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摘要 [目的]探讨无核葡萄品种离体培养的培养条件，并确定最佳取样时期。[方法]选取南方无核葡萄品种中5个自然授粉胚珠和4个杂交组合的胚珠为试材，通过形态学观察确定取样时间，探索适宜南方无核葡萄品种的胚挽救程序。[结果]适宜火焰无核×寒香蜜、碧香无核、火焰无核、奥迪亚无核等的胚挽救程序为授粉后30～40 d剥取胚珠接种在ER培养基，暗培养90 d，取胚转入WPM培养基上成苗。[结论]该研究可为提高幼胚离体发育和萌发成苗率提供科学依据。
关键词 无核葡萄；胚挽救；取样时间
中图分类号 S663.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）13-03842-02
Abstract [Objective] The aim was to discuss the in vitro cultivation conditions of seedless grape and confirm on the best sampling time. [Method] Choosing five kinds of natural pollination and four hybrid combinations of southern seedless grape as materials， the sampling time was identified by morphological observation and the suitable embryo rescue progress for southern seedless grape was explored. [Result] The suitable embryo rescue progress for Flame Seedless×Hanxiangmi， Bixiang Wuhe， Flame Seedless， Otilia Seedless was that the embryos were first inoculated at 30-40 days after fertilization， and then developed on the ER medium for 90 d， the embryos were cultured on WPM medium for germination. [Conclusion] The study provides a scientific basis for improving embryos development in vitro and germination rate.
Key words Seedless grape； Embryo rescue； Sampling dates
由于无核葡萄没有种子，不能作为母本获得杂交后代植株，只能利用有核品种作为母本与其杂交，但其后代出现无核植株的比率很低，且育种周期较长。研究表明，85%以上的无核葡萄为假单性结实，即种子败育型，虽然经过受精，但受精后的胚很快停止发育导致无核。随着组织培养技术的发展，葡萄胚挽救技术应运而生，在一定程度上解决了无核葡萄育种的难题。近年来，关于葡萄胚挽救的研究逐渐为葡萄育种学家重视，其影响因子的研究以及胚挽救体系的建立日趋成熟。金钊等研究表明，影响胚挽救萌发率的最关键因素为接种时间[1-3]。而关于胚挽救的报道多出自北方，南方由于高温高湿的气候环境被列为葡萄非适宜和次适宜种植区，品种中晚熟居多，且缺少无核品种。因此，利用现代科技技术开展早熟、无核葡萄育种，提高育种水平，完善品种结构，才能确保南方葡萄产业的全面可持续发展。为此，笔者通过形态学观察研究胚败育过程，确定各品种取样时间，同时探索适宜南方无核葡萄胚挽救的大致条件，为解决无核葡萄品种离体培养的培养条件及诸因子的适宜组合，提高幼胚离体发育和萌发成苗率提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试品种为适宜南方栽种的5个无核品种及其4个杂交组合：碧香无核、SP557、红宝石无核、火焰无核、奥迪亚无核、火焰无核×寒香蜜、火焰无核×碧香无核、红宝石无核×寒香蜜、红宝石无核×碧香无核。
1.2 试验方法
1.2.1
葡萄的杂交。
母本葡萄开花前2～3 d（花蕾顶端鼓起变圆，变为黄绿色）开始去雄，轻轻摘掉花冠，注意不损伤柱头，最后掐去穗尖，喷水保湿，套袋，挂牌。去雄后的第2天开始授粉，用毛笔蘸取少量花粉在已去雄柱头上轻轻授粉，授好后迅速套袋，连授3 d。
1.2.2
形态学观察。
从盛花后20 d开始至果实成熟，每7 d随机取30粒浆果称量其鲜重，剥离出种子，随机取30粒称重，并统计无核葡萄生长中的种子数，观察种子和胚的外观形态。
1.2.3
无核葡萄胚培养。供试材料在适宜取样时间范围内摘取幼果，进行消毒处理，流水冲洗30 min，然后于超净工作台用75%乙醇漂洗30 s，无菌水冲洗1次，再将果粒放入升汞溶液6 min，无菌水冲洗3～5次。将消毒后的果粒剖开取出胚珠，按试验设计条件进行接种（ER培养基），每瓶接种15粒，暗处理60～90 d后取胚，接种到WPM培养基，60 d后统计成苗率。培养室条件为：温度25～30 ℃，相对湿度40%～60%，光照强度3 000 lx。
胚珠发育率为发育胚珠数占接种胚珠数的百分率；
胚萌发率为萌发胚数占接种的发育胚数的百分率；
成苗率为成活苗数占接种胚珠数的百分率。
1.2.4
胚挽救试管苗的移栽。
选择继代培养基上生长的壮苗，温室（光强逐渐增强，有昼夜温差）中锻炼7～15 d；营养钵基质炼苗，浇多菌灵液；长出新根和2～3片叶后移入苗圃地。 2 结果与分析
2.1 形态学测定结果
从表1可以看出，各品种的果实重量一直呈现明显的增加趋势，且品种不同，增长趋势不同。各品种平均种子重的结果显示，虽然部分品种呈现不规则的动态变化，但整体趋势大致相同，由于胚中途败育，胚珠的质量随取样时间的推移先呈增加趋势，在一定时间后出现下降趋势。对比种子重与种子数的变化趋势，除奥迪亚无核外，各品种较为一致。奥迪亚无核的平均种子重不断上升，而在第3次以后的测定中种子数目有所下降。总之，无核葡萄胚败育对种子重量和数目都有不同程度的影响。
就种子形态来讲，奥迪亚无核的种子大，而且成熟度一致；碧香无核和SP557的种子大小不整齐，成熟度也有较大差别；红宝石无核和火焰无核的种子非常小，但成熟度比较一致。
3 结论与讨论
试验过程中，选择ER培养基为无核葡萄品种的胚珠生长培养基，发育率高，说明ER培养基适合胚珠的生长，这与程琳琳等的报道[4-7]吻合。唐冬梅等的报
道也指出，Nitsch和ER培养基最适宜无核葡萄离体幼胚的发育[8]。而程和禾等通过对比NN69、B5、1/2MS培养基得出结论，NN69是奥迪亚无核葡萄的最佳胚挽救培养基[9]。无核葡萄适宜的培养基因品种而异，找到各品种最适宜培养环境还需进一步的研究来完善。通过初步研究，大多数欧亚种无核葡萄最佳的接种时间在花后30～40 d，红宝石无核杂交组合的取样时间在40～50 d。这与唐冬梅等试验结果[8，10-11]一致。唐冬梅等试验表明，火焰无核最佳的取样时间为盛花后40 d，奥迪亚无核为盛花后40 d[8]；蒋爱丽等对南方无核葡萄品种喜乐进行了胚挽救，确定最适宜时间在盛花后30～40 d[10]。苏家乐等通过对江南地区无核品种的系统研究，指出红宝石无核最佳取样时间在授粉后42 d[11]。程和禾等对于奥迪亚无核的研究则指出，花后49 d是奥迪亚无核葡萄幼胚抢救的最佳时期[9]。分析原因：①南北气候的差异使得北方的成熟期稍晚于南方；②胚挽救条件的差别，包括培养基的种类、生长素的搭配等影响了胚珠及幼胚的生长速度。
胚挽救技术的应用使无核葡萄作为母本进行杂交育种成为可能，不仅大幅度增加了后代无核的几率，也大大缩短了育种周期。所以在未来的育种工作中，胚挽救前景乐观，依旧不可取代。而胚挽救过程中，接种时间、基本培养基种类、培养基相态、生长调节剂种类、碳源种类及浓度、pH、胚珠处理方式、培养环境等都会对胚挽救的萌发率和成苗率产生影响，且各因子相互作用，加大了对无核葡萄胚挽救技术体系构建的难度。因此，从分子生物学和生理生化角度研究胚败育的机理，拓宽品种范围，探索各因子作用机制，扩大影响因子数目，寻求适宜大多数无核葡萄胚挽救的基本程序，是以后很长一段时间的研究重点。
参考文献
[1] 金钊，贾琢，王冬.无核葡萄胚挽救技术初探[J].北方果树，2009（1）：13-15.
[2] 郭修武，郭印山，张海娥，等.接种时间和培养基对无核葡萄胚挽救的影响[J].园艺学报，2007，34（2）：329-332.
[3] JI W，LI Z Q.Breeding new seedless grape by means of in vitro embryo rescue[J].Genetics and Molecular Research，2013，12（1）：859-869.
[4] 程琳琳，王跃进，张剑侠，等.胚挽救技术进行无核葡萄及三倍体新种质创制[J].热带作物学报，2012，3（9）：1584-1589.
[5] 郝燕，杨瑞，王鸿，等.无核葡萄剥胚胚挽救技术关键影响因子[J].西北农业学报，2013，22（9）：114-120.
[6] EMERSHAD R L，RAMMING D W.Somatic embryogenesis and plant development from immature zagotic embryos of seedless grapes[J].Plant Cell Reports，1994，14：6-12.
[7] TIAN L I，WANG Y J.Breeding of diseaseresistant seedless grapes using Chinese wild Vitis spp.Ⅰ.In vitro embryo rescue and plant development[J].Scientia Horticulturae，2008，117：136-141.
[8] 唐冬梅，王跃进，赵荣华，等.无核葡萄胚挽救中影响胚发育的因子[J].中国农业科学，2009，42（7）：2449-2457.
[9] 程和禾，吴雅琴，赵艳华，等.奥迪亚无核葡萄胚挽救技术研究[J].河北农业科学，2008，2（11）：30-32.
[10] 蒋爱丽，李世诚，金佩芳，等.无核葡萄“喜乐”胚挽救培养研究与应用[J].上海农业学报，2010，26（4）：39-42.
[11] 苏家乐.江南地区无核葡萄引种适应性、胚培养及优质栽培技术研究[D].南京：南京农业大学，2006.
关键词 无核葡萄；胚挽救；取样时间
中图分类号 S663.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）13-03842-02
Abstract [Objective] The aim was to discuss the in vitro cultivation conditions of seedless grape and confirm on the best sampling time. [Method] Choosing five kinds of natural pollination and four hybrid combinations of southern seedless grape as materials， the sampling time was identified by morphological observation and the suitable embryo rescue progress for southern seedless grape was explored. [Result] The suitable embryo rescue progress for Flame Seedless×Hanxiangmi， Bixiang Wuhe， Flame Seedless， Otilia Seedless was that the embryos were first inoculated at 30-40 days after fertilization， and then developed on the ER medium for 90 d， the embryos were cultured on WPM medium for germination. [Conclusion] The study provides a scientific basis for improving embryos development in vitro and germination rate.
Key words Seedless grape； Embryo rescue； Sampling dates
由于无核葡萄没有种子，不能作为母本获得杂交后代植株，只能利用有核品种作为母本与其杂交，但其后代出现无核植株的比率很低，且育种周期较长。研究表明，85%以上的无核葡萄为假单性结实，即种子败育型，虽然经过受精，但受精后的胚很快停止发育导致无核。随着组织培养技术的发展，葡萄胚挽救技术应运而生，在一定程度上解决了无核葡萄育种的难题。近年来，关于葡萄胚挽救的研究逐渐为葡萄育种学家重视，其影响因子的研究以及胚挽救体系的建立日趋成熟。金钊等研究表明，影响胚挽救萌发率的最关键因素为接种时间[1-3]。而关于胚挽救的报道多出自北方，南方由于高温高湿的气候环境被列为葡萄非适宜和次适宜种植区，品种中晚熟居多，且缺少无核品种。因此，利用现代科技技术开展早熟、无核葡萄育种，提高育种水平，完善品种结构，才能确保南方葡萄产业的全面可持续发展。为此，笔者通过形态学观察研究胚败育过程，确定各品种取样时间，同时探索适宜南方无核葡萄胚挽救的大致条件，为解决无核葡萄品种离体培养的培养条件及诸因子的适宜组合，提高幼胚离体发育和萌发成苗率提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试品种为适宜南方栽种的5个无核品种及其4个杂交组合：碧香无核、SP557、红宝石无核、火焰无核、奥迪亚无核、火焰无核×寒香蜜、火焰无核×碧香无核、红宝石无核×寒香蜜、红宝石无核×碧香无核。
1.2 试验方法
1.2.1
葡萄的杂交。
母本葡萄开花前2～3 d（花蕾顶端鼓起变圆，变为黄绿色）开始去雄，轻轻摘掉花冠，注意不损伤柱头，最后掐去穗尖，喷水保湿，套袋，挂牌。去雄后的第2天开始授粉，用毛笔蘸取少量花粉在已去雄柱头上轻轻授粉，授好后迅速套袋，连授3 d。
1.2.2
形态学观察。
从盛花后20 d开始至果实成熟，每7 d随机取30粒浆果称量其鲜重，剥离出种子，随机取30粒称重，并统计无核葡萄生长中的种子数，观察种子和胚的外观形态。
1.2.3
无核葡萄胚培养。供试材料在适宜取样时间范围内摘取幼果，进行消毒处理，流水冲洗30 min，然后于超净工作台用75%乙醇漂洗30 s，无菌水冲洗1次，再将果粒放入升汞溶液6 min，无菌水冲洗3～5次。将消毒后的果粒剖开取出胚珠，按试验设计条件进行接种（ER培养基），每瓶接种15粒，暗处理60～90 d后取胚，接种到WPM培养基，60 d后统计成苗率。培养室条件为：温度25～30 ℃，相对湿度40%～60%，光照强度3 000 lx。
胚珠发育率为发育胚珠数占接种胚珠数的百分率；
胚萌发率为萌发胚数占接种的发育胚数的百分率；
成苗率为成活苗数占接种胚珠数的百分率。
1.2.4
胚挽救试管苗的移栽。
选择继代培养基上生长的壮苗，温室（光强逐渐增强，有昼夜温差）中锻炼7～15 d；营养钵基质炼苗，浇多菌灵液；长出新根和2～3片叶后移入苗圃地。 2 结果与分析
2.1 形态学测定结果
从表1可以看出，各品种的果实重量一直呈现明显的增加趋势，且品种不同，增长趋势不同。各品种平均种子重的结果显示，虽然部分品种呈现不规则的动态变化，但整体趋势大致相同，由于胚中途败育，胚珠的质量随取样时间的推移先呈增加趋势，在一定时间后出现下降趋势。对比种子重与种子数的变化趋势，除奥迪亚无核外，各品种较为一致。奥迪亚无核的平均种子重不断上升，而在第3次以后的测定中种子数目有所下降。总之，无核葡萄胚败育对种子重量和数目都有不同程度的影响。
就种子形态来讲，奥迪亚无核的种子大，而且成熟度一致；碧香无核和SP557的种子大小不整齐，成熟度也有较大差别；红宝石无核和火焰无核的种子非常小，但成熟度比较一致。
3 结论与讨论
试验过程中，选择ER培养基为无核葡萄品种的胚珠生长培养基，发育率高，说明ER培养基适合胚珠的生长，这与程琳琳等的报道[4-7]吻合。唐冬梅等的报
道也指出，Nitsch和ER培养基最适宜无核葡萄离体幼胚的发育[8]。而程和禾等通过对比NN69、B5、1/2MS培养基得出结论，NN69是奥迪亚无核葡萄的最佳胚挽救培养基[9]。无核葡萄适宜的培养基因品种而异，找到各品种最适宜培养环境还需进一步的研究来完善。通过初步研究，大多数欧亚种无核葡萄最佳的接种时间在花后30～40 d，红宝石无核杂交组合的取样时间在40～50 d。这与唐冬梅等试验结果[8，10-11]一致。唐冬梅等试验表明，火焰无核最佳的取样时间为盛花后40 d，奥迪亚无核为盛花后40 d[8]；蒋爱丽等对南方无核葡萄品种喜乐进行了胚挽救，确定最适宜时间在盛花后30～40 d[10]。苏家乐等通过对江南地区无核品种的系统研究，指出红宝石无核最佳取样时间在授粉后42 d[11]。程和禾等对于奥迪亚无核的研究则指出，花后49 d是奥迪亚无核葡萄幼胚抢救的最佳时期[9]。分析原因：①南北气候的差异使得北方的成熟期稍晚于南方；②胚挽救条件的差别，包括培养基的种类、生长素的搭配等影响了胚珠及幼胚的生长速度。
胚挽救技术的应用使无核葡萄作为母本进行杂交育种成为可能，不仅大幅度增加了后代无核的几率，也大大缩短了育种周期。所以在未来的育种工作中，胚挽救前景乐观，依旧不可取代。而胚挽救过程中，接种时间、基本培养基种类、培养基相态、生长调节剂种类、碳源种类及浓度、pH、胚珠处理方式、培养环境等都会对胚挽救的萌发率和成苗率产生影响，且各因子相互作用，加大了对无核葡萄胚挽救技术体系构建的难度。因此，从分子生物学和生理生化角度研究胚败育的机理，拓宽品种范围，探索各因子作用机制，扩大影响因子数目，寻求适宜大多数无核葡萄胚挽救的基本程序，是以后很长一段时间的研究重点。
参考文献
[1] 金钊，贾琢，王冬.无核葡萄胚挽救技术初探[J].北方果树，2009（1）：13-15.
[2] 郭修武，郭印山，张海娥，等.接种时间和培养基对无核葡萄胚挽救的影响[J].园艺学报，2007，34（2）：329-332.
[3] JI W，LI Z Q.Breeding new seedless grape by means of in vitro embryo rescue[J].Genetics and Molecular Research，2013，12（1）：859-869.
[4] 程琳琳，王跃进，张剑侠，等.胚挽救技术进行无核葡萄及三倍体新种质创制[J].热带作物学报，2012，3（9）：1584-1589.
[5] 郝燕，杨瑞，王鸿，等.无核葡萄剥胚胚挽救技术关键影响因子[J].西北农业学报，2013，22（9）：114-120.
[6] EMERSHAD R L，RAMMING D W.Somatic embryogenesis and plant development from immature zagotic embryos of seedless grapes[J].Plant Cell Reports，1994，14：6-12.
[7] TIAN L I，WANG Y J.Breeding of diseaseresistant seedless grapes using Chinese wild Vitis spp.Ⅰ.In vitro embryo rescue and plant development[J].Scientia Horticulturae，2008，117：136-141.
[8] 唐冬梅，王跃进，赵荣华，等.无核葡萄胚挽救中影响胚发育的因子[J].中国农业科学，2009，42（7）：2449-2457.
[9] 程和禾，吴雅琴，赵艳华，等.奥迪亚无核葡萄胚挽救技术研究[J].河北农业科学，2008，2（11）：30-32.
[10] 蒋爱丽，李世诚，金佩芳，等.无核葡萄“喜乐”胚挽救培养研究与应用[J].上海农业学报，2010，26（4）：39-42.
[11] 苏家乐.江南地区无核葡萄引种适应性、胚培养及优质栽培技术研究[D].南京：南京农业大学，2006.