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摘要：【目的】對香蕉果实非特异性磷脂酶C基因（MaNPC1）开放阅读框（ORF）进行原核表达，并制备其多克隆抗体，为深入探究MaNPC1在香蕉果实抵御炭疽病中的作用机制提供理论依据。【方法】克隆MaNPC1基因ORF序列，对其进行生物信息学分析及抗原性预测，并通过双酶切法构建其原核表达载体，利用热激法转入大肠杆菌Rosetta 2（DE3）感受态细胞中进行诱导表达，重组蛋白经Ni-NTA树脂层析柱纯化后免疫新西兰兔，以制备多克隆抗体。同时，运用Western blotting和实时荧光定量PCR分别检测香蕉果实贮藏过程中在炭疽病侵染胁迫下MaNPC1蛋白表达水平及MaNPC1基因相对表达量。【结果】重组质粒pGEX-6p-3-MaNPC1经双酶切后得到1650 bp的特异性条带，说明原核表达载体构建成功，将其转入大肠杆菌Rosetta 2（DE3）感受态细胞后成功表达。MaNPC1蛋白分子式为C2747H4249N769O793S10，分子量为61.06 kD，理论等电点（pI）为8.96;丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和丝氨酸含量较高，分别占氨基酸总数的8.7%、8.2%、7.8%和7.7%;不稳定指数为47.14，表明其为不稳定蛋白;蛋白抗原区段丰富且亲水性氨基酸数目明显高于疏水性氨基酸，有利于后续抗体的制备。制备的多克隆抗体效价较高，为1∶2048000。Western blotting检测发现，香蕉果实贮藏过程中MaNPC1蛋白表达水平呈上升—下降—上升的变化趋势;炭疽病侵染组MaNPC1蛋白除贮藏15 d时的表达水平比对照组低外，其他贮藏时间均略高于对照组。实时荧光定量PCR检测结果表明，MaNPC1基因相对表达量在香蕉果实贮藏过程中呈逐渐上升趋势;贮藏3～15 d，炭疽病侵染组MaNPC1基因相对表达量均显著高于对照组（P<0.05）。【结论】炭疽病侵染能提高MaNPC1蛋白表达水平，故推测MaNPC1蛋白参与香蕉果实抵抗炭疽病侵染。
关键词： 香蕉;MaNPC1基因;原核表达;多克隆抗体;炭疽病;贮藏
中图分类号： S668.103.6 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）07-1753-09
Prokaryotic expression of banana MaNPC1 gene and preparation of its polyclonal antibody
SHUAI Liang1，2， YIN Fei-long1， LIAO Ling-yan1， LIU Yun-fen1， DUAN Zhen-hua1，
LI Li2， HE Xue-mei2， LI Chang-bao2， SUN Jian2*
（1School of Food and Biological Engineering，Hezhou University/Institute of Food Science and Engineering Technology，Hezhou， Guangxi 542899， China; 2Institute of Agro-products Processing Science and Technology， Guangxi Academy of Agricultural Sciences/Guangxi Key Open Laboratory of Crop Genetic Improvement Biotechnology/Guangxi Key Experiment of Storage and Processing New Technology for Fruits and Vegetables Laboratory
Cultivation Base， Nanning 530007， China）
Abstract：【Objective】Prokaryotic expression of the open reading frame（ORF） of banana fruit non-specific phospholipase C gene（MaNPC1） and preparation of its polyclonal antibody were conducted， to provide theoretical basis for in-depth exploration of the mechanism of MaNPC1 in banana fruit resistance to anthracnose. 【Method】The ORF sequence of MaNPC1 gene was cloned， bioinformatics analysis and antigenicity prediction were carried out， and its prokaryotic expression vector was constructed by double enzyme digestion method， and the heat shock method was used to transfer it into Escherichia coli Rosetta 2（DE3） competent cell for induction expression， and the recombinant protein was purified by Ni-NTA resin chromatography column to immunize New Zealand rabbits to prepare polyclonal antibodies. At the same time， Western blotting and real-time fluorescent quantitative PCR were used to detect the MaNPC1 protein expression level and the relative expression level of MaNPC1 gene under the stress of anthracnose infection during banana fruit sto-rage. 【Result】The pGEX-6p-3-MaNPC1 recombinant plasmid was double-enzyme digested to obtain a specific band of 1650 bp， indicating that the prokaryotic expression vector was successfully constructed and transferred to E. coli Rosetta 2 （DE3） competent cell for successful expression. The molecular formula of MaNPC1 protein was C2747H4249N769O793S10， the molecular weight was 61.06 kD， and the theoretical isoelectric point（pI） was 8.96; the contents of alanine， valine， leucine and serine were high， accounting for 8.7%， 8.2%， 7.8% and 7.7% of the total number of amino acids， respectively; the instability index was 47.14， indicating that it was an unstable protein. The protein antigen segment was rich and the number of hydrophilic amino acids was higher than that of hydrophobic amino acids， which was easy for subsequent antibody preparation. The prepared polyclonal antibody had a higher titer of 1：2048000. Western blotting analysis showed that the MaNPC1 protein expression level of banana fruits showed an upward-decreasing-increasing trend during storage. The MaNPC1 protein expression level of the anthracnose infection group was lower than that of the control group when stored for 15 d， and the other storage time was slightly higher than the control group. Real-time fluorescent quantitative PCR detection showed that the relative expression of MaNPC1 gene showed a gradual upward trend during storage of banana fruits; after storage for 3 to 15 d， the relative expression of MaNPC1 gene in the anthracnose infection group was significantly higher than that in the control group（P<0.05）. 【Conclusion】Anthracnose infection can increase the expression level of MaNPC1 protein， indicating that MaNPC1 protein participates in banana fruit resistance to anthracnose infection. Key words： banana; MaNPC1 gene; prokaryotic expression; polyclonal antibodies; anthracnose; storage
Foundation item：National Natural Science Foundation of China（31660589）; Guangxi Natural Science Foundation （2018GXNSFBA281118，2019GXNSFAA185027）; The Basic Ability Enhancement Project for Young and Middle-aged Teachers of Guangxi（2020KY18020）
0 引言
【研究意义】香蕉为芭蕉科（Musaceae）芭蕉属（Musa）单子叶植物，是生长于热带亚热带地区的一种重要经济作物和粮食作物，也是全球鲜销量最大的水果（Huang et al.，2014;王芳等，2016）。自2011年起我国香蕉产量跃居世界第二，并呈逐年增长趋势，香蕉产业已成为我国热带地区的重要支柱产业之一（王芳等，2016）。香蕉为典型的呼吸跃变型水果，同时又是冷敏性水果，在采收和运输过程中，冷害、病害及机械伤害等造成的损失相当严重（Huang et al.，2012;Ketsa et al.，2013;王海波等，2018）。我国的香蕉采后损耗率高达50%左右，远高于果蔬采后的平均损耗率25%（谢建华和庞杰，2010）。非特异性磷脂酶C（Non-specific PLC，NPC）能水解磷脂酸胆碱和磷脂酰乙醇胺生成二酰基甘油（DAG），在采后果蔬贮藏过程中发挥重要作用，尤其是在植物逆境胁迫及脱落酸、油菜素内酯等激素信号传导途径中发挥重要的调节作用（帅良等，2019）。因此，原核表达香蕉NPC1基因（MaNPC1），并制备其多克隆抗体，运用Western blotting探究香蕉果实贮藏过程中MaNPC1基因表达量变化，对探究香蕉果实中NPC的生物学功能及作用机制具有重要意义。【前人研究进展】至今，已从水稻（Chrastil and Parrish，1987）、拟南芥（Peters et al.，2010）、谷子（胡利芹等，2015）、陆地棉（Song et al.，2017）等植物中克隆出NPC基因。早期研究并未发现植物NPC为植物磷脂酶家族成员，后期经过多序列比对和结构域预测才得以证实（Nakamura and Awai，2005）。NPC分泌蛋白具有典型的磷脂酶活性，且具有磷脂酶特有的磷酸酯酶结构域，但不含其他植物脂质信号转导蛋白特有的XY和PX等结构域，一般由510～540个氨基酸残基组成。多数植物的NPC分泌蛋白N端具有一个信号肽，信号肽后面有一段高度保守序列和一个短的可变区域，其中，高度保守序列位于磷酸酯酶域前方（帅良等，2019）。Krcková等（2015）在大肠杆菌重组表达拟南芥NPC，并进行体外活性检测，结果发现NPC1、NPC2、NPC3、NPC4和NPC5均具有磷脂酶活性，但NPC6不具有磷脂酶活性。与植物中的其他脂质信号转导蛋白不同，NPC活性不受Ca2+的影响，但易受Triton X-100、EGTA、NP-40和Al3+等的影响，其中，NP-40作为表面活性抑制剂，能抑制NPC活性，且抑制程度与其浓度在一定范围成正比（Reddy et al.，2010）;Al3+则通过阻碍NPC与细胞膜的结合进而抑制NPC活性（Pejchar and Martinec，2015）。大量研究结果显示，在长期经受生物胁迫（Albrecht and Bowman，2008）、非生物胁迫（Peters et al.，2014）和激素处理（Rinukshi et al.，2010）下，植物的NPC活性及其基因表达均会发生改变，表明NPC参与植物对环境和生物刺激的各种代谢反应。此外，NPC参与了生物胁迫特别是病原菌造成的病害胁迫响应。如在甜橙感染黄龙病后，与拟南芥AtNPC5基因同源的甜橙CsNPC基因表达量较对照（无黄龙病胁迫）增加了5倍（Albrecht and Bowman，2008）;使用来自细菌的激发子flgg22和Hprz处理拟南芥，结果发现拟南芥中AtNPC1和AtNPC4基因表达量有所改变（帅良等，2019）。【本研究的切入点】目前，已有大量应用各种载体在不同表达系统成功表达重组蛋白，并以其免疫动物制备抗体的研究报道，但未见针对香蕉NPC的相关研究报道。【拟解决的关键问题】克隆MaNPC1基因开放阅读框（ORF），对其进行生物信息学分析及抗原性预测，并通过双酶切法构建其原核表达载体，利用热激法转入大肠杆菌Rosetta 2（DE3）感受态细胞中进行诱导表达，重组蛋白经Ni-NTA树脂层析柱纯化后免疫兔子，以制备多克隆抗体;同时运用Western blotting和实时荧光定量PCR分别检测香蕉果实贮藏过程中MaNPC1蛋白表达水平及MaNPC1基因相对表达量，为揭示MaNPC1在香蕉果实抵御炭疽病中的作用机制提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
供试香蕉品种宝岛蕉（M. acuminata L. AAA Cavendish‘Formosana’）由广西农业良种海南南繁育种基地提供，采收成熟度为七八成熟，挑选果形端正、无机械伤和病虫害的香蕉为试材，落梳后立即运回实验室，适当降温后，清水清洗晾干，选择大小相近、成熟度相同，且未受感染和生理损伤的香蕉果实，随机分成试验组和對照组。香蕉炭疽病菌分生孢子悬液（106个孢子/mL）由广西农业科学院微生物研究所提供;质粒DNA提取试剂盒和PCR产物纯化试剂盒均购自爱思进（Axygen）生物技术有限公司;引物合成及测序委托生工生物工程 （上海） 股份有限公司完成。 1. 2 试验方法
1. 2. 1 样品处理 对刚采摘的果实进行人工喷雾接种香蕉炭疽病菌分生孢子悬液（106个孢子/mL），以喷雾蒸馏水作对照组。处理后用0.03 mm厚聚乙烯薄膜袋包装，置于20 ℃下贮藏，观察炭疽病发生情况。接种前取一次果实用于MaNPC1基因克隆。接种后每3 d取样一次，每次从6个果实上取样，设3次重复，样品经液氮速冻后置于-80 ℃超低温冰箱冻藏，用于检测香蕉果实贮藏过程中MaNPC1蛋白表达水平及MaNPC1基因相对表达量。
1. 2. 2 MaNPC1基因ORF克隆 基于课题组前期克隆的香蕉MaNPC1基因全长序列2090 bp（GenBank登錄号LOC103995036），利用ORF Pinder查找其ORF，通过Prime Premier 5.0设计ORF特异性扩增引物（MaNPC1-F1：5'-GAACCCGGGTGATGGATT CGGGGGTCCAG-3'，划线处为SmaⅠ酶切位点;Ma-NPC1-R1：5'-CTTCGCGGCCGCTTATCAAATGCTT TGGACGGA-3'，划线处为Not Ⅰ酶切位点）。以cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系25.0 μL：cDNA模板2.0 μL，2×PCR Buffer for KOD FX 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，RNase-free H2O补足至25.0 μL。扩增程序：95 ℃预变性3 min;95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，进行30个循环;72 ℃延伸5 min，4 ℃终止。
1. 2. 3 生物信息学分析及抗原性预测 参考帅良等（2020）的方法进行MaNPC1蛋白结构分析及抗原性预测。采用ExPASy中的ProtScale进行蛋白亲/疏水性预测;采用TMHMM server v.2.0进行跨膜区预测;使用SignalP 5.0预测蛋白信号肽;通过在线网站（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）;使用PredictProtein对蛋白二级结构进行预测;使用Protean中的Jameson-Wolf方法对香蕉MaNPC1蛋白抗原指数进行预测分析。
1. 2. 4 原核表达载体构建 参考刘云芬（2016）的方法构建原核表达载体。具体步骤：以Sma Ⅰ和Not Ⅰ双酶切pGEX-6p-3-GST质粒载体和MaNPC1基因ORF，通过T4 DNA连接酶将二者连接后获得重组质粒pGEX-6p-3-GST-MaNPC1，利用热激法将其转入大肠杆菌Rosetta 2（DE3）感受态细胞中，筛选出阳性重组菌株，经PCR扩增及电泳检测验证后送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将测序结果与参考序列进行比对分析。
1. 2. 5 蛋白表达及可溶性分析 参考陈伟等（2019）的方法进行MaNPC1蛋白表达及可溶性分析。具体步骤：重组菌株振荡培养约2.5 h（OD600达0.6～0.8）后加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG，分别诱导表达3和6 h，以未加入IPTG为对照组;离心收集菌体后进行超声波破碎，使用1 mL裂解缓冲液悬浮离心后，分别取上清液和沉淀液各50.0 μL进行SDS-PAGE电泳检测。
1. 2. 6 包涵体蛋白纯化 参考胡平各等（2020）的方法进行MaNPC1蛋白纯化。具体步骤：将收集的沉淀加入Ni-NTA树脂层析柱中，流速控制在0.5 mL/min，收集穿柱液体。以10倍柱床体积的NTA-0、NTA-20、NTA-60、NTA-200和NTA-500 Buffer进行洗脱，收集各洗脱峰，取少量洗脱液进行SDS-PAGE电泳检测，其余洗脱液置于透析袋中，4 ℃下以1×PBS透析，并超滤浓缩透析产物。
1. 2. 7 多克隆抗体制备及免疫效价检测 参考张永德等（2018）的方法进行多克隆抗体制备及免疫效价检测。具体步骤：以纯化的重组蛋白免疫注新西兰兔，每次注射的重组蛋白用量为200 μg，每间隔7 d对2只兔子进行1次加强免疫，每只兔子免疫4～5次，并采用间接ELISA法测定血清抗体效价，当（阳性血清OD450-空白孔OD450）/（阴性血清OD450-空白孔OD450）>2.1时，阳性血清最大稀释倍数即为血清抗体效价。待抗体表达恒定后，采集血样并分离血清，置于-20 ℃冰箱保存备用。
1. 2. 8 香蕉组织蛋白提取及定量分析 参考刘云芬（2016）的方法提取MaNPC1蛋白。具体步骤：称取5 g香蕉果皮组织，液氮下研磨成粉，加入20 mL蛋白提取液（含0.1 mmol/L Tris-HCL、1% β-巯基乙醇、0.1% Triton-X100、1 mmol/L PMSF和10% PVP，pH 9.0），4 ℃下15000 r/min离心20 min，收集上清液。MaNPC1蛋白定量采用Bradford法。参考程彦伟等（2008）的方法进行SDS-PAGE电泳，上样量为7 μg。
1. 2. 9 Western blotting检测 Western blotting检测参考张庆嫒等（2020）的方法。具体步骤：待蛋白定量后，取相应蛋白与上样缓冲液混合，经沸水浴5 min使蛋白变性，取出后10000 r/min离心1 min，吸取20.0 μL蛋白样品上样。参考考马斯亮蓝染色结果，记录目的蛋白的位置，以指导转膜时切胶的位置。采用干法转膜，20 V转膜15 min，用二抗—辣根酶标记羊抗兔IgG-HRP。
1. 2. 10 实时荧光定量PCR检测 RNA提取和反转录合成cDNA均参考帅良等（2020）的方法，采用实时荧光定量PCR检测MaNPC1基因相对表达量。以MaCAC为内参基因，配制10.0 μL反应体系置于Roche Lightcycler? 480实时荧光定量PCR仪上进行检测，MaNPC1基因相对表达量采用2-△△Ct法计算。所用的实时荧光定量PCR扩增引物如表1所示。 1. 3 统计分析
使用Excel 2013进行数据处理和分析，使用Origin 8.5作图。
2 结果与分析
2. 1 MaNPC1基因ORF克隆结果
以香蕉果皮cDNA为模板、MaNPC1-F1和Ma-NPC1-R1为引物进行PCR扩增，结果获得约1600 bp的条带（图1）。经测序比对分析，发现该片段为MaNPC1基因ORF序列，长度为1650 bp，共编码549个氨基酸残基。该片段可用于后续原核表达载体的构建。
2. 2 MaNPC1蛋白生物信息学分析结果
2. 2. 1 同源比对分析结果 通过DNAMAN 6.0对3个香蕉NPC蛋白（MaNPC1、MaNPC2和MaNPC6）进行氨基酸序列比对分析，结果显示这3个蛋白的氨基酸序列相似性较高，尤其是中间序列相似性较高，N端和C端相似性较低（图2），表明中间序列可能存在NPC蛋白的核心序列。
2. 2. 2 理化性质预测结果 MaNPC1蛋白分子式为C2747H4249N769O793S10，分子量为61.06 kD，理论等电点（pI）为8.96，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和丝氨酸含量较高，分别占氨基酸总数的8.7%、8.2%、7.8%和7.7%，不含吡咯赖氨酸和硒半胱氨酸，不稳定指数为47.14，表明其为不稳定蛋白。
2. 2. 3 亲/疏水性分析结果 MaNPC1蛋白亲/疏水性预测结果（图3）显示，MaNPC1蛋白的最大亲水性指数为-1.578、最大疏水性指数为2.079，平均为 -0.348，亲水性氨基酸数目明显高于疏水性氨基酸，表明为亲水蛋白。因此，利用MaNPC1蛋白制备多克隆抗体具有较强的可行性。
2. 2. 4 跨膜结构预测结果 MaNPC1蛋白跨膜结构预测结果如图4所示。MaNPC1蛋白存在一个跨膜结构，其跨膜螺旋（TMhelix）位于第13～32位氨基酸，推测MaNPC1为分泌性蛋白，有利于后续Wes-tern blotting检测时组织蛋白的提取。同时，其余氨基酸无明显的跨膜结构，降低了跨膜区疏水性氨基酸对蛋白折叠的影响，易于表达和纯化。
2. 2. 5 信号肽预测结果 MaNPC1蛋白信号肽预测结果（图5）显示，该蛋白存在信号肽的可能性为0.5386（>0.5000），即存在信号肽。最有可能的剪切位点位于第31～32位氨基酸间，AHC-LD可能性为0.2918，与TMHMM预测获得的跨膜结构一致。进一步说明MaNPC1蛋白为分泌性蛋白，有利于后续Western blotting检测时组织蛋白的提取。
2. 2. 6 亚细胞定位及结构预测结果 对MaNPC1蛋白氨基酸序列进行亚细胞定位，结果显示，Ma-NPC1可能定位于细胞壁或叶绿体。使用PredictProtein对蛋白二级结构进行预测，结果显示，Ma-NPC1蛋白二级结构中α-螺旋占14.57%、延伸链占7.1%、无规则卷曲占78.32%。以SWISS-MODEL预测MaNPC1蛋白三级结构，结果（图6）显示，MaNPC1蛋白有数个由N端构成的小突出结构域和由中间序列及C端组成的大结构域组成，与二级结构预测结果相符，证明三级结构预测结果准确。Pfam对结构域的预测结果如图7所示。MaNPC1蛋白含1个典型的磷酸酯酶域（PF04185），具有酯酶活性。
2. 2. 7 抗原指数分析结果 由图8可看出，Ma-NPC1蛋白抗原指数较高的区段为第8～15、28～54、60～67、72～78、110～118、126～135、186～198、225～231、265～278、287～304、330～337、363～370、386～401、414～422、434～465、476～484和485～493位氨基酸。这些位点除抗原指数较高外，多数还具备较强的亲水性，因此，采用MaNPC1蛋白制备多克隆抗体具有较强的可行性。
2. 3 MaNPC1基因表达载体构建及鉴定结果
由图9可知，重组质粒pGEX-6p-3-MaNPC1经双酶切后得到1650 bp的特异性条带，说明原核表达载体构建成功。
2. 4 重组蛋白表达及鉴定结果
由图10可知，含重组质粒pGEX-6p-3-MaNPC1的大肠杆菌Rosetta2（DE3）经IPTG诱导表达3和6 h后，沉淀中均产生大量分子量约60 kD（含GST）的目的表達产物，与预期结果相符，而在上清液中未出现大量表达产物，说明重组蛋白主要以不溶性的包涵体形式存在。
2. 5 多克隆抗体效价测定结果
利用直接ELISA对最后一次免疫获得的动物血清样品进行抗体效价测定，结果图11所示。随着稀释倍数的增加，抗体效价逐渐下降，当稀释倍数为1∶2048000时1号兔子抗体的OD450与空白孔的OD450比值为2.19，2号兔子抗体的OD450与空白孔的OD450比值为2.12，因此稀释倍数1∶2048000为该多克隆抗体的效价，说明重组蛋白MaNPC1可诱导新西兰兔产生良好的免疫反应，抗体效价较高。
2. 6 Western blotting检测结果
由图12可知，200、100和10 ng重组蛋白的泳道（约60 kD位置）上均出现1条清晰且与阳性血清反应的蛋白条带，其中200 ng重组蛋白条带最清晰，表明MaNPC1抗血清具有特异的反应特性。
2. 7 MaNPC1蛋白表达水平的检测结果
由图13可知，香蕉果实贮藏过程中MaNPC1蛋白表达水平呈上升—下降—上升的变化趋势;炭疽病侵染组MaNPC1蛋白除贮藏15 d时的表达水平较对照组低外，其他时间均略高于对照组。由此可知，炭疽病侵染能提高MaNPC1蛋白表达水平，故推测MaNPC1蛋白参与香蕉果实抵抗炭疽病侵染。 2. 8 MaNPC1基因相对表达量的检测结果
由图14可知，MaNPC1基因的相对表达量在香蕉果实贮藏过程中呈逐渐上升趋势;贮藏3～15 d，炭疽病侵染组MaNPC1基因的相对表达量均显著高于对照组（P<0.05）。这与香蕉果实贮藏过程中炭疽病侵染能提高MaNPC1蛋白表达水平的结论一致，进一步证明MaNPC1基因参与调控果实对炭疽病侵染胁迫的响应，其表达产物MaNPC1可提高香蕉果实抵抗炭疽病侵染的能力。
3 讨论
目前，以原核表达的重组蛋白免疫不同动物（兔子和鼠等）制备多克隆抗体已成为一种行之有效且常用的方法（程彦伟等，2008）。此外，通过原核表达可获得大量的抗原蛋白，可用于蛋白性质和功能、蛋白间相互作用及多种生化功能研究（王增等，2009）。现已研究证实，磷脂酶在植物的防御反应中发挥重要作用（Laxalt and Munnik，2002;Canonne et al，2011），尤其是NPC在植物防御病原菌胁迫反应中发挥重要作用（Scherer et al，2002）。因此，研究香蕉NPC在抵御病原菌胁迫中的作用尤为必要。炭疽病病原菌在果实生长阶段（青果期）就可侵染果实，以附着孢侵入并以休眠状态潜伏于青果上，待果实成熟采收后才表现症状，所以果实成熟度越高，病害发生越严重，给香蕉采后的贮藏和运输带来极大挑战。本研究通过原核表达MaNPC1基因并制备多克隆抗体，对其进行抗血清效价测定，并运用Western blotting和实时荧光定量PCR检测在炭疽病侵染胁迫下MaNPC1蛋白的表达水平及MaNPC1基因的相对表达量，结果发现炭疽病侵染组MaNPC1蛋白表达水平和MaNPC1基因相对表达量均高于对照组，表明MaNPC1基因参与调控果实对炭疽病侵染胁迫的响应，其表达产物MaNPC1可提高香蕉果实抵抗炭疽病侵染的能力。Albrecht等（2008）研究也发现，甜橙在黄龙病胁迫下，与拟南芥AtNPC5基因同源的甜橙CsNPC基因表达量较对照（无黄龙病胁迫）增加了5倍，说明甜橙植株中CsNPC基因参与抵御黄龙病胁迫;Peters等（2010）通过拟南芥DNA微阵列数据分析发现，在接种病菌的植株中，AtNPC3和AtNPC4基因的表达量显著上升，证明拟南芥植株中NPC参与抵御病菌胁迫。
虽然本研究对MaNPC1基因进行生物信息学分析，包括亚细胞定位及跨膜结构预测等，其结果仅参考，后续还须通过拟南芥原生质体制备、PEG转化及激光共聚焦显微镜观察进行亚细胞定位。此外，本研究仅探究了MaNPC1基因，對于香蕉磷脂酶C基因家族的功能研究还远不够，后续应对整个香蕉磷脂酶C家族基因进行克隆及表达，进一步解析炭疽菌与香蕉磷脂酶C的关系。
4 结论
炭疽病侵染能提高MaNPC1蛋白表达水平，故推测MaNPC1蛋白参与香蕉果实抵抗炭疽病侵染。
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（責任编辑 陈 燕）
关键词： 香蕉;MaNPC1基因;原核表达;多克隆抗体;炭疽病;贮藏
中图分类号： S668.103.6 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）07-1753-09
Prokaryotic expression of banana MaNPC1 gene and preparation of its polyclonal antibody
SHUAI Liang1，2， YIN Fei-long1， LIAO Ling-yan1， LIU Yun-fen1， DUAN Zhen-hua1，
LI Li2， HE Xue-mei2， LI Chang-bao2， SUN Jian2*
（1School of Food and Biological Engineering，Hezhou University/Institute of Food Science and Engineering Technology，Hezhou， Guangxi 542899， China; 2Institute of Agro-products Processing Science and Technology， Guangxi Academy of Agricultural Sciences/Guangxi Key Open Laboratory of Crop Genetic Improvement Biotechnology/Guangxi Key Experiment of Storage and Processing New Technology for Fruits and Vegetables Laboratory
Cultivation Base， Nanning 530007， China）
Abstract：【Objective】Prokaryotic expression of the open reading frame（ORF） of banana fruit non-specific phospholipase C gene（MaNPC1） and preparation of its polyclonal antibody were conducted， to provide theoretical basis for in-depth exploration of the mechanism of MaNPC1 in banana fruit resistance to anthracnose. 【Method】The ORF sequence of MaNPC1 gene was cloned， bioinformatics analysis and antigenicity prediction were carried out， and its prokaryotic expression vector was constructed by double enzyme digestion method， and the heat shock method was used to transfer it into Escherichia coli Rosetta 2（DE3） competent cell for induction expression， and the recombinant protein was purified by Ni-NTA resin chromatography column to immunize New Zealand rabbits to prepare polyclonal antibodies. At the same time， Western blotting and real-time fluorescent quantitative PCR were used to detect the MaNPC1 protein expression level and the relative expression level of MaNPC1 gene under the stress of anthracnose infection during banana fruit sto-rage. 【Result】The pGEX-6p-3-MaNPC1 recombinant plasmid was double-enzyme digested to obtain a specific band of 1650 bp， indicating that the prokaryotic expression vector was successfully constructed and transferred to E. coli Rosetta 2 （DE3） competent cell for successful expression. The molecular formula of MaNPC1 protein was C2747H4249N769O793S10， the molecular weight was 61.06 kD， and the theoretical isoelectric point（pI） was 8.96; the contents of alanine， valine， leucine and serine were high， accounting for 8.7%， 8.2%， 7.8% and 7.7% of the total number of amino acids， respectively; the instability index was 47.14， indicating that it was an unstable protein. The protein antigen segment was rich and the number of hydrophilic amino acids was higher than that of hydrophobic amino acids， which was easy for subsequent antibody preparation. The prepared polyclonal antibody had a higher titer of 1：2048000. Western blotting analysis showed that the MaNPC1 protein expression level of banana fruits showed an upward-decreasing-increasing trend during storage. The MaNPC1 protein expression level of the anthracnose infection group was lower than that of the control group when stored for 15 d， and the other storage time was slightly higher than the control group. Real-time fluorescent quantitative PCR detection showed that the relative expression of MaNPC1 gene showed a gradual upward trend during storage of banana fruits; after storage for 3 to 15 d， the relative expression of MaNPC1 gene in the anthracnose infection group was significantly higher than that in the control group（P<0.05）. 【Conclusion】Anthracnose infection can increase the expression level of MaNPC1 protein， indicating that MaNPC1 protein participates in banana fruit resistance to anthracnose infection. Key words： banana; MaNPC1 gene; prokaryotic expression; polyclonal antibodies; anthracnose; storage
Foundation item：National Natural Science Foundation of China（31660589）; Guangxi Natural Science Foundation （2018GXNSFBA281118，2019GXNSFAA185027）; The Basic Ability Enhancement Project for Young and Middle-aged Teachers of Guangxi（2020KY18020）
0 引言
【研究意义】香蕉为芭蕉科（Musaceae）芭蕉属（Musa）单子叶植物，是生长于热带亚热带地区的一种重要经济作物和粮食作物，也是全球鲜销量最大的水果（Huang et al.，2014;王芳等，2016）。自2011年起我国香蕉产量跃居世界第二，并呈逐年增长趋势，香蕉产业已成为我国热带地区的重要支柱产业之一（王芳等，2016）。香蕉为典型的呼吸跃变型水果，同时又是冷敏性水果，在采收和运输过程中，冷害、病害及机械伤害等造成的损失相当严重（Huang et al.，2012;Ketsa et al.，2013;王海波等，2018）。我国的香蕉采后损耗率高达50%左右，远高于果蔬采后的平均损耗率25%（谢建华和庞杰，2010）。非特异性磷脂酶C（Non-specific PLC，NPC）能水解磷脂酸胆碱和磷脂酰乙醇胺生成二酰基甘油（DAG），在采后果蔬贮藏过程中发挥重要作用，尤其是在植物逆境胁迫及脱落酸、油菜素内酯等激素信号传导途径中发挥重要的调节作用（帅良等，2019）。因此，原核表达香蕉NPC1基因（MaNPC1），并制备其多克隆抗体，运用Western blotting探究香蕉果实贮藏过程中MaNPC1基因表达量变化，对探究香蕉果实中NPC的生物学功能及作用机制具有重要意义。【前人研究进展】至今，已从水稻（Chrastil and Parrish，1987）、拟南芥（Peters et al.，2010）、谷子（胡利芹等，2015）、陆地棉（Song et al.，2017）等植物中克隆出NPC基因。早期研究并未发现植物NPC为植物磷脂酶家族成员，后期经过多序列比对和结构域预测才得以证实（Nakamura and Awai，2005）。NPC分泌蛋白具有典型的磷脂酶活性，且具有磷脂酶特有的磷酸酯酶结构域，但不含其他植物脂质信号转导蛋白特有的XY和PX等结构域，一般由510～540个氨基酸残基组成。多数植物的NPC分泌蛋白N端具有一个信号肽，信号肽后面有一段高度保守序列和一个短的可变区域，其中，高度保守序列位于磷酸酯酶域前方（帅良等，2019）。Krcková等（2015）在大肠杆菌重组表达拟南芥NPC，并进行体外活性检测，结果发现NPC1、NPC2、NPC3、NPC4和NPC5均具有磷脂酶活性，但NPC6不具有磷脂酶活性。与植物中的其他脂质信号转导蛋白不同，NPC活性不受Ca2+的影响，但易受Triton X-100、EGTA、NP-40和Al3+等的影响，其中，NP-40作为表面活性抑制剂，能抑制NPC活性，且抑制程度与其浓度在一定范围成正比（Reddy et al.，2010）;Al3+则通过阻碍NPC与细胞膜的结合进而抑制NPC活性（Pejchar and Martinec，2015）。大量研究结果显示，在长期经受生物胁迫（Albrecht and Bowman，2008）、非生物胁迫（Peters et al.，2014）和激素处理（Rinukshi et al.，2010）下，植物的NPC活性及其基因表达均会发生改变，表明NPC参与植物对环境和生物刺激的各种代谢反应。此外，NPC参与了生物胁迫特别是病原菌造成的病害胁迫响应。如在甜橙感染黄龙病后，与拟南芥AtNPC5基因同源的甜橙CsNPC基因表达量较对照（无黄龙病胁迫）增加了5倍（Albrecht and Bowman，2008）;使用来自细菌的激发子flgg22和Hprz处理拟南芥，结果发现拟南芥中AtNPC1和AtNPC4基因表达量有所改变（帅良等，2019）。【本研究的切入点】目前，已有大量应用各种载体在不同表达系统成功表达重组蛋白，并以其免疫动物制备抗体的研究报道，但未见针对香蕉NPC的相关研究报道。【拟解决的关键问题】克隆MaNPC1基因开放阅读框（ORF），对其进行生物信息学分析及抗原性预测，并通过双酶切法构建其原核表达载体，利用热激法转入大肠杆菌Rosetta 2（DE3）感受态细胞中进行诱导表达，重组蛋白经Ni-NTA树脂层析柱纯化后免疫兔子，以制备多克隆抗体;同时运用Western blotting和实时荧光定量PCR分别检测香蕉果实贮藏过程中MaNPC1蛋白表达水平及MaNPC1基因相对表达量，为揭示MaNPC1在香蕉果实抵御炭疽病中的作用机制提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
供试香蕉品种宝岛蕉（M. acuminata L. AAA Cavendish‘Formosana’）由广西农业良种海南南繁育种基地提供，采收成熟度为七八成熟，挑选果形端正、无机械伤和病虫害的香蕉为试材，落梳后立即运回实验室，适当降温后，清水清洗晾干，选择大小相近、成熟度相同，且未受感染和生理损伤的香蕉果实，随机分成试验组和對照组。香蕉炭疽病菌分生孢子悬液（106个孢子/mL）由广西农业科学院微生物研究所提供;质粒DNA提取试剂盒和PCR产物纯化试剂盒均购自爱思进（Axygen）生物技术有限公司;引物合成及测序委托生工生物工程 （上海） 股份有限公司完成。 1. 2 试验方法
1. 2. 1 样品处理 对刚采摘的果实进行人工喷雾接种香蕉炭疽病菌分生孢子悬液（106个孢子/mL），以喷雾蒸馏水作对照组。处理后用0.03 mm厚聚乙烯薄膜袋包装，置于20 ℃下贮藏，观察炭疽病发生情况。接种前取一次果实用于MaNPC1基因克隆。接种后每3 d取样一次，每次从6个果实上取样，设3次重复，样品经液氮速冻后置于-80 ℃超低温冰箱冻藏，用于检测香蕉果实贮藏过程中MaNPC1蛋白表达水平及MaNPC1基因相对表达量。
1. 2. 2 MaNPC1基因ORF克隆 基于课题组前期克隆的香蕉MaNPC1基因全长序列2090 bp（GenBank登錄号LOC103995036），利用ORF Pinder查找其ORF，通过Prime Premier 5.0设计ORF特异性扩增引物（MaNPC1-F1：5'-GAACCCGGGTGATGGATT CGGGGGTCCAG-3'，划线处为SmaⅠ酶切位点;Ma-NPC1-R1：5'-CTTCGCGGCCGCTTATCAAATGCTT TGGACGGA-3'，划线处为Not Ⅰ酶切位点）。以cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系25.0 μL：cDNA模板2.0 μL，2×PCR Buffer for KOD FX 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，RNase-free H2O补足至25.0 μL。扩增程序：95 ℃预变性3 min;95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，进行30个循环;72 ℃延伸5 min，4 ℃终止。
1. 2. 3 生物信息学分析及抗原性预测 参考帅良等（2020）的方法进行MaNPC1蛋白结构分析及抗原性预测。采用ExPASy中的ProtScale进行蛋白亲/疏水性预测;采用TMHMM server v.2.0进行跨膜区预测;使用SignalP 5.0预测蛋白信号肽;通过在线网站（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）;使用PredictProtein对蛋白二级结构进行预测;使用Protean中的Jameson-Wolf方法对香蕉MaNPC1蛋白抗原指数进行预测分析。
1. 2. 4 原核表达载体构建 参考刘云芬（2016）的方法构建原核表达载体。具体步骤：以Sma Ⅰ和Not Ⅰ双酶切pGEX-6p-3-GST质粒载体和MaNPC1基因ORF，通过T4 DNA连接酶将二者连接后获得重组质粒pGEX-6p-3-GST-MaNPC1，利用热激法将其转入大肠杆菌Rosetta 2（DE3）感受态细胞中，筛选出阳性重组菌株，经PCR扩增及电泳检测验证后送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将测序结果与参考序列进行比对分析。
1. 2. 5 蛋白表达及可溶性分析 参考陈伟等（2019）的方法进行MaNPC1蛋白表达及可溶性分析。具体步骤：重组菌株振荡培养约2.5 h（OD600达0.6～0.8）后加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG，分别诱导表达3和6 h，以未加入IPTG为对照组;离心收集菌体后进行超声波破碎，使用1 mL裂解缓冲液悬浮离心后，分别取上清液和沉淀液各50.0 μL进行SDS-PAGE电泳检测。
1. 2. 6 包涵体蛋白纯化 参考胡平各等（2020）的方法进行MaNPC1蛋白纯化。具体步骤：将收集的沉淀加入Ni-NTA树脂层析柱中，流速控制在0.5 mL/min，收集穿柱液体。以10倍柱床体积的NTA-0、NTA-20、NTA-60、NTA-200和NTA-500 Buffer进行洗脱，收集各洗脱峰，取少量洗脱液进行SDS-PAGE电泳检测，其余洗脱液置于透析袋中，4 ℃下以1×PBS透析，并超滤浓缩透析产物。
1. 2. 7 多克隆抗体制备及免疫效价检测 参考张永德等（2018）的方法进行多克隆抗体制备及免疫效价检测。具体步骤：以纯化的重组蛋白免疫注新西兰兔，每次注射的重组蛋白用量为200 μg，每间隔7 d对2只兔子进行1次加强免疫，每只兔子免疫4～5次，并采用间接ELISA法测定血清抗体效价，当（阳性血清OD450-空白孔OD450）/（阴性血清OD450-空白孔OD450）>2.1时，阳性血清最大稀释倍数即为血清抗体效价。待抗体表达恒定后，采集血样并分离血清，置于-20 ℃冰箱保存备用。
1. 2. 8 香蕉组织蛋白提取及定量分析 参考刘云芬（2016）的方法提取MaNPC1蛋白。具体步骤：称取5 g香蕉果皮组织，液氮下研磨成粉，加入20 mL蛋白提取液（含0.1 mmol/L Tris-HCL、1% β-巯基乙醇、0.1% Triton-X100、1 mmol/L PMSF和10% PVP，pH 9.0），4 ℃下15000 r/min离心20 min，收集上清液。MaNPC1蛋白定量采用Bradford法。参考程彦伟等（2008）的方法进行SDS-PAGE电泳，上样量为7 μg。
1. 2. 9 Western blotting检测 Western blotting检测参考张庆嫒等（2020）的方法。具体步骤：待蛋白定量后，取相应蛋白与上样缓冲液混合，经沸水浴5 min使蛋白变性，取出后10000 r/min离心1 min，吸取20.0 μL蛋白样品上样。参考考马斯亮蓝染色结果，记录目的蛋白的位置，以指导转膜时切胶的位置。采用干法转膜，20 V转膜15 min，用二抗—辣根酶标记羊抗兔IgG-HRP。
1. 2. 10 实时荧光定量PCR检测 RNA提取和反转录合成cDNA均参考帅良等（2020）的方法，采用实时荧光定量PCR检测MaNPC1基因相对表达量。以MaCAC为内参基因，配制10.0 μL反应体系置于Roche Lightcycler? 480实时荧光定量PCR仪上进行检测，MaNPC1基因相对表达量采用2-△△Ct法计算。所用的实时荧光定量PCR扩增引物如表1所示。 1. 3 统计分析
使用Excel 2013进行数据处理和分析，使用Origin 8.5作图。
2 结果与分析
2. 1 MaNPC1基因ORF克隆结果
以香蕉果皮cDNA为模板、MaNPC1-F1和Ma-NPC1-R1为引物进行PCR扩增，结果获得约1600 bp的条带（图1）。经测序比对分析，发现该片段为MaNPC1基因ORF序列，长度为1650 bp，共编码549个氨基酸残基。该片段可用于后续原核表达载体的构建。
2. 2 MaNPC1蛋白生物信息学分析结果
2. 2. 1 同源比对分析结果 通过DNAMAN 6.0对3个香蕉NPC蛋白（MaNPC1、MaNPC2和MaNPC6）进行氨基酸序列比对分析，结果显示这3个蛋白的氨基酸序列相似性较高，尤其是中间序列相似性较高，N端和C端相似性较低（图2），表明中间序列可能存在NPC蛋白的核心序列。
2. 2. 2 理化性质预测结果 MaNPC1蛋白分子式为C2747H4249N769O793S10，分子量为61.06 kD，理论等电点（pI）为8.96，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和丝氨酸含量较高，分别占氨基酸总数的8.7%、8.2%、7.8%和7.7%，不含吡咯赖氨酸和硒半胱氨酸，不稳定指数为47.14，表明其为不稳定蛋白。
2. 2. 3 亲/疏水性分析结果 MaNPC1蛋白亲/疏水性预测结果（图3）显示，MaNPC1蛋白的最大亲水性指数为-1.578、最大疏水性指数为2.079，平均为 -0.348，亲水性氨基酸数目明显高于疏水性氨基酸，表明为亲水蛋白。因此，利用MaNPC1蛋白制备多克隆抗体具有较强的可行性。
2. 2. 4 跨膜结构预测结果 MaNPC1蛋白跨膜结构预测结果如图4所示。MaNPC1蛋白存在一个跨膜结构，其跨膜螺旋（TMhelix）位于第13～32位氨基酸，推测MaNPC1为分泌性蛋白，有利于后续Wes-tern blotting检测时组织蛋白的提取。同时，其余氨基酸无明显的跨膜结构，降低了跨膜区疏水性氨基酸对蛋白折叠的影响，易于表达和纯化。
2. 2. 5 信号肽预测结果 MaNPC1蛋白信号肽预测结果（图5）显示，该蛋白存在信号肽的可能性为0.5386（>0.5000），即存在信号肽。最有可能的剪切位点位于第31～32位氨基酸间，AHC-LD可能性为0.2918，与TMHMM预测获得的跨膜结构一致。进一步说明MaNPC1蛋白为分泌性蛋白，有利于后续Western blotting检测时组织蛋白的提取。
2. 2. 6 亚细胞定位及结构预测结果 对MaNPC1蛋白氨基酸序列进行亚细胞定位，结果显示，Ma-NPC1可能定位于细胞壁或叶绿体。使用PredictProtein对蛋白二级结构进行预测，结果显示，Ma-NPC1蛋白二级结构中α-螺旋占14.57%、延伸链占7.1%、无规则卷曲占78.32%。以SWISS-MODEL预测MaNPC1蛋白三级结构，结果（图6）显示，MaNPC1蛋白有数个由N端构成的小突出结构域和由中间序列及C端组成的大结构域组成，与二级结构预测结果相符，证明三级结构预测结果准确。Pfam对结构域的预测结果如图7所示。MaNPC1蛋白含1个典型的磷酸酯酶域（PF04185），具有酯酶活性。
2. 2. 7 抗原指数分析结果 由图8可看出，Ma-NPC1蛋白抗原指数较高的区段为第8～15、28～54、60～67、72～78、110～118、126～135、186～198、225～231、265～278、287～304、330～337、363～370、386～401、414～422、434～465、476～484和485～493位氨基酸。这些位点除抗原指数较高外，多数还具备较强的亲水性，因此，采用MaNPC1蛋白制备多克隆抗体具有较强的可行性。
2. 3 MaNPC1基因表达载体构建及鉴定结果
由图9可知，重组质粒pGEX-6p-3-MaNPC1经双酶切后得到1650 bp的特异性条带，说明原核表达载体构建成功。
2. 4 重组蛋白表达及鉴定结果
由图10可知，含重组质粒pGEX-6p-3-MaNPC1的大肠杆菌Rosetta2（DE3）经IPTG诱导表达3和6 h后，沉淀中均产生大量分子量约60 kD（含GST）的目的表達产物，与预期结果相符，而在上清液中未出现大量表达产物，说明重组蛋白主要以不溶性的包涵体形式存在。
2. 5 多克隆抗体效价测定结果
利用直接ELISA对最后一次免疫获得的动物血清样品进行抗体效价测定，结果图11所示。随着稀释倍数的增加，抗体效价逐渐下降，当稀释倍数为1∶2048000时1号兔子抗体的OD450与空白孔的OD450比值为2.19，2号兔子抗体的OD450与空白孔的OD450比值为2.12，因此稀释倍数1∶2048000为该多克隆抗体的效价，说明重组蛋白MaNPC1可诱导新西兰兔产生良好的免疫反应，抗体效价较高。
2. 6 Western blotting检测结果
由图12可知，200、100和10 ng重组蛋白的泳道（约60 kD位置）上均出现1条清晰且与阳性血清反应的蛋白条带，其中200 ng重组蛋白条带最清晰，表明MaNPC1抗血清具有特异的反应特性。
2. 7 MaNPC1蛋白表达水平的检测结果
由图13可知，香蕉果实贮藏过程中MaNPC1蛋白表达水平呈上升—下降—上升的变化趋势;炭疽病侵染组MaNPC1蛋白除贮藏15 d时的表达水平较对照组低外，其他时间均略高于对照组。由此可知，炭疽病侵染能提高MaNPC1蛋白表达水平，故推测MaNPC1蛋白参与香蕉果实抵抗炭疽病侵染。 2. 8 MaNPC1基因相对表达量的检测结果
由图14可知，MaNPC1基因的相对表达量在香蕉果实贮藏过程中呈逐渐上升趋势;贮藏3～15 d，炭疽病侵染组MaNPC1基因的相对表达量均显著高于对照组（P<0.05）。这与香蕉果实贮藏过程中炭疽病侵染能提高MaNPC1蛋白表达水平的结论一致，进一步证明MaNPC1基因参与调控果实对炭疽病侵染胁迫的响应，其表达产物MaNPC1可提高香蕉果实抵抗炭疽病侵染的能力。
3 讨论
目前，以原核表达的重组蛋白免疫不同动物（兔子和鼠等）制备多克隆抗体已成为一种行之有效且常用的方法（程彦伟等，2008）。此外，通过原核表达可获得大量的抗原蛋白，可用于蛋白性质和功能、蛋白间相互作用及多种生化功能研究（王增等，2009）。现已研究证实，磷脂酶在植物的防御反应中发挥重要作用（Laxalt and Munnik，2002;Canonne et al，2011），尤其是NPC在植物防御病原菌胁迫反应中发挥重要作用（Scherer et al，2002）。因此，研究香蕉NPC在抵御病原菌胁迫中的作用尤为必要。炭疽病病原菌在果实生长阶段（青果期）就可侵染果实，以附着孢侵入并以休眠状态潜伏于青果上，待果实成熟采收后才表现症状，所以果实成熟度越高，病害发生越严重，给香蕉采后的贮藏和运输带来极大挑战。本研究通过原核表达MaNPC1基因并制备多克隆抗体，对其进行抗血清效价测定，并运用Western blotting和实时荧光定量PCR检测在炭疽病侵染胁迫下MaNPC1蛋白的表达水平及MaNPC1基因的相对表达量，结果发现炭疽病侵染组MaNPC1蛋白表达水平和MaNPC1基因相对表达量均高于对照组，表明MaNPC1基因参与调控果实对炭疽病侵染胁迫的响应，其表达产物MaNPC1可提高香蕉果实抵抗炭疽病侵染的能力。Albrecht等（2008）研究也发现，甜橙在黄龙病胁迫下，与拟南芥AtNPC5基因同源的甜橙CsNPC基因表达量较对照（无黄龙病胁迫）增加了5倍，说明甜橙植株中CsNPC基因参与抵御黄龙病胁迫;Peters等（2010）通过拟南芥DNA微阵列数据分析发现，在接种病菌的植株中，AtNPC3和AtNPC4基因的表达量显著上升，证明拟南芥植株中NPC参与抵御病菌胁迫。
虽然本研究对MaNPC1基因进行生物信息学分析，包括亚细胞定位及跨膜结构预测等，其结果仅参考，后续还须通过拟南芥原生质体制备、PEG转化及激光共聚焦显微镜观察进行亚细胞定位。此外，本研究仅探究了MaNPC1基因，對于香蕉磷脂酶C基因家族的功能研究还远不够，后续应对整个香蕉磷脂酶C家族基因进行克隆及表达，进一步解析炭疽菌与香蕉磷脂酶C的关系。
4 结论
炭疽病侵染能提高MaNPC1蛋白表达水平，故推测MaNPC1蛋白参与香蕉果实抵抗炭疽病侵染。
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（責任编辑 陈 燕）