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摘要 [目的]检测毛木耳958對青霉素、硫酸链霉素、制霉菌素和卡那霉素 4 种抗生素的敏感性，以寻找适合原生质体融合育种的抗性筛选标记。[方法]以毛木耳958为试验材料，在PDA培养基中加入不同浓度的抗生素，测定菌丝生长速率、菌落形态特征和锁状联合菌丝数量。[结果]适宜浓度的青霉素和硫酸链霉素对毛木耳958菌丝生长都有显著的促进作用，而制霉菌素和高浓度的卡那霉素对菌丝生长有明显的抑制作用；4 种抗生素对毛木耳958菌落形态特征影响较小；青霉素、制霉菌素和卡那霉素高于 300 μg/mL 时，毛木耳958锁状联合菌丝比率呈明显的下降趋势，硫酸链霉素对其无显著作用。[结论]毛木耳958对制霉菌素和高浓度的卡那霉素具有较强的敏感性，做筛选标记时控制好抗生素的浓度，尽量减少其对锁状联合菌丝比率的影响。
关键词 毛木耳958；抗生素；敏感性；菌丝；锁状联合
中图分类号 S646.6 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）23-0033-02
Abstract [Objective] To study the sensitivity of Auricularia polytricha 958 to penicillin，streptomycin sulfate，nystatin and kanamycin，as well as to find the resistance screening markers suitable for protoplast fusion breeding.[Method] Taking Auricularia polytricha 958 as the material，growth rate of mycelia，morphological features of colony and clamp connection amount of mycelia were determined by adding different concentrations of four kinds of antibiotics in PDA media.[Result] Growth rate of mycelia were promoted significantly by a proper concentration of ampicillin and streptomycin sulfate.But growth rate of mycelia were inhibited significantly by nystatin and the higher concentration of kanamycin.The effects of four antibiotics on the colonial morphological characteristics of the stain were not significantly.The ratios of hyphal clamp connection of Auricularia polytricha 958 were decreased when the concentration of penicillin，nystatin and kanamycin were higher than 300 μg/mL.The effect of streptomycin sulphate on forming of clamp connection was not significant.[Conclusion] The sensitivities of Auricularia polytricha 958 to nystatin and the higher concentration of kanamycin were obvious.Thus，the concentration of antibiotics should be controlled when it was used to screening marker，and minimize the effect of the antibiotic on ratio of hyphal clamp connection.
Key words Auricularia polytricha 958；Antibiotics；Sensitivity；Mycelia；Clamp connection
毛木耳属于木耳目，木耳科，木耳属中的毛木耳种（Auricularia polytricha）[1]，是世界性的重要栽培品种之一，主要生长在中国的南方和一些东南亚国家[2-3]。毛木耳含有丰富的镁元素，其抗逆性强、产量高、价格低廉，但品性差、质地硬而脆[4-5]。对毛木耳和嫩滑、味好、铁元素含量较高、商品性好的黑木耳进行原生质体融合，有可能筛选出具有双亲优良性状的木耳新种。但利用哪种筛选标记来筛选融合子是育种工作者面临的瓶颈。抗药性标记是筛选融合子的较好手段，微生物抗药性由菌种遗传物质决定，遗传上十分稳定[6]。用抗药性差异选择融合子时要把握好药物的浓度，过高或过低都会影响融合子的检出。毛木耳958是山东省广泛栽培的一个毛木耳品种，其出耳温度20～36 ℃，具有极强的抗霉能力，耳片大且肉厚，总产量高，用纯玉米心种植0.5 kg干料可以产出干耳90～125 g，是用于融合育种的重要备选菌种之一。鉴于此，笔者初步测定了毛木耳958对4种不同浓度梯度抗生素的敏感性，以期找到合适的遗传筛选标记，为木耳的原生质体融合育种研究提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株。毛木耳958斜面菌种购于山东省济宁市永腾食用菌研究所。
1.1.2 培养基。PDA培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂18 g，水1 000 mL，pH 5.8[7]。 抗生素-PDA培养基：在PDA培養基中加入不同浓度抗生素，包括青霉素-PDA培养基，硫酸链霉素-PDA培养基，制霉菌素-PDA培养基和卡那霉素-PDA培养基等。
1.1.3 试剂。青霉素（80万单位，国药准字H31020929，华北制药股份有限公司），硫酸链霉素（10万单位，国药准字H37022586，瑞阳制药有限公司），制霉菌素片（50万单位，国药准字H330211393，浙江震元制药有限公司），卡那霉素（20万单位，国药准字H37020562，齐鲁制药有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 抗生素母液的配制。
将4种抗生素制备成50 mg/mL抗生素母液，用0.45 μm微孔滤膜进行过滤除菌后于4 ℃冰箱储存备用。
1.2.2 培养基的制备。
PDA培养基按常规方法制备。抗生素-PDA培养基是在PDA培养基中加入不同体积的抗生素母液，使其终浓度分别为50、100、200、300、400和500 μg/mL。
1.2.3 菌种的活化及接种。
将供试斜面菌种放入25 ℃的培养箱中活化培养24 h后，用接种铲接种到PDA平板上进行扩大培养8 d。在菌落周边取直径为0.65 cm健壮的菌丝块，用接种铲转接到制备好的抗生素-PDA培养基平板中央。同时用镊子夹取洁净的已灭菌的盖玻片倾斜45°插入培养基中，盖玻片距离接种块2 cm，每个平板插入3个盖玻片，置于25 ℃培养箱中避光培养。每个变量设6个重复，其中3个重复观察菌丝体生长速率及外观特征，另外3个重复用于显微镜下观察，以上均以无抗生素的PDA培养基作空白对照。
1.3 观察及测定
1.3.1 菌丝体外观特征。
每天用游标卡尺测量培养中的毛木耳958的菌落直径，连续测量9 d，计算平均日长速及抑制率。菌丝平均日长速（cm/d）=（菌落直径-接种块直径）/（2×天数）。抑制率（%）=[（对照菌丝生长速率-抗生素处理菌丝生长速率）/对照菌丝生长速率]×100[8]。同时观察菌丝组织外观特征，包括萌发时间，菌丝色泽、密度、长势，菌落边缘，褐变程度，隆起状况等。
1.3.2 显微观察。
待毛木耳958菌丝长满盖玻片，在无菌操作台内取出，置于10×40倍显微镜下观察记录菌丝锁状联合形成情况，计算锁状联合菌丝比率。菌丝锁状联合比率=锁状联合个数/菌丝数[9]。
1.4 数据分析
试验数据用SPSS 17.0进行统计分析，用Origin 8.0软件进行绘图。
2 结果与分析
2.1 不同抗生素培养基对毛木耳958菌丝平均日长速的影响
由表1可知，在试验浓度范围内，青霉素对毛木耳958菌丝生长具有显著促进作用（P<0.05）。随着青霉素浓度的升高，促进作用先强后弱。当青霉素浓度为100 μg/mL时，促进作用最强，生长速率与对照相比提高了13.00%；浓度为100～300 μg/mL时，硫酸链霉素对毛木耳958的生长促进作用最强且无差异显著性（P>0.05）；浓度大于300 μg/mL时，出现了明显的抑制作用，但抑制率不超过5%；制霉菌素对毛木耳958有明显的抑制作用，并且浓度越高抑制作用越强，抑制率高达40%；浓度在300 μg/mL范围内，卡那霉素对毛木耳958的生长影响不显著，高于此浓度开始出现抑制作用，且抑制作用显著增强。
2.2 不同抗生素培养基对毛木耳958菌落形态特征的影响
在试验浓度范围内，各培养基培养的毛木耳958菌丝的萌发时间大多数为48 h。含青霉素和制霉菌素的PDA培养基培养的菌丝体外观形态特征与对照菌株相比无显著变化，但色素产量略有增加；硫酸链霉素-PDA培养基上菌丝体较稀疏，色素产量较对照菌株有显著增加；卡那霉素-PDA培养基上菌丝体较稀疏，其他特征无明显区别。
2.3 不同抗生素培养基对毛木耳958锁状联合菌丝比率的影响
从图1可以看出，随着硫酸链霉素浓度的升高，毛木耳958锁状联合菌丝比率不显著的增加趋势（P>0.05）；青霉素、制霉菌素和卡那霉素在低浓度时，该比率略高于不加抗生素培养的对照菌株，且差异不显著。高于300 μg/mL时，该比率呈明显的下降趋势（P<0.05）。
3 结论与讨论
自从1972年Devriers等人对裂褶菌原生质体制备成功开始，原生质体融合技术已运用到食用菌研究领域[10]。原生质体融合育种遗传信息传递量大，不需详细了解双亲的遗传背景，可实现远缘杂交；该方法操作方便，适用性强，为食用菌新种的选育提供了广阔的发展前景[11]。
近年来，融合子筛选方法不断涌现，如利用抗药性选择融合子，马玉银等[12]采用一定浓度的NaNO3选择再生培养基对佛罗里达侧耳与姬菇融合后代进行筛选得到一株双亲融合菌株。王淑珍等[13]利用食用菌对潮霉素的自然抗性筛选香菇和松茸的融合子。用抗药性差异选择融合子时要控制药物的浓度，浓度过低则亲本生长过快，影响融合子的检出；浓度过高则融合频率降低[6]。该研究结果显示，一定浓度的青霉素和硫酸链霉素对毛木耳958菌丝生长有明显的促进作用，菌落外观特征与对照菌株相比没有发生明显的变化；在试验浓度范围内，毛木耳958对制霉菌素和高浓度的卡那霉素有极强的敏感性，菌丝生长受到显著抑制，这与笔者前期对黑木耳的研究结果类似[14]。锁状联合是黑木耳菌丝生长发育过程中明显的指示特征，可作为自然遗传标记。肖在勤等[15]利用双亲都具有锁状联合的双核异核菌丝体为亲本，进行凤尾菇与金针菇科间的原生质体融合，并结合融合核分裂技术筛选融合子。该研究结果显示，青霉素、制霉菌素和卡那霉素高于300 μg/mL时，都能显著降低锁状联合菌丝的比率。经统计学分析显示，菌丝日生长速率与锁状联合菌丝比率之间呈极显著的正相关性。由此可以得出，制霉菌素或高浓度的卡那霉素能抑制毛木耳958的生长速率，可考虑作为育种的抗性筛选标记，但做筛选标记时应控制好抗生素的浓度，尽量减少其对锁状联合菌丝比率的影响。 参考文献
[1]张丹，郑有良.毛木耳（Auricularia polytricha）的研究进展[J].西南农业学报，2004，17（5）：668-673.
[2] 赵爽，布达，刘宇，等.毛木耳菌丝体营养优势菌株的筛选研究[J].中国食用菌，2011，30（5）：8-9.
[3] VEERALAKSHMI S，AHILA DEVI P，PRAKASAM V，et al.Molecular characterization and standardization of cultivation for wood ear mushroom[Auricularia polytricha（Mont.）]Sacc.[J].International journal of biotechnology research，2014，2（5）：60-64.
[4] 杨新美.关于进一步发展我国食用菌事业的商讨[J].中国食用菌，1991（1）：3-5.
[5] 吕文英.黑木耳和毛木耳中无机营养元素含量的测定与研究[J].微量元素与健康研究，2007，24（4）：30-31.
[6] 曹文芩，郭顺星，徐锦堂.大型真菌原生质体融合技术研究进展[J].生物学通报，1998，33（10）：2-4.
[7] 李秀霞.生物学综合实验：下册[M].沈阳：东北大学出版社，2013.
[8] 张国广，黄家福，陈丽萍，等.灵芝菌丝体对4种抗生素的敏感性研究[J].安徽农业科学，2010，38（14）：7701-7702，7719.
[9] 王妍，杜春梅，姜忠元，等.不同培养基对黑木耳锁状联合菌丝比率的影响[J].安徽农业科学，2016，44（35）：49-50.
[10] 张甜甜，张治中，张墨楠，等.食用菌原生质体融合育种技术的研究进展（综述）[J].浙江食用菌，2009，17（3）：29-31.
[11] 王春晖.食用菌领域原生质体技术研究应用浅析[J].中国食用菌，2011，30（3）：3-5.
[12] 马玉银，顾庆龙.侧耳属种间原生质体融合杂种选育的研究[J].食用菌学报，1994，1（1）：17-21.
[13] 王淑珍，白晨，高雁，等.松茸與香菇原生质体融合的研究[J].食用菌，2003，25（2）：9-10.
[14] 甄文爽，董锡文，杜春梅，等.4种抗生素对黑木耳黑29菌丝生长的影响[J].安徽农业科学，2017，45（33）：57-59.
[15] 马玉银，李霖.原生质体技术在食用菌遗传育种中的应用[J].中国野生植物资源，2000，19（6）：1-4.
关键词 毛木耳958；抗生素；敏感性；菌丝；锁状联合
中图分类号 S646.6 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）23-0033-02
Abstract [Objective] To study the sensitivity of Auricularia polytricha 958 to penicillin，streptomycin sulfate，nystatin and kanamycin，as well as to find the resistance screening markers suitable for protoplast fusion breeding.[Method] Taking Auricularia polytricha 958 as the material，growth rate of mycelia，morphological features of colony and clamp connection amount of mycelia were determined by adding different concentrations of four kinds of antibiotics in PDA media.[Result] Growth rate of mycelia were promoted significantly by a proper concentration of ampicillin and streptomycin sulfate.But growth rate of mycelia were inhibited significantly by nystatin and the higher concentration of kanamycin.The effects of four antibiotics on the colonial morphological characteristics of the stain were not significantly.The ratios of hyphal clamp connection of Auricularia polytricha 958 were decreased when the concentration of penicillin，nystatin and kanamycin were higher than 300 μg/mL.The effect of streptomycin sulphate on forming of clamp connection was not significant.[Conclusion] The sensitivities of Auricularia polytricha 958 to nystatin and the higher concentration of kanamycin were obvious.Thus，the concentration of antibiotics should be controlled when it was used to screening marker，and minimize the effect of the antibiotic on ratio of hyphal clamp connection.
Key words Auricularia polytricha 958；Antibiotics；Sensitivity；Mycelia；Clamp connection
毛木耳属于木耳目，木耳科，木耳属中的毛木耳种（Auricularia polytricha）[1]，是世界性的重要栽培品种之一，主要生长在中国的南方和一些东南亚国家[2-3]。毛木耳含有丰富的镁元素，其抗逆性强、产量高、价格低廉，但品性差、质地硬而脆[4-5]。对毛木耳和嫩滑、味好、铁元素含量较高、商品性好的黑木耳进行原生质体融合，有可能筛选出具有双亲优良性状的木耳新种。但利用哪种筛选标记来筛选融合子是育种工作者面临的瓶颈。抗药性标记是筛选融合子的较好手段，微生物抗药性由菌种遗传物质决定，遗传上十分稳定[6]。用抗药性差异选择融合子时要把握好药物的浓度，过高或过低都会影响融合子的检出。毛木耳958是山东省广泛栽培的一个毛木耳品种，其出耳温度20～36 ℃，具有极强的抗霉能力，耳片大且肉厚，总产量高，用纯玉米心种植0.5 kg干料可以产出干耳90～125 g，是用于融合育种的重要备选菌种之一。鉴于此，笔者初步测定了毛木耳958对4种不同浓度梯度抗生素的敏感性，以期找到合适的遗传筛选标记，为木耳的原生质体融合育种研究提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株。毛木耳958斜面菌种购于山东省济宁市永腾食用菌研究所。
1.1.2 培养基。PDA培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂18 g，水1 000 mL，pH 5.8[7]。 抗生素-PDA培养基：在PDA培養基中加入不同浓度抗生素，包括青霉素-PDA培养基，硫酸链霉素-PDA培养基，制霉菌素-PDA培养基和卡那霉素-PDA培养基等。
1.1.3 试剂。青霉素（80万单位，国药准字H31020929，华北制药股份有限公司），硫酸链霉素（10万单位，国药准字H37022586，瑞阳制药有限公司），制霉菌素片（50万单位，国药准字H330211393，浙江震元制药有限公司），卡那霉素（20万单位，国药准字H37020562，齐鲁制药有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 抗生素母液的配制。
将4种抗生素制备成50 mg/mL抗生素母液，用0.45 μm微孔滤膜进行过滤除菌后于4 ℃冰箱储存备用。
1.2.2 培养基的制备。
PDA培养基按常规方法制备。抗生素-PDA培养基是在PDA培养基中加入不同体积的抗生素母液，使其终浓度分别为50、100、200、300、400和500 μg/mL。
1.2.3 菌种的活化及接种。
将供试斜面菌种放入25 ℃的培养箱中活化培养24 h后，用接种铲接种到PDA平板上进行扩大培养8 d。在菌落周边取直径为0.65 cm健壮的菌丝块，用接种铲转接到制备好的抗生素-PDA培养基平板中央。同时用镊子夹取洁净的已灭菌的盖玻片倾斜45°插入培养基中，盖玻片距离接种块2 cm，每个平板插入3个盖玻片，置于25 ℃培养箱中避光培养。每个变量设6个重复，其中3个重复观察菌丝体生长速率及外观特征，另外3个重复用于显微镜下观察，以上均以无抗生素的PDA培养基作空白对照。
1.3 观察及测定
1.3.1 菌丝体外观特征。
每天用游标卡尺测量培养中的毛木耳958的菌落直径，连续测量9 d，计算平均日长速及抑制率。菌丝平均日长速（cm/d）=（菌落直径-接种块直径）/（2×天数）。抑制率（%）=[（对照菌丝生长速率-抗生素处理菌丝生长速率）/对照菌丝生长速率]×100[8]。同时观察菌丝组织外观特征，包括萌发时间，菌丝色泽、密度、长势，菌落边缘，褐变程度，隆起状况等。
1.3.2 显微观察。
待毛木耳958菌丝长满盖玻片，在无菌操作台内取出，置于10×40倍显微镜下观察记录菌丝锁状联合形成情况，计算锁状联合菌丝比率。菌丝锁状联合比率=锁状联合个数/菌丝数[9]。
1.4 数据分析
试验数据用SPSS 17.0进行统计分析，用Origin 8.0软件进行绘图。
2 结果与分析
2.1 不同抗生素培养基对毛木耳958菌丝平均日长速的影响
由表1可知，在试验浓度范围内，青霉素对毛木耳958菌丝生长具有显著促进作用（P<0.05）。随着青霉素浓度的升高，促进作用先强后弱。当青霉素浓度为100 μg/mL时，促进作用最强，生长速率与对照相比提高了13.00%；浓度为100～300 μg/mL时，硫酸链霉素对毛木耳958的生长促进作用最强且无差异显著性（P>0.05）；浓度大于300 μg/mL时，出现了明显的抑制作用，但抑制率不超过5%；制霉菌素对毛木耳958有明显的抑制作用，并且浓度越高抑制作用越强，抑制率高达40%；浓度在300 μg/mL范围内，卡那霉素对毛木耳958的生长影响不显著，高于此浓度开始出现抑制作用，且抑制作用显著增强。
2.2 不同抗生素培养基对毛木耳958菌落形态特征的影响
在试验浓度范围内，各培养基培养的毛木耳958菌丝的萌发时间大多数为48 h。含青霉素和制霉菌素的PDA培养基培养的菌丝体外观形态特征与对照菌株相比无显著变化，但色素产量略有增加；硫酸链霉素-PDA培养基上菌丝体较稀疏，色素产量较对照菌株有显著增加；卡那霉素-PDA培养基上菌丝体较稀疏，其他特征无明显区别。
2.3 不同抗生素培养基对毛木耳958锁状联合菌丝比率的影响
从图1可以看出，随着硫酸链霉素浓度的升高，毛木耳958锁状联合菌丝比率不显著的增加趋势（P>0.05）；青霉素、制霉菌素和卡那霉素在低浓度时，该比率略高于不加抗生素培养的对照菌株，且差异不显著。高于300 μg/mL时，该比率呈明显的下降趋势（P<0.05）。
3 结论与讨论
自从1972年Devriers等人对裂褶菌原生质体制备成功开始，原生质体融合技术已运用到食用菌研究领域[10]。原生质体融合育种遗传信息传递量大，不需详细了解双亲的遗传背景，可实现远缘杂交；该方法操作方便，适用性强，为食用菌新种的选育提供了广阔的发展前景[11]。
近年来，融合子筛选方法不断涌现，如利用抗药性选择融合子，马玉银等[12]采用一定浓度的NaNO3选择再生培养基对佛罗里达侧耳与姬菇融合后代进行筛选得到一株双亲融合菌株。王淑珍等[13]利用食用菌对潮霉素的自然抗性筛选香菇和松茸的融合子。用抗药性差异选择融合子时要控制药物的浓度，浓度过低则亲本生长过快，影响融合子的检出；浓度过高则融合频率降低[6]。该研究结果显示，一定浓度的青霉素和硫酸链霉素对毛木耳958菌丝生长有明显的促进作用，菌落外观特征与对照菌株相比没有发生明显的变化；在试验浓度范围内，毛木耳958对制霉菌素和高浓度的卡那霉素有极强的敏感性，菌丝生长受到显著抑制，这与笔者前期对黑木耳的研究结果类似[14]。锁状联合是黑木耳菌丝生长发育过程中明显的指示特征，可作为自然遗传标记。肖在勤等[15]利用双亲都具有锁状联合的双核异核菌丝体为亲本，进行凤尾菇与金针菇科间的原生质体融合，并结合融合核分裂技术筛选融合子。该研究结果显示，青霉素、制霉菌素和卡那霉素高于300 μg/mL时，都能显著降低锁状联合菌丝的比率。经统计学分析显示，菌丝日生长速率与锁状联合菌丝比率之间呈极显著的正相关性。由此可以得出，制霉菌素或高浓度的卡那霉素能抑制毛木耳958的生长速率，可考虑作为育种的抗性筛选标记，但做筛选标记时应控制好抗生素的浓度，尽量减少其对锁状联合菌丝比率的影响。 参考文献
[1]张丹，郑有良.毛木耳（Auricularia polytricha）的研究进展[J].西南农业学报，2004，17（5）：668-673.
[2] 赵爽，布达，刘宇，等.毛木耳菌丝体营养优势菌株的筛选研究[J].中国食用菌，2011，30（5）：8-9.
[3] VEERALAKSHMI S，AHILA DEVI P，PRAKASAM V，et al.Molecular characterization and standardization of cultivation for wood ear mushroom[Auricularia polytricha（Mont.）]Sacc.[J].International journal of biotechnology research，2014，2（5）：60-64.
[4] 杨新美.关于进一步发展我国食用菌事业的商讨[J].中国食用菌，1991（1）：3-5.
[5] 吕文英.黑木耳和毛木耳中无机营养元素含量的测定与研究[J].微量元素与健康研究，2007，24（4）：30-31.
[6] 曹文芩，郭顺星，徐锦堂.大型真菌原生质体融合技术研究进展[J].生物学通报，1998，33（10）：2-4.
[7] 李秀霞.生物学综合实验：下册[M].沈阳：东北大学出版社，2013.
[8] 张国广，黄家福，陈丽萍，等.灵芝菌丝体对4种抗生素的敏感性研究[J].安徽农业科学，2010，38（14）：7701-7702，7719.
[9] 王妍，杜春梅，姜忠元，等.不同培养基对黑木耳锁状联合菌丝比率的影响[J].安徽农业科学，2016，44（35）：49-50.
[10] 张甜甜，张治中，张墨楠，等.食用菌原生质体融合育种技术的研究进展（综述）[J].浙江食用菌，2009，17（3）：29-31.
[11] 王春晖.食用菌领域原生质体技术研究应用浅析[J].中国食用菌，2011，30（3）：3-5.
[12] 马玉银，顾庆龙.侧耳属种间原生质体融合杂种选育的研究[J].食用菌学报，1994，1（1）：17-21.
[13] 王淑珍，白晨，高雁，等.松茸與香菇原生质体融合的研究[J].食用菌，2003，25（2）：9-10.
[14] 甄文爽，董锡文，杜春梅，等.4种抗生素对黑木耳黑29菌丝生长的影响[J].安徽农业科学，2017，45（33）：57-59.
[15] 马玉银，李霖.原生质体技术在食用菌遗传育种中的应用[J].中国野生植物资源，2000，19（6）：1-4.