探讨己糖激酶Ⅱ在体外培养的缺血缺氧小鼠心肌细胞自噬流变化中的作用。

取6只1～2 d龄雌雄不限C57BL/6小鼠，分离心脏并培养原代心肌细胞，取原代细胞进行以下实验。(1)按照随机数字表法(分组方法下同)将细胞分为6组，即正常对照3、6、9 h组及缺血缺氧3、6、9 h组，每组4孔。DMEM/F12培养基常规培养(常规培养条件下同)48 h后，正常对照3、6、9 h组更换新鲜DMEM/F12培养基分别培养3、6、9 h，缺血缺氧3、6、9 h组更换无糖无血清培养基后于37 ℃含体积分数1%氧气、体积分数5%二氧化碳的低氧培养箱(缺氧培养条件下同)内分别培养3、6、9 h。细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测细胞活力。(2)细胞分组及处理同实验(1)，每组1孔。蛋白质印迹法检测细胞微管相关蛋白1轻链3Ⅰ(LC3Ⅰ)、LC3Ⅱ、p62和己糖激酶Ⅱ蛋白表达。(3)将细胞分为正常对照组、单纯缺血缺氧9 h组和缺血缺氧9 h＋2-脱氧葡萄糖(2-DG)组，每组4孔。常规培养48 h后，正常对照组更换新鲜DMEM/F12培养基培养9 h；单纯缺血缺氧9 h组更换无糖无血清培养基，缺血缺氧9 h＋2-DG组更换溶有物质的量浓度为10 mmol/L 2-DG(20 μmol)的无糖无血清培养基，2组均缺氧培养9 h。CCK-8法检测细胞活力。(4)细胞分组及处理同实验(3)，每组1孔。蛋白质印迹法检测细胞LC3Ⅰ、LC3Ⅱ和p62蛋白表达。(5)细胞分组及处理同实验(3)，每组2孔。透射电镜下观察心肌细胞中自噬体/自噬溶酶体情况。(6)将细胞分为正常对照组、单纯缺血缺氧9 h组、缺血缺氧9 h＋己糖激酶Ⅱ小干扰RNA1(HK-Ⅱ siRNA1)组和缺血缺氧9 h＋HK-Ⅱ siRNA2组，每组4孔。正常对照组和单纯缺血缺氧9 h组常规培养48 h，缺血缺氧9 h＋HK-ⅡsiRNA1组和缺血缺氧9 h＋HK-ⅡsiRNA2组分别转染200 nmol/L HK-ⅡsiRNA1和HK-ⅡsiRNA2后常规培养48 h。正常对照组更换新鲜DMEM/F12培养基培养9 h，单纯缺血缺氧9 h组、缺血缺氧9 h＋HK-ⅡsiRNA1组和缺血缺氧9 h＋HK-ⅡsiRNA2组更换无糖无血清培养基后缺氧培养9 h。CCK-8法检测细胞活力。(7)细胞分组及处理同实验(6)，每组1孔。蛋白质印迹法检测细胞LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p62和己糖激酶Ⅱ蛋白表达。除实验(5)外，各实验均重复3次。对数据行单因素方差分析、LSD-t检验、Bonferroni校正。

(1)缺血缺氧3、6、9 h组心肌细胞活力分别为0.450±0.022、0.385±0.010、0.335±0.015，分别明显低于对应正常对照3、6、9 h组的0.662±0.026、0.656±0.028、0.661±0.021(t＝6.21、9.12、12.48，P<0.01)。(2)与对应正常对照3、6、9 h组比较，缺血缺氧3、6、9 h组心肌细胞LC3Ⅱ/Ⅰ比值、p62和己糖激酶Ⅱ蛋白表达均显著增加(t_{3 h}＝16.15、10.99、5.30，t_{6 h}＝6.79、10.42、9.42，t_{9 h}＝15.76、16.51、7.20，P<0.05或P<0.01)。(3)单纯缺血缺氧9 h组心肌细胞活力为0.353±0.022，较正常对照组的0.673±0.027明显降低(t＝9.29，P<0.01)；缺血缺氧9 h＋2-DG组心肌细胞活力为0.472±0.025，较单纯缺血缺氧9 h组明显升高(t＝3.60，P<0.05)。(4)与正常对照组比较，单纯缺血缺氧9 h组心肌细胞LC3Ⅱ/Ⅰ比值及p62蛋白表达均明显增加(t＝9.45、8.40，P<0.01)；与单纯缺血缺氧9 h组比较，缺血缺氧9 h＋2-DG组心肌细胞LC3Ⅱ/Ⅰ比值及p62蛋白表达均明显减少(t＝4.39、4.74，P<0.05)。(5)正常对照组心肌细胞中仅可见个别双层膜结构的自噬体/自噬溶酶体；与正常对照组比较，单纯缺血缺氧9 h组心肌细胞中双层膜结构的自噬体/自噬溶酶体明显增多；与单纯缺血缺氧9 h组比较，缺血缺氧9 h＋2-DG组心肌细胞中自噬体/自噬溶酶体数量明显减少。(6)单纯缺血缺氧9 h组心肌细胞活力为0.358±0.023，较正常对照组的0.673±0.026明显降低(t＝9.12，P<0.01)；缺血缺氧9 h＋HK-ⅡsiRNA1组和缺血缺氧9 h＋HK-ⅡsiRNA2组心肌细胞活力分别为0.487±0.027、0.493±0.022，较单纯缺血缺氧9 h组明显升高(t＝3.63、4.28，P<0.05)。(7)与正常对照组比较，单纯缺血缺氧9 h组心肌细胞LC3Ⅱ/Ⅰ比值、p62和己糖激酶Ⅱ蛋白表达均明显增加(t＝6.08、6.31、4.83，P<0.05或P<0.01)；与单纯缺血缺氧9 h组比较，缺血缺氧9 h＋HK-ⅡsiRNA1组和缺血缺氧9 h＋HK-ⅡsiRNA2组心肌细胞中LC3Ⅱ/Ⅰ比值、p62和己糖激酶Ⅱ蛋白表达均明显减少(t＝5.10、7.76、15.33，4.17、8.42、12.11，P<0.05或P<0.01)。

缺血缺氧上调体外培养的小鼠心肌细胞己糖激酶Ⅱ蛋白表达水平，通过损害自噬流导致心肌细胞活力下降；抑制己糖激酶Ⅱ活性或其表达可减轻心肌细胞缺血缺氧损害。