药物。许多研究表明，微转移的患者预后明显差于无转移者，无淋巴转移结直肠癌患者，五年生存率高达90%，反之则减半【7】本研究通过RT—PCR法扩增检测K19 mRNA来判断结直肠癌淋巴结微转移比常规病理组织学检查敏感且特异性高，可测出低水平表达的K19 mRNA，及时发现常规病理无法发现的淋巴结隐匿转移即微转移，筛选出高度复发危险的患者，提高了淋巴结转移诊断率，有助于对淋巴结转移灶作出早期诊断，提高肿瘤分期准确性从而更好地制定术后个体性化疗方案。早期结直肠癌患者，只要淋巴结发现有微转移，则预后差，术后需要行化疗等综合治疗，而不存在淋巴结转移，术后可不化疗，从而可以节省社会医保资源，减轻病人痛苦。
参考文献：
[1] Saha S，Wiese D，Badin J，et al.Technical details of sentinel lymph node mapping in colorectal cancer and its impact on staging [J] Ann Surg Oncol，2000， 7：120-124
[2] Onishi A， Nakashiro K， Mihara M，et al.Basic and clinical studies on quantitative analysis of lymph node micrometastasis in oral cancer [J].Oncol Rep，2004，11（1）：33-39
[3] HayashiN，Ito I，Yanagisawa A，et al.Genentic diagnosis of lymph-node metastasis in colorectal cancer [J].Lancet，1995，345（8960）：1527
[4] Palmqvist R， Engaras B， Lindmark G， et al.Prediagnostic levels of carcinoembryonic antigen and CA242 in colorectal cancer：a matched case-control study[J].Dis Colon Rectum，2003，46（11）：1538-1544
[5] Schuler F，Dolken G.Detection and monitoring of minimal residual disease by quantitative real-time PCR[J].Clin Chim Acta，2006，363（1-2）：147-156
[6] Walker J，Quirke P.Prognosis and response to thempy in colorectal cancer[J].Eur J Cancer， 2002，38（7）：880—886.
[7] Johnson DS， Wong JH.The impact on nodal staging of lymphatic mapping in carcinoma of the colon and rectum[J].Semin Oncol，2004，31（3）：403-408
基金项目：
东莞市科技局立项课题（编号201010515000102）
【关键词】青年结直肠癌；微转移；淋巴结；聚合酶链反应
【中图分类号】R56 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）03-0189-02
结直肠癌是世界上胃肠道恶性肿瘤的重要死因，在美国位居第一位【1】。，随着人们生活方式和饮食习惯的改变，在我国近20年来尤其在大城发病率明显上升，且有明显的年轻化趋势；临床工作发现，青年结直肠癌患者，发现晚、恶性程度高、预后差，对家庭、社会危害影响更大。因此对青年结直肠癌患者更应特别关注。目前外科手术治疗依旧结直肠癌患者首选方法，由于临床ⅠⅡ期病例尚缺乏全身辅助化疗对延长生存期有力证据，临床上多数不进行化疗。然而临床上有20%～30%的局限于肠壁、“无转移”的早期病例，虽然施行标准根治术，但术后易复发，影响了术后5年生存率。究其原因，最可能解释是微转移（micrometastasis，MM）将临床期Ⅲ的漏诊，而未行化疗。随着对于结直肠癌诊治的研究提高。逐渐认识到淋巴结转移是影响结直肠癌患者预后的最重要因素之一，近几年来，不少学者通过研究结直肠癌淋巴结的微转移来提高结直肠癌治疗效果以期改善预后，提高5年生存率。细胞角蛋白（cytokeratin，CK）是细胞骨架系统中间丝组成成分之一。广泛存在于上皮组织细胞中，而间叶组织中缺乏表达，故成为上皮肿瘤细胞较为敏感和特异的指标，由于它在正常淋巴结中不表达，因而最常用来检测微转移的标记物【2】。RT-PCR被认为是检测隐匿性癌转移的高度敏感的方法，本文探讨RT-PCR检测CK19mRNA在诊断青年（40岁以下）结直肠癌患者区域淋巴结微转移的价值及其临床应用。
1 材料与方法
1.1 病历选择 收集2007年9月至2011年9月在我科行结直肠根治性切除40岁以下结直肠癌患者30例行根治术，排除合并其它脏器肿瘤或者术前行辅助化疗的病例。其中男性17例，女性13例；所有病例临床病理特征根据1997年UICC 淋巴结分类Ⅰ期5例，Ⅱ期13例，Ⅲ期7例，Ⅳ期5例；共采集肿瘤标本的30例；淋巴结108个。另取同期因良性疾病结直肠（结直肠息肉、憩室等）手术的20例患者的正常肠周淋巴结20枚作为对照组。每个新鲜淋巴结标本平均分为两块（每次切开淋巴结之前，用生理盐水冲洗刀片，以免造成污染），一块用福尔马林固定，石蜡包埋后切片行常规病理检查（HE染色），另一块经液氮速冻后-
80℃ 保存用于提取RNA。对于常规病理检查无淋巴结转移患者的淋巴结标本提取RNA。
1.2 引物设计 引物由上海生工公司合成。CK19引物的序列设计见表1
1.3 总RNA抽提及鉴定 30例结直肠癌组织，108枚淋巴结和20例正常组织分别加入提起试剂（Invitrogen）1ml，电动匀浆1～2min，匀浆液室温放置5min后加氯仿200?l，震荡15s，12000r/min4℃离心15min；上层水相移人另一Eppendorf管中，加入异丙醇500?l混匀室温放置10 min。4℃12000 r/min离心15 min，弃掉上清，加1ml75%乙醇洗涤RNA沉淀，7500 r/min， 4℃离心5min，弃掉上清。
1.4 依据RT—PCR试剂盒说明书 在美国产MJ—Research扩增仪上，将反应体系混匀后进行扩增，逆转录体积为50?l。扩增步骤如下：（1）42℃孵育30min；（2）95℃孵育3min；（3）95℃预变性10s；（4）55℃预变性30s；（5）72℃ 1min ；（6）重复3～5步骤4次；（7）95℃预变性5s；（8）60℃预变性30s；（9）读取；（10）重复7～9步骤35次；（11）；40℃预变性1s。用紫外分光光度仪定量观察并照相记录结果。
2 结果
患者常规病理组织学方法检查确诊为结直肠癌患者，RT-PCR法同时检测30例结直肠癌患者大体标本均有CK19mRNA表达；108个淋巴结中有47个存在CK19mRNA阳性表达，阳性率 43.5%；常规病理检查有25枚有癌转移，阳性率23.2 % RT-PCR方法和常规病理方法比较差异有统计学意义；20例良性病变患者30枚淋巴结中CK19mRNA表达为阴性。CK19mRNA在结直肠癌组织及淋巴结中表达（图-1）
3 讨论
1980年由Sloane首先提出微转移细胞概念以来，大量的研究工作集中到各种上皮源性肿瘤患者的淋巴结，骨髓和血液微转移状况对预后的影响，目前微转移已逐渐被接受为一项有用的指标，用来确定癌症患者的肿瘤分期。结直肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一，在我国近20年来尤其在大城发病率明显上升，且有年轻化趋势。目前结直肠癌治疗疗效较过去已经明显提高，但转移和远处复发依旧是治疗失败的主要原因。探求高特异性的肿瘤转移潜力和临床预后的预测指标，并探讨高敏感的检测手段以指导临床综合治疗已成为临床肿瘤研究的特点。常规病理未发现淋巴结转移，术后复发率高达近一半【3】。最可能解释是微转移（micrometastasis，MM）将临床期Ⅲ的漏诊，而未行化疗。微转移是指在非血液系统恶性肿瘤的发展过程中，播散并存活于淋巴系统、骨髓、肝等组织器官中的微小瘤灶，常无临床表现，而这正是造成肿瘤转移或复发重要原因之一，也是目前肿瘤防治中被关注热点之一。目前研究认为可能是淋巴系统、骨髓、肝等组织器官中的微小瘤灶导致结直肠癌临床无法及时和正确治疗。故淋巴结转移是影响结直肠癌预后的最主要因素之一。传统病理学检查是通过对其具有代表性的一个切面经HE染色作普通光镜检查得知的，但阳性率较低，漏诊率较高。文献报道漏诊率高达10～30%【4】因此，寻求高特异性、高敏感性的及时准确判断淋巴结有无早期转移具有重要临床意义。随着分子生物技术发展，利用分子生物技术可以发现常规HE染色不能发现的单个癌细胞，由于这些微转移可能发展为致命显性，故微转移的检测目前为人们重视并成为肿瘤研究热点。 细胞角蛋白（cytokeratin CK）是上皮细胞骨架的组成成分，表达在正常的上皮及上皮源性肿瘤及其转移肿瘤细胞，CK家族由分子量为40×.103～68×103U不等的20个成员组成，CK19常见的角蛋白之一，其表达范围严格，它非常局限在胃肠上皮细胞，几乎所有结直肠癌都明显的表达，CK19是上皮细胞细胞的标志性基因，已有研究表CK19在结直肠癌细胞株的表达达100%；且在侵袭、转移、扩散到其它组织器官始终保持稳定。可作为结直肠在淋巴结、骨骼和外周血等间叶组织转移的标记物。正常骨髓、血液、淋巴组织中不表达，因其具有较高的敏感性和特异性而被应用于肿瘤微转移的检测，结直肠癌区域淋巴结阳性表达表示存在转移，通过检测CK19的表达可监测结直肠癌淋巴转移。
许多文献报道，通过免疫组织化学，检测某种上皮源性抗原，其淋巴结转移癌检出率比HE染色高，但这种方法多采用连续切片，既耗费时间又不切实际，临床病理常规检查难以实现，而且，免疫组织化学是对一个淋巴切面的检测。RT-PCR技术 具有敏感性高、特异性强，能够万倍的扩增特异性的DNA片段，具有简单快速的优点。可在106～107个正常细胞中检测出1个癌细胞【5，6】。通过这种方法，我们可以了解整个淋巴结的转移情况。其检测结果直观，易于判断，避免常规病理学检测时带有的主观性。结直肠癌是常见的来源于上皮组织的恶性肿瘤之一，本研究利用RT-PCR方法检测结直肠癌区域淋CK19的表达，应用RT-PCR检测CK19mRNA，对30例结直肠癌患者的癌组织标本和108个肠旁、系膜及系膜旁淋巴结转移情况进行检测，检测良性疾病结直肠（结直肠息肉、憩室等）手术的20例患者的正常肠周淋巴结20枚作为对照组。结果表明30例结直肠癌患者均有CK19mRNA表达， 108个淋巴结中有47个存在CK19mRNA阳性表达，阳性率 43.5%；常规病理检查有25枚有癌转移，阳性率23.2 %；20例良性病变患者30枚淋巴结CK19mRNA表达为阴性。提示RT-PCR方法对检测CK19mRNA具有很高特异性，应尽可能在临床上推广应用这一方法。本研究显示K19 mRNA在癌组织、有转移的淋巴结中有表达，而在非肿瘤的正常淋巴结不表达，说明K19mRNA特异性高，验证CK19可作为结直肠癌区域淋巴结微转移特异性。表明该技术对结直肠癌淋巴结微转移检测具有高敏感性，因结直肠癌淋巴结转移直接影响结直肠癌预后，提示手术中应规范行淋巴结切除，术后对高危患者要采取即时、适当的综合治疗，如对结直肠癌行新辅助放化疗及辅助化疗，规范化疗、联用靶向治疗药物。许多研究表明，微转移的患者预后明显差于无转移者，无淋巴转移结直肠癌患者，五年生存率高达90%，反之则减半【7】本研究通过RT—PCR法扩增检测K19 mRNA来判断结直肠癌淋巴结微转移比常规病理组织学检查敏感且特异性高，可测出低水平表达的K19 mRNA，及时发现常规病理无法发现的淋巴结隐匿转移即微转移，筛选出高度复发危险的患者，提高了淋巴结转移诊断率，有助于对淋巴结转移灶作出早期诊断，提高肿瘤分期准确性从而更好地制定术后个体性化疗方案。早期结直肠癌患者，只要淋巴结发现有微转移，则预后差，术后需要行化疗等综合治疗，而不存在淋巴结转移，术后可不化疗，从而可以节省社会医保资源，减轻病人痛苦。
参考文献：
[1] Saha S，Wiese D，Badin J，et al.Technical details of sentinel lymph node mapping in colorectal cancer and its impact on staging [J] Ann Surg Oncol，2000， 7：120-124
[2] Onishi A， Nakashiro K， Mihara M，et al.Basic and clinical studies on quantitative analysis of lymph node micrometastasis in oral cancer [J].Oncol Rep，2004，11（1）：33-39
[3] HayashiN，Ito I，Yanagisawa A，et al.Genentic diagnosis of lymph-node metastasis in colorectal cancer [J].Lancet，1995，345（8960）：1527
[4] Palmqvist R， Engaras B， Lindmark G， et al.Prediagnostic levels of carcinoembryonic antigen and CA242 in colorectal cancer：a matched case-control study[J].Dis Colon Rectum，2003，46（11）：1538-1544
[5] Schuler F，Dolken G.Detection and monitoring of minimal residual disease by quantitative real-time PCR[J].Clin Chim Acta，2006，363（1-2）：147-156
[6] Walker J，Quirke P.Prognosis and response to thempy in colorectal cancer[J].Eur J Cancer， 2002，38（7）：880—886.
[7] Johnson DS， Wong JH.The impact on nodal staging of lymphatic mapping in carcinoma of the colon and rectum[J].Semin Oncol，2004，31（3）：403-408
基金项目：
东莞市科技局立项课题（编号201010515000102）