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摘要 目的：探討加味清心莲子饮对阿霉素肾病综合征大鼠的疗效及对尿蛋白、血液生化指标、炎症介质的影响。方法：利用尾静脉注射阿霉素建立大鼠肾病综合征模型，分别给予泼尼松灌胃和加味清心莲子饮灌胃，同时设置对照组、模型组。实验过程中对大鼠进行一般形态学观察，每周检测24 h蛋白尿;实验末采血分离血清，对血清中清蛋白（ALB）、总蛋白（TP）、三酰甘油（TG）、胆固醇（TC）、血尿素氮（BUN）、血清肌酐（Scr）水平进行检测;利用ELISA法对血清炎症介质白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-8（IL-8）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）水平进行检测。结果：模型组的24 h尿蛋白水平与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.01）。给药后，激素组、中药组大鼠24 h尿蛋白含量均明显降低（均P<0.01）。与对照组比较，模型组血清TG、TC、BUN、Scr水平均明显升高（均P<0.01）;血清ALB、TP水平均明显降低（均P<0.01）。给药后，激素组、中药组血清TG、TC、BUN、Scr水平均降低（均P<0.01，P<0.05）;血清ALB、TP水平均明显升高（均P<0.01）。与对照组比较，模型组血清IL-1β、IL-8、TNF-α、MCP-1水平均升高（均P<0.05）;给药后，激素组、中药组血清IL-1β、IL-8、TNF-α、MCP-1水平均降低（均P<0.05）。结论：加味清心莲子饮能够治疗阿霉素肾病综合征，作用机制为调节炎症介质的表达，改善病理损伤，恢复肺、脾、肾脏的功能。
关键词 加味清心莲子饮;肾病综合征;大鼠;实验研究;24 h尿蛋白;血液生化指标;炎症介质;白细胞介素-1β、白细胞介素-8、肿瘤坏死因子-α、单核细胞趋化蛋白-1
Experimental Study on the Treatment of Adriamycin Nephrotic Syndrome in Rats with Jiawei Qingxin Lianzi Drink
ZHANG Yongzheng1，WANG Hai1，CHEN Yanyan1，XU Yongliang1，YANG Xu1，DENG Xiaye2
（1 The First Affiliated Hospital，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China; 2 Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China）
Abstract Objective：To investigate the therapeutic effect of Jiawei Qingxin Lianzi Drink on the curative effects of adriamycin nephrotic syndrome（NS） rats and its effects on proteinuria，blood biochemical indexes and inflammatory factors.Methods：The nephrotic syndrome model of rats was established by injecting adriamycin into tail vein.The rats were given prednisone and modified Jiawei Qingxin Lianzi Drink by gavage respectively，and the control group and model group were set up at the same time.During the experiment，the general morphology of rats was observed，24-hour proteinuria was detected every week.At the end of the experiment，blood was collected to separate serum，and the contents of ALB，TP，TG，TC，BUN and Scr in serum was detected，and the contents of IL-1 β，IL-8，TNF-α and MCP-1 in serum was detected by ELISA.Results：Compared with the control group，the 24 h urine protein content of the model group was significantly different（P<0.01）.After administration，the 24 h urine protein content of the hormone group and Chinese medicinal group was significantly reduced（P<0.01）.Compared with the blank group，the serum TG，TC，BUN，and Scr levels in the model group were significantly increased（all P<0.01）; the serum ALB and TP levels were significantly decreased（P<0.01）.After administration，serum TG，TC，BUN，and Scr levels in the hormone group and Chinese medicine group decreased（P<0.01，P<0.05）; serum ALB and TP levels increased significantly（all P<0.01）.After administration，serum TG，TC，BUN，and Scr levels in the hormone group and Chinese medicinal group decreased（all P<0.01，P<0.05）; serum ALB and TP levels increased significantly（all P<0.01）.Compared with the control group，the serum levels of IL-1β，IL-8，TNF-α，and MCP-1 in the model group increased（all P<0.05）; after administration，the serum IL-1β，IL-8，NF-α，MCP-1 levels in the hormone group and the Chinese medicinal group decreased（all P<0.05）.Conclusion：Modified Qingxin Lianzi Drink can treat adriamycin nephrotic syndrome.The mechanism of action is to regulate the expression of inflammatory factors，improve pathological damage，and restore lung，spleen，and kidney functions. Keywords Modified Qingxin Lianzi Drink; Nephrotic syndrome; Rat; Experimental study; 24-hour proteinuria; Blood biochemical indexes; Inflammatory factors; IL-1 β; IL-8; TNF-α; MCP-1
中图分类号：R285.5;R692.6文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.16.008
肾病综合征（Nephrotic Syndrome，NS）是以大量蛋白尿、低蛋白血症、水肿、高脂血症为基本特征的一类临床综合征，儿童期发病率较高。其主要发病机制为肾脏滤过膜的正常电荷屏障和分子屏障功能发生障碍，肾小球对血浆中蛋白质的通透性增加，血浆清蛋白从尿中大量流失，超出承受极限，从而出现一系列症状[1-2]。在治疗NS的药物中，糖皮质激素（Glucocorticoid，GCs）为首选药物之一，是治疗规范的最成熟、最有经验的药物，但是在治疗NS过程中使用糖皮质激素亦可引起一系列的不良反应[3]。
NS属中医学“水肿”“尿浊”等范畴。在轻证NS治疗中，单纯应用中药治疗，可以达到促使蛋白尿转阴、病情缓解的治疗效果，避免了应用糖皮质激素的不良反应。而在已应用糖皮质激素治疗NS的情况下，加用中医辨证治疗，亦具有明显的增效减毒作用。加味清心莲子饮是“国医大师”张琪教授经验名方，其是在清心莲子饮原方基础上加用益母草、白花蛇舌草、萆薢组成，该方加减用于治疗NS，疗效显著。本研究在此基础上探讨加味清心莲子饮对阿霉素NS大鼠的疗效及对尿蛋白、血液生化指标、炎症介质的影响。
1 资料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 SPF级健康雄性SD大鼠32只，体质量（200±20）g，由黑龙江中医药大学药物安全性评价中心提供（动物许可证号：SCXK（黑）2013-004）。经黑龙江中医药大学附属第一医院伦理委员会批准（伦理审批号：HZY201911005），将动物饲养于黑龙江中医药大学实验动物研究中心，普通饲料，自由饮水，环境温度25 ℃，湿度40%～70%。
1.1.2 药物 阿霉素注射用干粉（海正辉瑞制药有限公司，批号：190318），用注射用水溶解为2 mg/mL的药液。泼尼松（天津天药药业股份有限公司，批号：CP190129），用生理盐水（哈尔滨三联药业股份有限公司，批号：20190116）溶解成0.6 g/mL的药液备用[4]。
中药饮片购于黑龙江中医药大学附属第一医院。中药饮片：黄芪（批号：200118）、麦冬（批号：191204）、党参（批号：200314）、地骨皮（批号：201021）、黄芩（批号：200527）、车前子（批号：200608）、柴胡（批号：200507）、石莲子（批号：200419）、茯苓（批号：200226）、白花蛇舌草（批号：200330）、萆薢（批号：200409）、益母草（批号：200205）、炙甘草（批号：200610）。将加味清心莲子饮（黄芪30 g、麦冬15 g、党参20 g、地骨皮20 g、黄芩15 g、车前子15 g、柴胡15 g、石莲子15 g、茯苓20 g、白花蛇舌草30 g、萆薢20 g、益母草30 g、炙甘草10 g）加水浸泡1 h后加热煮沸，文火保持30 min的沸腾，搅拌后趁热将药液滤出;再加水煮沸，文火进行60 min的续煎后将药液滤出，将2次药液合并，浓缩成2.6 g/mL的药液，在4 ℃的冰箱中放置冷藏备用。
1.1.3 试剂与仪器 考马斯亮蓝G250蛋白染色剂（上海迈联生物工程有限公司，货号：LM-445）;IL-1β试剂盒、IL-8试剂盒、TNF-α试剂盒、MCP-1试剂盒（上海源叶生物科技有限公司，货号：H20200725、H20200817、H20200829、H20200709）;全自动生化分析仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，型号：BS-270）;高速冷冻离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司，型号：KDC-160HR）。
1.2 方法
1.2.1 分组与模型制备 将大鼠适应性喂养1周后，收集尿液，检测大鼠尿蛋白，剔除尿蛋白定性>“++”的大鼠。采用随机数字表法将大鼠分为对照组、模型组、激素组、中药（加味清心莲子饮）组。除对照组外，其余3组大鼠经尾静脉注射浓度为2 mg/mL的阿霉素注射液，注射剂量为6.5 mg/kg[5]，对照组大鼠注射等剂量的生理盐水，均以尾部无迂曲、肿胀为注射成功。于造模前1 d和造模后第7天，收集24 h尿液，对各组大鼠24 h尿蛋白含量进行测定，验证大鼠NS造模是否成功。
1.2.2 给药方法 于造模后第7天開始按照下列方式给药，共给药4周。1）对照组、模型组：生理盐水10 mL/kg灌胃，1次/d。2）激素组：泼尼松6 g（10 mL）/kg灌胃，1次/d。3）中药组：按26 g（10 mL）/kg生药量加味清心莲子饮灌胃，1次/d。
1.2.3 检测指标与方法 1）一般形态学观察。每周观测各组大鼠的精神状态、体质量、体毛、爪、耳色泽、进食水量及活动情况。2）24 h尿蛋白检测。各组大鼠在给药治疗后每周收集24 h尿液，记录尿量，共4次，用考马斯亮蓝法测定OD值，计算24 h尿蛋白含量。3）血液生化指标检测。于末次给药后48 h，以摘除眼球的方法取血，采血后静置15 min，以转速3 000 r/min，离心半径10 cm，离心5 min，取上清液，利用全自动生化分析仪对血清中白蛋白（ALB）、总蛋白（TP）、三酰甘油（TG）、胆固醇（TC）、血尿素氮（BUN）、血清肌酐（Scr）的含量进行检测。4）血清炎症介质检测。利用ELISA法检测血清中IL-1β、IL-8、TNF-α、MCP-1的水平。 1.3 统计学方法 采用SPSS 23.0统计软件对研究数据进行分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，进行正态性检验及方差齐性检验。方差齐性，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法;方差不齐性，多组间比较采用非参数检验，组间独立样本的多重比较采用扩展的t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组大鼠一般形态学观察 对照组大鼠一般状况良好，体质量持续增加。其他组大鼠在造模开始后逐渐出现不同程度的精神不振或烦躁，体质量下降，体毛粗糙蓬松脱落，活动减少，进食量下降，造模后期出现腹泻，阴囊水肿，部分大鼠出现足趾水肿。从灌胃第2周开始，激素组、中药组大鼠一般状况逐渐改善，进食增多，活动增多，腹泻缓解，水肿好转，体质量缓慢增加，但仍不如对照组大鼠。模型组一般状况改善不明显，体质量持续减少。实验过程中共死亡大鼠6只，其中造模过程中死亡5只，给药过程中模型组死亡1只。
2.2 各组大鼠HE染色情况 从肾脏形态学观察，正常对照组大鼠未见明显病变。模型组肾小球轻度萎缩，少许炎症细胞浸润，球囊壁轻度增厚，小球囊腔轻度扩张，系膜细胞增殖，毛细血管充血。给药组肾小管管腔轻微变形，肾小球囊腔扩张，肾脏组织空泡和纤维化程度都比模型组有明显的改善。
2.3 各组大鼠24 h尿蛋白检测 造模前1 d各组大鼠24 h尿蛋白定量比较，差异无统计学意义（P>0.05）。造模后第7天，对照组大鼠24 h尿蛋白定量与造模前1 d比较，差异无统计学意义（P>0.05），模型组、激素组、中药组大鼠24 h尿蛋白定量与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.01），3组比较差异无统计学意义（P>0.05）。整个实验过程对照组大鼠24 h尿蛋白定量变化不明显。与对照组比较，模型组、激素组、中药组大鼠24 h尿蛋白定量均明显升高（均P<0.01）。灌胃第2周开始，激素组、中药组大鼠24 h尿蛋白定量开始逐渐下降，模型组24 h尿蛋白定量下降不明显。灌胃第3、4周，激素组、中药组大鼠24 h尿蛋白定量明显低于模型组（P<0.01）。激素组、中药组大鼠24 h尿蛋白定量比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。
2.4 各组大鼠血液生化指标检测 与模型组比较，对照组血清TG、TC、BUN、Scr水平均明显升高（均P<0.01）;血清ALB、TP水平均明显降低（均P<0.01）。激素组、中药组较模型组血清TG、TC、BUN、Scr水平均降低（均P<0.01，P<0.05）;血清ALB、TP水平均明显升高（均P<0.01）。中药组、激素组血清TG、TC、BUN、Scr、ALB、TP水平与对照组比较，差异均无统计学意义（均P>0.05）。见表2。
2.5 各组大鼠血清炎症介质检测 模型组血清IL-1β、IL-8、TNF-α、MCP-1水平较对照组升高（P<0.05）;激素组、中药组血清IL-1β、IL-8、TNF-α、MCP-1水平低于模型组（P<0.05），与对照组比较，差异无统计学意义（均P>0.05）。中药组血清IL-1β、IL-8、TNF-α、MCP-1水平与激素组比较，差异均无统计学意义（均P>0.05）。见表3。
3 讨论
NS的发生多因感受风邪、水湿、疮毒、饮食起居失常或久病劳倦所致，其基本病理变化为肺失通调，脾失转输，肾失开阖，而致膀胱气化无权，三焦气化不利，水液停聚外泛肌肤，发为水肿。其病位在脾、肺、肾，以肾为本，肺为标，脾为制。病因病机错综复杂，在致病过程中易感外邪而加重病情[6-7]。糖皮质激素作为治疗NS的首选药物，具有广泛的生物学作用，对蛋白质、糖、水盐代谢及机体的生长发育有重要的生理调节作用，还具有抗炎、免疫抑制等多种药理作用，可以直接影响肾小球基底膜的通透性而发挥利尿、消除蛋白的作用。多项研究显示糖皮质激素可以调节相关免疫及炎症介质起到治疗NS的作用[8-9]。
清心莲子饮出自《太平惠民和剂局方》，可清心火，交心肾，益气阴，止淋浊，具有清心利湿、益气养阴的功用，主治心火妄动，气阴两虚，小便淋沥浑浊，尿时刺痛，遇劳即发，或有遗精，白浊带下，五心烦热，四肢倦怠，睡卧不安，口苦咽干，或口舌生疮等症[10]。方中人参、黄芪、甘草补益阳气而清虚火，地骨皮清肝肾虚火，柴胡散肝胆之火，麦冬清肺之火，茯苓、车前子利下焦湿热，再加上石莲子清心火而通肾水。在既往临床研究中，许多研究将清心莲子饮用于治疗肾系疾病，取得了明显疗效[11-13]。已有多位学者对清心莲子饮组成成分治疗肾系疾病的机制进行了研究，发现其不仅可以提高血浆总蛋白，降低尿蛋白，还可以调节炎症介质的水平，从而发挥治疗作用[14-16]。加味清心莲子饮由黄芪、麦冬、党参、地骨皮、黄芩、车前子、柴胡、石莲子、茯苓、益母草、萆薢、白花蛇舌草、甘草组成，是“国医大师”张琪教授经验名方，其组成是在清心莲子饮原方基础上加用益母草、白花蛇舌草、萆薢以加强利尿消肿、除湿去浊之功效。张琪教授应用该方多年，经验丰富，疗效显著[17-20]。
阿霉素NS模型为目前公认的模拟肾病的模型，其表现接近临床的NS，其细胞模型能够较好地模拟肾小球足细胞的基本功能，应用于肾病的发病机制研究。在NS的主要表現中，大量蛋白尿是导致肾损害加重的最关键的危险因素，它可以导致肾小管、肾小球系膜细胞及足细胞产生不同程度的损伤。本研究发现肾小球基底膜界限不清，有明显增生，肾小管上皮细胞可见颗粒变性或萎缩，可见蛋白管型。大鼠造模后24 h尿蛋白定量与造模前1 d比较明显升高，说明NS大鼠造模成功。从灌胃第2周开始，激素组、中药组大鼠一般状况逐渐改善，说明加味清心莲子饮同激素一样对NS大鼠起到了治疗作用，使NS大鼠水肿减轻，饮食增加，症状好转。当肾小球滤过屏障损坏后，导致蛋白从尿液中大量丢失形成蛋白尿，且血浆蛋白和高密度脂蛋白的大量丢失会促进TG及TC在肝脏中的合成，最终导致脂质代谢紊乱形成高血脂。肾小球滤过功能严重受损时，还会降低Scr和BUN滤过，使其血液浓度增加[21]。本研究中，模型组大鼠尿蛋白和血清TG、TC、BUN、Scr较对照组显著升高，血清TP、ALB水平显著降低，可以进行后续的药物干预研究。激素组、中药组大鼠24 h尿蛋白、血清TG、TC、BUN、Scr含量较模型组有不同程度降低，血清TP、ALB含量升高，说明加味清心莲子饮和激素均对NS大鼠起到了降低尿蛋白、升高血清蛋白、降低血脂的作用。 肾小球系膜细胞可分泌多种炎症介质，如IL-1、TNF-α等，而这些细胞因子可通过自分泌及旁分泌作用使炎症效应不断扩大。IL-6为系膜细胞自分泌因子之一，是一种较IL-1更强的肾小球系膜细胞增生诱导剂。已经发现PDGF、IL-1、TNF-α可通过自分泌或旁分泌方式刺激系膜细胞IL-6的产生。IL-6在系膜增生及系膜增生性肾炎等肾小球炎症疾患的发病过程中起重要作用[22]。本研究中，模型组大鼠血清IL-1β、IL-8、TNF-α、MCP-1水平高于对照组，说明IL-1β、IL-8、TNF-α、MCP-1等因子参与了大鼠NS的发生、发展，这些因子的血清水平可以在一定程度上反映肾脏损害的程度。灌胃第4周，激素组、中药组大鼠血清IL-1β、IL-8、TNF-α、MCP-1水平低于模型组，与对照组接近，说明加味清心莲子饮和激素可以下调NS大鼠血清IL-1β、IL-8、TNF-α、MCP-1的水平。
本研究发现加味清心莲子饮组与激素组作用相当，证实加味清心莲子饮可以降低NS大鼠尿蛋白，改善其血液生化指标，并参与调节炎症介质的表达，能够改善病理损伤，恢复肺、脾、肾脏的功能，对NS起到治疗作用。但长期使用激素会引起一些不良反应，选用中药加味清心莲子饮治疗安全有效，在轻症NS的治疗中可作为优先选择的治疗方案，可以减轻或避免糖皮质激素的不良反应，增强对NS的治疗效果。
参考文献
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（2021-01-25收稿 责任编辑：杨燕）
关键词 加味清心莲子饮;肾病综合征;大鼠;实验研究;24 h尿蛋白;血液生化指标;炎症介质;白细胞介素-1β、白细胞介素-8、肿瘤坏死因子-α、单核细胞趋化蛋白-1
Experimental Study on the Treatment of Adriamycin Nephrotic Syndrome in Rats with Jiawei Qingxin Lianzi Drink
ZHANG Yongzheng1，WANG Hai1，CHEN Yanyan1，XU Yongliang1，YANG Xu1，DENG Xiaye2
（1 The First Affiliated Hospital，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China; 2 Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China）
Abstract Objective：To investigate the therapeutic effect of Jiawei Qingxin Lianzi Drink on the curative effects of adriamycin nephrotic syndrome（NS） rats and its effects on proteinuria，blood biochemical indexes and inflammatory factors.Methods：The nephrotic syndrome model of rats was established by injecting adriamycin into tail vein.The rats were given prednisone and modified Jiawei Qingxin Lianzi Drink by gavage respectively，and the control group and model group were set up at the same time.During the experiment，the general morphology of rats was observed，24-hour proteinuria was detected every week.At the end of the experiment，blood was collected to separate serum，and the contents of ALB，TP，TG，TC，BUN and Scr in serum was detected，and the contents of IL-1 β，IL-8，TNF-α and MCP-1 in serum was detected by ELISA.Results：Compared with the control group，the 24 h urine protein content of the model group was significantly different（P<0.01）.After administration，the 24 h urine protein content of the hormone group and Chinese medicinal group was significantly reduced（P<0.01）.Compared with the blank group，the serum TG，TC，BUN，and Scr levels in the model group were significantly increased（all P<0.01）; the serum ALB and TP levels were significantly decreased（P<0.01）.After administration，serum TG，TC，BUN，and Scr levels in the hormone group and Chinese medicine group decreased（P<0.01，P<0.05）; serum ALB and TP levels increased significantly（all P<0.01）.After administration，serum TG，TC，BUN，and Scr levels in the hormone group and Chinese medicinal group decreased（all P<0.01，P<0.05）; serum ALB and TP levels increased significantly（all P<0.01）.Compared with the control group，the serum levels of IL-1β，IL-8，TNF-α，and MCP-1 in the model group increased（all P<0.05）; after administration，the serum IL-1β，IL-8，NF-α，MCP-1 levels in the hormone group and the Chinese medicinal group decreased（all P<0.05）.Conclusion：Modified Qingxin Lianzi Drink can treat adriamycin nephrotic syndrome.The mechanism of action is to regulate the expression of inflammatory factors，improve pathological damage，and restore lung，spleen，and kidney functions. Keywords Modified Qingxin Lianzi Drink; Nephrotic syndrome; Rat; Experimental study; 24-hour proteinuria; Blood biochemical indexes; Inflammatory factors; IL-1 β; IL-8; TNF-α; MCP-1
中图分类号：R285.5;R692.6文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.16.008
肾病综合征（Nephrotic Syndrome，NS）是以大量蛋白尿、低蛋白血症、水肿、高脂血症为基本特征的一类临床综合征，儿童期发病率较高。其主要发病机制为肾脏滤过膜的正常电荷屏障和分子屏障功能发生障碍，肾小球对血浆中蛋白质的通透性增加，血浆清蛋白从尿中大量流失，超出承受极限，从而出现一系列症状[1-2]。在治疗NS的药物中，糖皮质激素（Glucocorticoid，GCs）为首选药物之一，是治疗规范的最成熟、最有经验的药物，但是在治疗NS过程中使用糖皮质激素亦可引起一系列的不良反应[3]。
NS属中医学“水肿”“尿浊”等范畴。在轻证NS治疗中，单纯应用中药治疗，可以达到促使蛋白尿转阴、病情缓解的治疗效果，避免了应用糖皮质激素的不良反应。而在已应用糖皮质激素治疗NS的情况下，加用中医辨证治疗，亦具有明显的增效减毒作用。加味清心莲子饮是“国医大师”张琪教授经验名方，其是在清心莲子饮原方基础上加用益母草、白花蛇舌草、萆薢组成，该方加减用于治疗NS，疗效显著。本研究在此基础上探讨加味清心莲子饮对阿霉素NS大鼠的疗效及对尿蛋白、血液生化指标、炎症介质的影响。
1 资料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 SPF级健康雄性SD大鼠32只，体质量（200±20）g，由黑龙江中医药大学药物安全性评价中心提供（动物许可证号：SCXK（黑）2013-004）。经黑龙江中医药大学附属第一医院伦理委员会批准（伦理审批号：HZY201911005），将动物饲养于黑龙江中医药大学实验动物研究中心，普通饲料，自由饮水，环境温度25 ℃，湿度40%～70%。
1.1.2 药物 阿霉素注射用干粉（海正辉瑞制药有限公司，批号：190318），用注射用水溶解为2 mg/mL的药液。泼尼松（天津天药药业股份有限公司，批号：CP190129），用生理盐水（哈尔滨三联药业股份有限公司，批号：20190116）溶解成0.6 g/mL的药液备用[4]。
中药饮片购于黑龙江中医药大学附属第一医院。中药饮片：黄芪（批号：200118）、麦冬（批号：191204）、党参（批号：200314）、地骨皮（批号：201021）、黄芩（批号：200527）、车前子（批号：200608）、柴胡（批号：200507）、石莲子（批号：200419）、茯苓（批号：200226）、白花蛇舌草（批号：200330）、萆薢（批号：200409）、益母草（批号：200205）、炙甘草（批号：200610）。将加味清心莲子饮（黄芪30 g、麦冬15 g、党参20 g、地骨皮20 g、黄芩15 g、车前子15 g、柴胡15 g、石莲子15 g、茯苓20 g、白花蛇舌草30 g、萆薢20 g、益母草30 g、炙甘草10 g）加水浸泡1 h后加热煮沸，文火保持30 min的沸腾，搅拌后趁热将药液滤出;再加水煮沸，文火进行60 min的续煎后将药液滤出，将2次药液合并，浓缩成2.6 g/mL的药液，在4 ℃的冰箱中放置冷藏备用。
1.1.3 试剂与仪器 考马斯亮蓝G250蛋白染色剂（上海迈联生物工程有限公司，货号：LM-445）;IL-1β试剂盒、IL-8试剂盒、TNF-α试剂盒、MCP-1试剂盒（上海源叶生物科技有限公司，货号：H20200725、H20200817、H20200829、H20200709）;全自动生化分析仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，型号：BS-270）;高速冷冻离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司，型号：KDC-160HR）。
1.2 方法
1.2.1 分组与模型制备 将大鼠适应性喂养1周后，收集尿液，检测大鼠尿蛋白，剔除尿蛋白定性>“++”的大鼠。采用随机数字表法将大鼠分为对照组、模型组、激素组、中药（加味清心莲子饮）组。除对照组外，其余3组大鼠经尾静脉注射浓度为2 mg/mL的阿霉素注射液，注射剂量为6.5 mg/kg[5]，对照组大鼠注射等剂量的生理盐水，均以尾部无迂曲、肿胀为注射成功。于造模前1 d和造模后第7天，收集24 h尿液，对各组大鼠24 h尿蛋白含量进行测定，验证大鼠NS造模是否成功。
1.2.2 给药方法 于造模后第7天開始按照下列方式给药，共给药4周。1）对照组、模型组：生理盐水10 mL/kg灌胃，1次/d。2）激素组：泼尼松6 g（10 mL）/kg灌胃，1次/d。3）中药组：按26 g（10 mL）/kg生药量加味清心莲子饮灌胃，1次/d。
1.2.3 检测指标与方法 1）一般形态学观察。每周观测各组大鼠的精神状态、体质量、体毛、爪、耳色泽、进食水量及活动情况。2）24 h尿蛋白检测。各组大鼠在给药治疗后每周收集24 h尿液，记录尿量，共4次，用考马斯亮蓝法测定OD值，计算24 h尿蛋白含量。3）血液生化指标检测。于末次给药后48 h，以摘除眼球的方法取血，采血后静置15 min，以转速3 000 r/min，离心半径10 cm，离心5 min，取上清液，利用全自动生化分析仪对血清中白蛋白（ALB）、总蛋白（TP）、三酰甘油（TG）、胆固醇（TC）、血尿素氮（BUN）、血清肌酐（Scr）的含量进行检测。4）血清炎症介质检测。利用ELISA法检测血清中IL-1β、IL-8、TNF-α、MCP-1的水平。 1.3 统计学方法 采用SPSS 23.0统计软件对研究数据进行分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，进行正态性检验及方差齐性检验。方差齐性，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法;方差不齐性，多组间比较采用非参数检验，组间独立样本的多重比较采用扩展的t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组大鼠一般形态学观察 对照组大鼠一般状况良好，体质量持续增加。其他组大鼠在造模开始后逐渐出现不同程度的精神不振或烦躁，体质量下降，体毛粗糙蓬松脱落，活动减少，进食量下降，造模后期出现腹泻，阴囊水肿，部分大鼠出现足趾水肿。从灌胃第2周开始，激素组、中药组大鼠一般状况逐渐改善，进食增多，活动增多，腹泻缓解，水肿好转，体质量缓慢增加，但仍不如对照组大鼠。模型组一般状况改善不明显，体质量持续减少。实验过程中共死亡大鼠6只，其中造模过程中死亡5只，给药过程中模型组死亡1只。
2.2 各组大鼠HE染色情况 从肾脏形态学观察，正常对照组大鼠未见明显病变。模型组肾小球轻度萎缩，少许炎症细胞浸润，球囊壁轻度增厚，小球囊腔轻度扩张，系膜细胞增殖，毛细血管充血。给药组肾小管管腔轻微变形，肾小球囊腔扩张，肾脏组织空泡和纤维化程度都比模型组有明显的改善。
2.3 各组大鼠24 h尿蛋白检测 造模前1 d各组大鼠24 h尿蛋白定量比较，差异无统计学意义（P>0.05）。造模后第7天，对照组大鼠24 h尿蛋白定量与造模前1 d比较，差异无统计学意义（P>0.05），模型组、激素组、中药组大鼠24 h尿蛋白定量与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.01），3组比较差异无统计学意义（P>0.05）。整个实验过程对照组大鼠24 h尿蛋白定量变化不明显。与对照组比较，模型组、激素组、中药组大鼠24 h尿蛋白定量均明显升高（均P<0.01）。灌胃第2周开始，激素组、中药组大鼠24 h尿蛋白定量开始逐渐下降，模型组24 h尿蛋白定量下降不明显。灌胃第3、4周，激素组、中药组大鼠24 h尿蛋白定量明显低于模型组（P<0.01）。激素组、中药组大鼠24 h尿蛋白定量比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。
2.4 各组大鼠血液生化指标检测 与模型组比较，对照组血清TG、TC、BUN、Scr水平均明显升高（均P<0.01）;血清ALB、TP水平均明显降低（均P<0.01）。激素组、中药组较模型组血清TG、TC、BUN、Scr水平均降低（均P<0.01，P<0.05）;血清ALB、TP水平均明显升高（均P<0.01）。中药组、激素组血清TG、TC、BUN、Scr、ALB、TP水平与对照组比较，差异均无统计学意义（均P>0.05）。见表2。
2.5 各组大鼠血清炎症介质检测 模型组血清IL-1β、IL-8、TNF-α、MCP-1水平较对照组升高（P<0.05）;激素组、中药组血清IL-1β、IL-8、TNF-α、MCP-1水平低于模型组（P<0.05），与对照组比较，差异无统计学意义（均P>0.05）。中药组血清IL-1β、IL-8、TNF-α、MCP-1水平与激素组比较，差异均无统计学意义（均P>0.05）。见表3。
3 讨论
NS的发生多因感受风邪、水湿、疮毒、饮食起居失常或久病劳倦所致，其基本病理变化为肺失通调，脾失转输，肾失开阖，而致膀胱气化无权，三焦气化不利，水液停聚外泛肌肤，发为水肿。其病位在脾、肺、肾，以肾为本，肺为标，脾为制。病因病机错综复杂，在致病过程中易感外邪而加重病情[6-7]。糖皮质激素作为治疗NS的首选药物，具有广泛的生物学作用，对蛋白质、糖、水盐代谢及机体的生长发育有重要的生理调节作用，还具有抗炎、免疫抑制等多种药理作用，可以直接影响肾小球基底膜的通透性而发挥利尿、消除蛋白的作用。多项研究显示糖皮质激素可以调节相关免疫及炎症介质起到治疗NS的作用[8-9]。
清心莲子饮出自《太平惠民和剂局方》，可清心火，交心肾，益气阴，止淋浊，具有清心利湿、益气养阴的功用，主治心火妄动，气阴两虚，小便淋沥浑浊，尿时刺痛，遇劳即发，或有遗精，白浊带下，五心烦热，四肢倦怠，睡卧不安，口苦咽干，或口舌生疮等症[10]。方中人参、黄芪、甘草补益阳气而清虚火，地骨皮清肝肾虚火，柴胡散肝胆之火，麦冬清肺之火，茯苓、车前子利下焦湿热，再加上石莲子清心火而通肾水。在既往临床研究中，许多研究将清心莲子饮用于治疗肾系疾病，取得了明显疗效[11-13]。已有多位学者对清心莲子饮组成成分治疗肾系疾病的机制进行了研究，发现其不仅可以提高血浆总蛋白，降低尿蛋白，还可以调节炎症介质的水平，从而发挥治疗作用[14-16]。加味清心莲子饮由黄芪、麦冬、党参、地骨皮、黄芩、车前子、柴胡、石莲子、茯苓、益母草、萆薢、白花蛇舌草、甘草组成，是“国医大师”张琪教授经验名方，其组成是在清心莲子饮原方基础上加用益母草、白花蛇舌草、萆薢以加强利尿消肿、除湿去浊之功效。张琪教授应用该方多年，经验丰富，疗效显著[17-20]。
阿霉素NS模型为目前公认的模拟肾病的模型，其表现接近临床的NS，其细胞模型能够较好地模拟肾小球足细胞的基本功能，应用于肾病的发病机制研究。在NS的主要表現中，大量蛋白尿是导致肾损害加重的最关键的危险因素，它可以导致肾小管、肾小球系膜细胞及足细胞产生不同程度的损伤。本研究发现肾小球基底膜界限不清，有明显增生，肾小管上皮细胞可见颗粒变性或萎缩，可见蛋白管型。大鼠造模后24 h尿蛋白定量与造模前1 d比较明显升高，说明NS大鼠造模成功。从灌胃第2周开始，激素组、中药组大鼠一般状况逐渐改善，说明加味清心莲子饮同激素一样对NS大鼠起到了治疗作用，使NS大鼠水肿减轻，饮食增加，症状好转。当肾小球滤过屏障损坏后，导致蛋白从尿液中大量丢失形成蛋白尿，且血浆蛋白和高密度脂蛋白的大量丢失会促进TG及TC在肝脏中的合成，最终导致脂质代谢紊乱形成高血脂。肾小球滤过功能严重受损时，还会降低Scr和BUN滤过，使其血液浓度增加[21]。本研究中，模型组大鼠尿蛋白和血清TG、TC、BUN、Scr较对照组显著升高，血清TP、ALB水平显著降低，可以进行后续的药物干预研究。激素组、中药组大鼠24 h尿蛋白、血清TG、TC、BUN、Scr含量较模型组有不同程度降低，血清TP、ALB含量升高，说明加味清心莲子饮和激素均对NS大鼠起到了降低尿蛋白、升高血清蛋白、降低血脂的作用。 肾小球系膜细胞可分泌多种炎症介质，如IL-1、TNF-α等，而这些细胞因子可通过自分泌及旁分泌作用使炎症效应不断扩大。IL-6为系膜细胞自分泌因子之一，是一种较IL-1更强的肾小球系膜细胞增生诱导剂。已经发现PDGF、IL-1、TNF-α可通过自分泌或旁分泌方式刺激系膜细胞IL-6的产生。IL-6在系膜增生及系膜增生性肾炎等肾小球炎症疾患的发病过程中起重要作用[22]。本研究中，模型组大鼠血清IL-1β、IL-8、TNF-α、MCP-1水平高于对照组，说明IL-1β、IL-8、TNF-α、MCP-1等因子参与了大鼠NS的发生、发展，这些因子的血清水平可以在一定程度上反映肾脏损害的程度。灌胃第4周，激素组、中药组大鼠血清IL-1β、IL-8、TNF-α、MCP-1水平低于模型组，与对照组接近，说明加味清心莲子饮和激素可以下调NS大鼠血清IL-1β、IL-8、TNF-α、MCP-1的水平。
本研究发现加味清心莲子饮组与激素组作用相当，证实加味清心莲子饮可以降低NS大鼠尿蛋白，改善其血液生化指标，并参与调节炎症介质的表达，能够改善病理损伤，恢复肺、脾、肾脏的功能，对NS起到治疗作用。但长期使用激素会引起一些不良反应，选用中药加味清心莲子饮治疗安全有效，在轻症NS的治疗中可作为优先选择的治疗方案，可以减轻或避免糖皮质激素的不良反应，增强对NS的治疗效果。
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（2021-01-25收稿 责任编辑：杨燕）