【摘 要】
：
[目的]克隆瑶山亚种树鼩干扰素刺激基因15(interferon stimulating gene 15,ISG15)基因,在大肠杆菌中高效表达并纯化、制备多克隆抗体,为其生物学应用及检测方法的建立奠定基础.[方法]提取瑶山亚种树鼩外周淋巴细胞总RNA,经RT-PCR扩增出ISG15基因,亚克隆到真核表达载体构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-ISG15,并瞬时转染仓鼠肾细胞(baby hamster syrian kidney,BHK-21);同时亚克隆到原核表达载体pET-28a(+)构建重组表达质
【机 构】
：
广西中医药大学,南宁530200;广西高发传染病中西医结合转化医学重点实验室,南宁530200;广西中医药大学,南宁530200
论文部分内容阅读
[目的]克隆瑶山亚种树鼩干扰素刺激基因15(interferon stimulating gene 15,ISG15)基因,在大肠杆菌中高效表达并纯化、制备多克隆抗体,为其生物学应用及检测方法的建立奠定基础.[方法]提取瑶山亚种树鼩外周淋巴细胞总RNA,经RT-PCR扩增出ISG15基因,亚克隆到真核表达载体构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-ISG15,并瞬时转染仓鼠肾细胞(baby hamster syrian kidney,BHK-21);同时亚克隆到原核表达载体pET-28a(+)构建重组表达质粒pET-28a-ISG15,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达树鼩ISG15蛋白;重组蛋白经镍离子亲和层析法纯化并免疫小鼠,获得鼠抗树鼩ISG15多克隆抗体,利用Western blotting和间接免疫荧光技术(IFA)检测其反应性.[结果]成功克隆瑶山亚种树鼩ISG15基因,并构建了其真核和原核表达载体,真核表达载体在BHK-21细胞中能高效表达;原核表达载体在大肠杆菌中30℃、0.5 mmol/LIPTG诱导6 h获得重组蛋白(分子质量22 ku),蛋白以包涵体形式表达,经镍离子亲和层析法得到纯化.乳化后的重组蛋白免疫小鼠,获得抗瑶山亚种树鼩ISG15的多克隆抗体,经Western blotting检测,制备的鼠抗树鼩ISG15多克隆抗体稀释度在1∶8 000时仍能够与0.01 μgISG15重组蛋白结合.IFA检测发现,多克隆抗体能与真核细胞过表达的蛋白反应,抗体反应性良好.[结论]构建的原核表达载体在大肠杆菌中高效表达瑶山亚种树鼩ISG15蛋白,重组蛋白纯化复性后具有良好免疫原性,获得的多克隆抗体为进一步研究树鼩抗病毒感染免疫奠定了良好基础.
其他文献
[目的]了解北京地区流行的鸽圆环病毒(Pigeon circovirus,PiCV)的基因组特征及变异规律.[方法]以3只发病鸽的肝脏和脾脏组织为模板,采用PCR技术检测病原.以检测阳性的肝脏组织DNA为模板,应用PCR技术分段扩增PiCV的全基因序列.应用DNAStar和Mega 7.0软件对扩增得到的全序列进行拼接和核苷酸序列比对,并构建系统进化树,对病毒基因组的2个开放阅读框分别进行核苷酸和氨基酸序列比对,并构建系统进化树.[结果]经PCR检测,3只病鸽中有1只病鸽的组织中检测到PiCV阳性,并未检
[目的]检测隆林猪的全基因组拷贝数变异.[方法]采集33头隆林猪的耳组织样本,通过酚-氯仿法提取DNA后,使用猪中芯一号50K SNP芯片进行基因分型,得到的原始数据通过Genomestudio软件和Linux系统进行处理,使用CNVPartition和PennCNV软件分别检测拷贝数变异(copy number variation,CNV),并利用Bedtools软件将CNV合并为拷贝数变异区域(copy number variation region,CNVR),使用Biomart对CNVR进行基因定
[目的]整合分析多个绵羊睾丸转录组数据集,揭示绵羊睾丸差异基因及蛋白质互作网络关系,以期探索影响绵羊精子生成的关键基因,为绵羊的繁殖提供理论参考.[方法]对74个绵羊睾丸转录组进行生物信息学分析,通过limma软件包进行差异基因分析,使用WGCNA构建加权绵羊睾丸差异基因共表达网络,并通过MCODE计算网络中重要基因;利用Metascape进行功能富集分析,利用Cytoscape插件AutoAnnotate识别基因集簇.[结果]最终筛选到11 884个基因,构建237 366对蛋白质互作关系;对2 058
[目的]克隆野生鸟类红嘴鸥Toll样受体7(TLR7)基因,并对其编码蛋白进行生物信息学分析,为后期TLR7蛋白的抗病毒活性研究做准备.[方法]采用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)扩增红嘴鸥TLR7基因全序列,通过生物信息学软件分析TLR7基因序列、稀有密码子、相似性及其编码蛋白的理化性质、跨膜区域、信号肽、N-糖基化位点、磷酸化位点和亚细胞定位,分别利用SOPMA和SWISS-MODEL软件预测TLR7蛋白的二级结构和三级结构.[结果
[目的]通过对比马雌性胎儿同一脐带3个不同部位分离的脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSCs)的增殖率、表面标记分子、多潜能性基因表达和软骨分化潜能的差异性,明确更适合作为分离培养间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的马脐带部位.[方法]采用组织块分离法分离脐带靠近胎儿的部分(近端)、整段脐带的中心(中段)和靠近胎盘部分(远端)3个部分的MSCs,通过绘制细胞生长曲线对比UC-MSCs的增殖能力,通过实时
在哺乳动物胚胎发育过程中,雌性胚胎细胞中一条X染色体转录沉默,导致两性间的剂量补偿称为X染色体失活(X chromosome inactivation,XCI).X 染色体失活中心(X chromosome inactivation center,XIC)是 XCI 的主要调控区域,X-非活性特异性转录物(X-inactive specific transcript,Xist)位于该区域中且是XCI的关键部分.Xist长链非编码RNA(long chain non-coding RNA,lncRNA)是一
[目的]挖掘大白猪β-烯醇化酶(β-enolase,ENO3)基因单核苷酸多态性(SNP)位点,分析SNP间的连锁不平衡程度及其与生长性状的相关性.[方法]选取大白母猪316头,采用混合DNA样本PCR扩增产物测序,确定ENO3基因SNP位点.采用GenoPlexs分型技术对每个个体的目标SNP位点进行基因分型,并与大白猪体重达100 kg时的日增重、日龄、背膘厚、眼肌面积和眼肌厚进行连锁不平衡和关联分析,探究ENO3基因SNP与大白猪生长性状的相关性.[结果]共鉴定出9个SNPs位点,均为已知SNPs,
[目的]探索二十二碳六烯酸(DHA)对高脂饲粮诱导肝脏脂肪积累的预防机制.[方法]将32只雄性SPF级C57BL/6小鼠均分为4组,对照组(Con)饲喂普通饲粮,模型组(Model)饲喂高脂饲粮,DHA组分别在高脂饲粮中添加0.2 g DHA(DHAL)和1.0 g DHA(DHAH),饲喂周期为20周.饲喂期间每天称量体重及食物重量,计算摄食量;饲喂结束,采集肝脏和血液,ELISA法检测肝脏脂联素和血清甘油三酯(TG)的含量,实时荧光定量PCR检测新生脂肪合成关键酶(SREBP-1c、FAS)、脂肪酸氧
睾丸间质细胞(Leydig cells,LCs)的主要功能是合成和分泌睾酮.在睾丸间质细胞内,以胆固醇为原料,位于线粒体外膜上的类固醇合成急性调节蛋白(steroidogenic acute regulatory protein,StAR)促进胆固醇向线粒体内膜转运,在线粒体内膜胆固醇侧链裂解酶(cholesterol side-chain cleavage cytochrome,P450scc)的催化下生成孕烯醇酮,而后通过光面内质网的羟基类固醇脱氢酶(3β-hydroxysteroid dehydro
[目的]研究地菍粗多糖对高脂饮食诱导肥胖小鼠脂代谢的影响.[方法]将小鼠随机分为6组:空白组、模型组、阳性组(0.025 mg/g奥利司他)及高、中、低剂量地菍粗多糖(1.2、0.6和0.3 mg/g)处理组,每组12只.空白组小鼠喂食普通维持饲料,其余各组小鼠喂食高脂饲料,空白组、模型组给予生理盐水,阳性组给予0.025 mg/g奥利司他,高、中、低剂量地菍粗多糖组分别给予1.2、0.6和0.3 mg/g地菍粗多糖,每天灌胃1次,连续给药30 d.给药结束,称量小鼠体重、附睾及肾脏周围脂肪和肝脏组织的重