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摘 要:头孢菌素酰化酶AcyⅡ可以直接水解CPC生成7-ACA,后者是重要的医药中间体,用来合成头孢类抗生素。头孢菌素酰化酶S12是AcyⅡ的突变体,其催化效率比AcyⅡ高。本文通过优化头孢菌素酰化酶S12在大肠杆菌BL21(DE3)中的诱导表达条件,为确定周期短、产率高且稳定可靠的发酵工艺奠定基础。利用单因素和正交设计对装液量、接种量、诱导时间,诱导温度和IPTG浓度等发酵条件进行了考察。单因素结果表明:装液量为25ml/250ml三角瓶,接种量1%,指数生长开始加入0.05mM IPTG,28℃诱导20小时发酵液酶活最高;正交试验结果表明:装液量50ml/250ml三角瓶,接种量2%,指数生长开始加入0.05mM IPTG,诱导28℃且诱导24hours酶活最高,发酵液产酶水平达639.9U/L。方差分析结果显示,发酵时间和装液量对酶活影响极显著,诱导时机对酶活影响显著,接种量对酶活没有显著影响。验证实验发现,发酵液产酶水平最高可以达到802.9U/L。本实验为该工程菌的发酵研究提供了最佳的表達诱导条件,对下一步的研究具有指导意义。
关键词:头孢菌素酰化酶 发酵 诱导条件优化 正交试验设计
中图分类号:TQ 文献标识码:A 文章编号:1674-098X(2012)04(b)-0249-02
头孢菌素是应用广泛的β-内酰胺类抗生素,是7-氨基头孢烷酸(7-aminocephalosporanic acid,以下简称7-ACA)的衍生物,通过7-ACA来生产的半合成头孢菌素占世界抗生素市场40％以上的份额。因此作为合成半合成头孢菌素的重要中间体,7-ACA的研究生产至关重要。目前化学和酶法都可以用来从头孢菌素C(以下简称CPC)生产7-ACA。化学法通过利用亚硝酰氯法或者硅酯裂解法从CPC化学脱酰而得,因为使用硅保护基团保护氨基和羧基,所以产量可以达到90％以上。但是,化学法操作复杂,对条件要求苛刻,造成生产上的严重浪费且产生的副产品对环境有害,这些昂贵的步骤和对有毒废料的处理都造成了生产成本的提高。为了克服化学法的缺点,有人提出了两步酶法。如今,化学方法基本已被两步酶法取代。头孢菌素酰化酶就是CPC在酶法脱酰成为7-ACA过程中起到关键作用的酶。
现已报道的具有头孢菌素酰化酶活力的菌株通常都从土壤或污水中筛选得到。与常规方法比较,利用基因工程菌发酵生产具有周期短、成本低、过程易于规范控制等诸多优点,且由于发酵培养基成分简单、酰化酶基因可受启动子基因调控,使其具备易纯化、可诱导和产量高的特点。因此利用基因工程菌发酵生产头孢菌素酰化酶成为国内外学者研究的热点。
Matsuda从Pseudomonas sp．SE83中克隆了可以催化CPC脱酰为7-ACA的acyⅡ酰化酶基因,Shin通过定向进化的方法,筛选得到一株6个氨基酸位点发生突变的突变体,酶活提高到突变前的8倍,命名为S12。本实验室通过基因合成获得全长目的基因,将其构建到pET-28a表达载体上,即pET-28a-S12,在 BL21(DE3)中诱导表达,表达产物经SDS-PAGE凝胶电泳检测后,确定蛋白是由58kDa和25kDa大小2个亚基组成,与文献报导一致。酶的诱导表达是发酵过程的一部分,此酶在大肠杆菌中的最佳诱导条件至今无报导。本文的目的是在摇瓶发酵的基础上,优化S12的诱导表达条件,使酶活提高,为整个发酵过程奠定基础。单因素实验确定诱导表达相关参数,正交实验和方差分析确定相关参数的影响水平。利用正交实验的最优组合,酶活最高可以达到802.94U/L。
1 材料与方法
1.1 质粒与菌株
重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28a-S12由上海生工构建
1.2 主要试剂与仪器
1.2.1 试剂
Trypton、Yeast extract、琼脂粉:北京奥博星生物技术有限公司;氯化钠、PDAB(对二甲氨基苯甲醛)、无水甲醇(分析纯)、葡萄糖:北京化学试剂厂;丙烯酰胺、IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)、卡那霉素、β-疏基乙醇:Amresco公司;冰乙酸(优级纯):国药集团;SDS(十二烷基硫酸钠)、Tris:Sigma;蛋白低分子量标准:购于TaKaLa。
1.2.2 仪器
高速离心机DL-16B,电泳仪 ECP3000,电泳槽DY-CY31A,Y92-1超声波破碎仪,振荡培养箱ZDP-250,电热恒温培养箱 DNP-9272,电子天平TA5002,分光光度计Unico2100,酸度计HANNA HI 221。
1.3 菌种活化
挑取1环-80℃甘油冻存的工程菌,在LB固体培养基中(卡那霉素50ug/ml)划线培养过夜,挑取单菌落于LB液体培养基中(卡那霉素50ug/ml)培养过夜。
1.4 发酵培养
选用LB培养基,采用单因素实验测定葡萄糖、装液量、接种量、培养时间、诱导剂(IPTG)浓度、诱导时间、诱导温度对发酵液酶活的影响,以菌体破碎后的粗酶液的酶活高低为原则确定各单因素下最适条件,每组实验重复3次,取平均值。
1.5 目的蛋白表达水平检测
将诱导后的菌体4℃、12000r/min离心5min搜集菌体,将菌体重悬于Tris缓冲液中,冰浴中超声波破碎(40W、工作5s、间歇 5s、30次),4℃、12000r/min离心15min,取上清液并将沉淀溶于Tris缓冲液中,12%的SDS-PAGE凝胶电泳鉴定。
1.6 酶活测定
参见Lee等的研究方法,取0.5ml粗酶液,加入0.5ml底物(用pH8.0 Tris缓冲液配配制20%CPC),37℃水浴8min,加入3ml终止液和0.5ml显色液。振荡混匀后静置15min,12000rpm离心5min。取上清液于415nm处测定光吸收值。空白对照为先加终止液,后加底物。37℃、1min生成1μmol 7-ACA定义为1个酶活单位(U)。
1.7 摇瓶发酵条件的正交试验优化
采用正交试验法将对发酵液酶活有影响的单因素进行组合,按L16(45)正交表安排正交试验。每个实验处理进行3次重复,取平均值。通过对结果的极差分析,确定最优组合。通过方差分析确定四因素影响显著性。
2 结果与讨论
2.1 葡萄糖对发酵液酶活和蛋白表达量的影响
250ml摇瓶内分别装100ml LB、100ml LBG(LB+0.5%葡萄糖),37℃,初始pH为7.2,摇床转速200r/min,接种量1%,4h后,加入0.05mM IPTG,诱导4h,结果表明,LBG的发酵液酶活比LB的发酵液酶活低,其外源蛋白的表达量却高于LB。
LB是一种营养丰富的半合成培养基,基本具备了大肠杆菌生长所需要的全部营养元素,葡萄糖是容易被微生物利用的碳源,希望借添加葡萄糖来提高发酵液酶活,但实验发现,添加葡萄糖后表达量提高,发酵液酶活降低了,这与野生菌发酵产酶的规律是不一样的,推断是因为诱导表达的胞内酶量大时,会使外源蛋白不能及时实现正确的折叠,导致可溶性粗酶蛋白液中存在很大部分折叠介于完全正确和完全不正确的结构的蛋白,虽然表达总酶量上升了,但有效酶量却减少了,导致酶活降低,所以葡萄糖的加入不能使此工程菌表达出具有高发酵液酶活的酰化酶。
2.2 种子培养时间的确定
种子培养时间即种龄,对大肠杆菌发酵过程的影响较大。适宜的种龄应是菌种对数生长的中后期,此时的种子具有较强的生长活力,而且菌体浓度相对较高,有利于大肠杆菌的迅速积累。由菌种的生长曲线可知,2h以内是迟滞期,此时菌体为自身进行各种物质合成和分解做着准备。2h进入指数生长期,8h菌种正处于指数生长中后期,菌浓度较高,菌体生长旺盛,因此选择种子培养时间为8h。
2.3 接种量对发酵液酶活的影响
接种量的大小对发酵周期的长短和发酵水平的高低有一定的影响。接种量太小,菌种增殖缓慢,培养时间延长,会造成菌丝结块等发酵异常,不利于菌体生长和产酶;而接种量过大,会使菌种生长过快,培养基黏度增加,导致基质消耗过快,溶氧不足,菌种容易衰老,也不利于产酶。因此,应采用适合的接种量,在合理地缩短发酵周期的同时,又能得到较高的发酵水平。将培养8h的新鲜种子按 0.1%、0.3%、0.5%、1%、2%和5%的接种量分别接入培养基中,接种量以1%或2%为好,此时发酵液酶活较高;接种量超过2%,对酶活有一定的抑制。
2.4 装液量对发酵液酶活的影响
摇瓶装液量与溶解氧浓度有关,所以对发酵水平的高低有一定的影响。装液量太小,设备利用率低,增加工业投入成本;而装液量过大,培养液中溶解氧少,菌种容易衰老,不利于产酶。因此,采用适合的装液量,能得到较高的发酵水平。以250ml摇瓶,分别盛放25ml、50ml和100ml培养基,发现25ml培养基对菌株发酵产酶效果最好,随着培养基的增多,对酶活有一定的抑制。
2.5 诱导时机对发酵液酶活的影响
将8小时的种子液按1%接种于新鲜培养基中,测定其生长曲线,从生长曲线我们可以推断,工程菌在不同的生长时期,其表达的酶活一定存在差异。所以本文选取不同的生长时期加入IPTG,发现,转接后2h,即指数生长开始是最佳的诱导时机。
2.6 诱导温度对发酵液酶活的影响
加入终浓度為0.05mmol/L的IPTG后,分别设定温度为16℃、20℃、25℃、28℃和37℃,诱导,在温度为28℃时发酵液酶活最高,因此诱导表达的最佳温度可以确定在 28℃。
对于工程菌,一般采用菌体生长阶段和产物生成阶段的2阶段发酵模式,不同的阶段有不同的目的,因此培养温度也要随之改变。前期优先促进菌体生长,以获得足够的生物量,后期以目的蛋白表达为主,温度要适当调整,适宜的温度可以促进外源蛋白的表达,否则会抑制。本试验中发现当诱导温度为28℃时,酶活最高,当温度过高或过低时酶活都降低。可能由于温度过低时菌体生长代谢缓慢,蛋白表达受抑制,当温度过高时菌体自身蛋白表达占上风,外源蛋白表达受抑制。
2.7 IPTG浓度对发酵液酶活的影响
1%接种后4小时开始添加IPTG,终浓度为0.01mmol/L、0.05mmol/L、0.5mmol/L、和1.0mmol/L,28℃诱导表达,结果表明,当IPTG浓度为0.05mmol/L时发酵液酶活最高,当IPTG浓度升高为1.0mmol/L时酶活降低,可能由于IPTG浓度过高对菌体产生了毒害作用。
外源基因克隆在含有lac启动子的表达系统中,lacI产生的阻遏蛋白与lac操纵基因结合抑制下游的外源基因转录,便可以实现宿主菌生长,向培养基中加入诱导物 IPTG(异丙基硫代-D-半乳糖),解除lacI抑制使外源基因大量表达。但是当IPTG浓度过高时会对菌体产生毒害作用,抑制外源蛋白表达。本实验结果发现,摇瓶中0.05mmol/L的IPTG就足以诱导启动子完全开放,这对大规模工业生产中降低发酵成本有积极意义。
2.8 诱导时间对目的基因表达水平的影响
在摇瓶培养到指数生长开始时,加入0.05mmol/L IPTG,28℃分别诱导2h、4h、6h、8h、10h、12h和20h,发酵液酶活随诱导时间的延长而提高,当达到20h时酶活稳定。结果如图10表明,菌体处于对数生长期时,生长速度较快,外源蛋白有少量表达,当进入到诱导状态后,生长速度下降,以表达外源蛋白为主,当达到一定时间后,发酵液中营养的消耗,氧气的缺乏使得菌体的生长进入平台期,即产生和自溶互相抵销,影响了外源蛋白的积累。
2.9 正交实验结果
由极值的变化推知,各因素的重要性依次为诱导时间、装液量、诱导时机和接种量。最优诱导条件为:诱导时间24h、装液量50ml、诱导时机是在转接后2h、接种量是2%,最佳组合为A2B2C2D3。方差分析结果表明,发酵时间和装液量对酶活有极显著影响,诱导时机对酶活有显著影响,接种量对酶活没有影响。
为提高统计分析的可靠性,给出了对正交试验得出的较优组合进行验证的两组实验结果。与正交试验中A2B2C2D3发酵液酶活639.9U/L相比,验证组合A2B2C2D3的发酵液酶活提高了25%。
3 结论
本文对工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-S12的诱导条件进行了研究,结果发现,葡萄糖对产酶水平有显著的影响,接种量、诱导时机、诱导时间和诱导剂的浓度对菌体的产酶有影响,最佳的诱导时机为菌体培养4h,处于对数生长前期(OD600≈1.5),这与文献报道的重组大肠杆菌的发酵在对数生长末期诱导有差异,与廖美德等报道的在对数生长前中期接近。诱导剂IPTG添加量影响菌体生长和外源基因的表达,这与Babu等的报道相同,当IPTG浓度0.05mmol/L诱导效果最好。方差分析结果表明,发酵时间和装液量对酶活有极显著影响,诱导时机对酶活有显著影响,接种量对酶活没有影响。最优组合诱导条件为:诱导时间24h、装液量50ml、诱导时机是在转接后2h、接种量是2%,酶活达到639U/L。验证实验结果发现,发酵液产酶水平最高达802.94U/L,没有达到1207U/L,推测是与表达载体和诱导方法有关,如文献中使用乳糖作为诱导剂,一方面起到诱导作用,一方面可以作为碳源,在今后的高密度发酵研究中,考虑引用乳糖作为碳源和诱导物。外源蛋白的表达是发酵过程的重要组成部分,合适的诱导条件可以使发酵产物达到最大。具体发酵工艺今后研究。
参考文献
[1] 廖福荣.芽孢杆菌产生的胞外GL-7-ACA酰化酶[J]．国外医药:抗生素分册, 1997.
[2] 林晨露,李强,刘亚飞,等.产GL-7-ACA酰化酶基因工程菌的高活性表达[J].过程工程学报,2008.
[3] 安明,于慧敏,沈忠耀,等.CPC酰化酶基因的人工合成与重组表达[J].清华大学学报,2008.
关键词:头孢菌素酰化酶 发酵 诱导条件优化 正交试验设计
中图分类号:TQ 文献标识码:A 文章编号:1674-098X(2012)04(b)-0249-02
头孢菌素是应用广泛的β-内酰胺类抗生素,是7-氨基头孢烷酸(7-aminocephalosporanic acid,以下简称7-ACA)的衍生物,通过7-ACA来生产的半合成头孢菌素占世界抗生素市场40％以上的份额。因此作为合成半合成头孢菌素的重要中间体,7-ACA的研究生产至关重要。目前化学和酶法都可以用来从头孢菌素C(以下简称CPC)生产7-ACA。化学法通过利用亚硝酰氯法或者硅酯裂解法从CPC化学脱酰而得,因为使用硅保护基团保护氨基和羧基,所以产量可以达到90％以上。但是,化学法操作复杂,对条件要求苛刻,造成生产上的严重浪费且产生的副产品对环境有害,这些昂贵的步骤和对有毒废料的处理都造成了生产成本的提高。为了克服化学法的缺点,有人提出了两步酶法。如今,化学方法基本已被两步酶法取代。头孢菌素酰化酶就是CPC在酶法脱酰成为7-ACA过程中起到关键作用的酶。
现已报道的具有头孢菌素酰化酶活力的菌株通常都从土壤或污水中筛选得到。与常规方法比较,利用基因工程菌发酵生产具有周期短、成本低、过程易于规范控制等诸多优点,且由于发酵培养基成分简单、酰化酶基因可受启动子基因调控,使其具备易纯化、可诱导和产量高的特点。因此利用基因工程菌发酵生产头孢菌素酰化酶成为国内外学者研究的热点。
Matsuda从Pseudomonas sp．SE83中克隆了可以催化CPC脱酰为7-ACA的acyⅡ酰化酶基因,Shin通过定向进化的方法,筛选得到一株6个氨基酸位点发生突变的突变体,酶活提高到突变前的8倍,命名为S12。本实验室通过基因合成获得全长目的基因,将其构建到pET-28a表达载体上,即pET-28a-S12,在 BL21(DE3)中诱导表达,表达产物经SDS-PAGE凝胶电泳检测后,确定蛋白是由58kDa和25kDa大小2个亚基组成,与文献报导一致。酶的诱导表达是发酵过程的一部分,此酶在大肠杆菌中的最佳诱导条件至今无报导。本文的目的是在摇瓶发酵的基础上,优化S12的诱导表达条件,使酶活提高,为整个发酵过程奠定基础。单因素实验确定诱导表达相关参数,正交实验和方差分析确定相关参数的影响水平。利用正交实验的最优组合,酶活最高可以达到802.94U/L。
1 材料与方法
1.1 质粒与菌株
重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28a-S12由上海生工构建
1.2 主要试剂与仪器
1.2.1 试剂
Trypton、Yeast extract、琼脂粉:北京奥博星生物技术有限公司;氯化钠、PDAB(对二甲氨基苯甲醛)、无水甲醇(分析纯)、葡萄糖:北京化学试剂厂;丙烯酰胺、IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)、卡那霉素、β-疏基乙醇:Amresco公司;冰乙酸(优级纯):国药集团;SDS(十二烷基硫酸钠)、Tris:Sigma;蛋白低分子量标准:购于TaKaLa。
1.2.2 仪器
高速离心机DL-16B,电泳仪 ECP3000,电泳槽DY-CY31A,Y92-1超声波破碎仪,振荡培养箱ZDP-250,电热恒温培养箱 DNP-9272,电子天平TA5002,分光光度计Unico2100,酸度计HANNA HI 221。
1.3 菌种活化
挑取1环-80℃甘油冻存的工程菌,在LB固体培养基中(卡那霉素50ug/ml)划线培养过夜,挑取单菌落于LB液体培养基中(卡那霉素50ug/ml)培养过夜。
1.4 发酵培养
选用LB培养基,采用单因素实验测定葡萄糖、装液量、接种量、培养时间、诱导剂(IPTG)浓度、诱导时间、诱导温度对发酵液酶活的影响,以菌体破碎后的粗酶液的酶活高低为原则确定各单因素下最适条件,每组实验重复3次,取平均值。
1.5 目的蛋白表达水平检测
将诱导后的菌体4℃、12000r/min离心5min搜集菌体,将菌体重悬于Tris缓冲液中,冰浴中超声波破碎(40W、工作5s、间歇 5s、30次),4℃、12000r/min离心15min,取上清液并将沉淀溶于Tris缓冲液中,12%的SDS-PAGE凝胶电泳鉴定。
1.6 酶活测定
参见Lee等的研究方法,取0.5ml粗酶液,加入0.5ml底物(用pH8.0 Tris缓冲液配配制20%CPC),37℃水浴8min,加入3ml终止液和0.5ml显色液。振荡混匀后静置15min,12000rpm离心5min。取上清液于415nm处测定光吸收值。空白对照为先加终止液,后加底物。37℃、1min生成1μmol 7-ACA定义为1个酶活单位(U)。
1.7 摇瓶发酵条件的正交试验优化
采用正交试验法将对发酵液酶活有影响的单因素进行组合,按L16(45)正交表安排正交试验。每个实验处理进行3次重复,取平均值。通过对结果的极差分析,确定最优组合。通过方差分析确定四因素影响显著性。
2 结果与讨论
2.1 葡萄糖对发酵液酶活和蛋白表达量的影响
250ml摇瓶内分别装100ml LB、100ml LBG(LB+0.5%葡萄糖),37℃,初始pH为7.2,摇床转速200r/min,接种量1%,4h后,加入0.05mM IPTG,诱导4h,结果表明,LBG的发酵液酶活比LB的发酵液酶活低,其外源蛋白的表达量却高于LB。
LB是一种营养丰富的半合成培养基,基本具备了大肠杆菌生长所需要的全部营养元素,葡萄糖是容易被微生物利用的碳源,希望借添加葡萄糖来提高发酵液酶活,但实验发现,添加葡萄糖后表达量提高,发酵液酶活降低了,这与野生菌发酵产酶的规律是不一样的,推断是因为诱导表达的胞内酶量大时,会使外源蛋白不能及时实现正确的折叠,导致可溶性粗酶蛋白液中存在很大部分折叠介于完全正确和完全不正确的结构的蛋白,虽然表达总酶量上升了,但有效酶量却减少了,导致酶活降低,所以葡萄糖的加入不能使此工程菌表达出具有高发酵液酶活的酰化酶。
2.2 种子培养时间的确定
种子培养时间即种龄,对大肠杆菌发酵过程的影响较大。适宜的种龄应是菌种对数生长的中后期,此时的种子具有较强的生长活力,而且菌体浓度相对较高,有利于大肠杆菌的迅速积累。由菌种的生长曲线可知,2h以内是迟滞期,此时菌体为自身进行各种物质合成和分解做着准备。2h进入指数生长期,8h菌种正处于指数生长中后期,菌浓度较高,菌体生长旺盛,因此选择种子培养时间为8h。
2.3 接种量对发酵液酶活的影响
接种量的大小对发酵周期的长短和发酵水平的高低有一定的影响。接种量太小,菌种增殖缓慢,培养时间延长,会造成菌丝结块等发酵异常,不利于菌体生长和产酶;而接种量过大,会使菌种生长过快,培养基黏度增加,导致基质消耗过快,溶氧不足,菌种容易衰老,也不利于产酶。因此,应采用适合的接种量,在合理地缩短发酵周期的同时,又能得到较高的发酵水平。将培养8h的新鲜种子按 0.1%、0.3%、0.5%、1%、2%和5%的接种量分别接入培养基中,接种量以1%或2%为好,此时发酵液酶活较高;接种量超过2%,对酶活有一定的抑制。
2.4 装液量对发酵液酶活的影响
摇瓶装液量与溶解氧浓度有关,所以对发酵水平的高低有一定的影响。装液量太小,设备利用率低,增加工业投入成本;而装液量过大,培养液中溶解氧少,菌种容易衰老,不利于产酶。因此,采用适合的装液量,能得到较高的发酵水平。以250ml摇瓶,分别盛放25ml、50ml和100ml培养基,发现25ml培养基对菌株发酵产酶效果最好,随着培养基的增多,对酶活有一定的抑制。
2.5 诱导时机对发酵液酶活的影响
将8小时的种子液按1%接种于新鲜培养基中,测定其生长曲线,从生长曲线我们可以推断,工程菌在不同的生长时期,其表达的酶活一定存在差异。所以本文选取不同的生长时期加入IPTG,发现,转接后2h,即指数生长开始是最佳的诱导时机。
2.6 诱导温度对发酵液酶活的影响
加入终浓度為0.05mmol/L的IPTG后,分别设定温度为16℃、20℃、25℃、28℃和37℃,诱导,在温度为28℃时发酵液酶活最高,因此诱导表达的最佳温度可以确定在 28℃。
对于工程菌,一般采用菌体生长阶段和产物生成阶段的2阶段发酵模式,不同的阶段有不同的目的,因此培养温度也要随之改变。前期优先促进菌体生长,以获得足够的生物量,后期以目的蛋白表达为主,温度要适当调整,适宜的温度可以促进外源蛋白的表达,否则会抑制。本试验中发现当诱导温度为28℃时,酶活最高,当温度过高或过低时酶活都降低。可能由于温度过低时菌体生长代谢缓慢,蛋白表达受抑制,当温度过高时菌体自身蛋白表达占上风,外源蛋白表达受抑制。
2.7 IPTG浓度对发酵液酶活的影响
1%接种后4小时开始添加IPTG,终浓度为0.01mmol/L、0.05mmol/L、0.5mmol/L、和1.0mmol/L,28℃诱导表达,结果表明,当IPTG浓度为0.05mmol/L时发酵液酶活最高,当IPTG浓度升高为1.0mmol/L时酶活降低,可能由于IPTG浓度过高对菌体产生了毒害作用。
外源基因克隆在含有lac启动子的表达系统中,lacI产生的阻遏蛋白与lac操纵基因结合抑制下游的外源基因转录,便可以实现宿主菌生长,向培养基中加入诱导物 IPTG(异丙基硫代-D-半乳糖),解除lacI抑制使外源基因大量表达。但是当IPTG浓度过高时会对菌体产生毒害作用,抑制外源蛋白表达。本实验结果发现,摇瓶中0.05mmol/L的IPTG就足以诱导启动子完全开放,这对大规模工业生产中降低发酵成本有积极意义。
2.8 诱导时间对目的基因表达水平的影响
在摇瓶培养到指数生长开始时,加入0.05mmol/L IPTG,28℃分别诱导2h、4h、6h、8h、10h、12h和20h,发酵液酶活随诱导时间的延长而提高,当达到20h时酶活稳定。结果如图10表明,菌体处于对数生长期时,生长速度较快,外源蛋白有少量表达,当进入到诱导状态后,生长速度下降,以表达外源蛋白为主,当达到一定时间后,发酵液中营养的消耗,氧气的缺乏使得菌体的生长进入平台期,即产生和自溶互相抵销,影响了外源蛋白的积累。
2.9 正交实验结果
由极值的变化推知,各因素的重要性依次为诱导时间、装液量、诱导时机和接种量。最优诱导条件为:诱导时间24h、装液量50ml、诱导时机是在转接后2h、接种量是2%,最佳组合为A2B2C2D3。方差分析结果表明,发酵时间和装液量对酶活有极显著影响,诱导时机对酶活有显著影响,接种量对酶活没有影响。
为提高统计分析的可靠性,给出了对正交试验得出的较优组合进行验证的两组实验结果。与正交试验中A2B2C2D3发酵液酶活639.9U/L相比,验证组合A2B2C2D3的发酵液酶活提高了25%。
3 结论
本文对工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-S12的诱导条件进行了研究,结果发现,葡萄糖对产酶水平有显著的影响,接种量、诱导时机、诱导时间和诱导剂的浓度对菌体的产酶有影响,最佳的诱导时机为菌体培养4h,处于对数生长前期(OD600≈1.5),这与文献报道的重组大肠杆菌的发酵在对数生长末期诱导有差异,与廖美德等报道的在对数生长前中期接近。诱导剂IPTG添加量影响菌体生长和外源基因的表达,这与Babu等的报道相同,当IPTG浓度0.05mmol/L诱导效果最好。方差分析结果表明,发酵时间和装液量对酶活有极显著影响,诱导时机对酶活有显著影响,接种量对酶活没有影响。最优组合诱导条件为:诱导时间24h、装液量50ml、诱导时机是在转接后2h、接种量是2%,酶活达到639U/L。验证实验结果发现,发酵液产酶水平最高达802.94U/L,没有达到1207U/L,推测是与表达载体和诱导方法有关,如文献中使用乳糖作为诱导剂,一方面起到诱导作用,一方面可以作为碳源,在今后的高密度发酵研究中,考虑引用乳糖作为碳源和诱导物。外源蛋白的表达是发酵过程的重要组成部分,合适的诱导条件可以使发酵产物达到最大。具体发酵工艺今后研究。
参考文献
[1] 廖福荣.芽孢杆菌产生的胞外GL-7-ACA酰化酶[J]．国外医药:抗生素分册, 1997.
[2] 林晨露,李强,刘亚飞,等.产GL-7-ACA酰化酶基因工程菌的高活性表达[J].过程工程学报,2008.
[3] 安明,于慧敏,沈忠耀,等.CPC酰化酶基因的人工合成与重组表达[J].清华大学学报,2008.