摘要白背飞虱是水稻重要害虫之一。研究采用L16(45)正交设计优化试验，构建了白背飞虱ISSR最优反应体系，并对引物退火温度和反应循环次数进行了优化。结果表明：白背飞虱ISSRPCR最优反应体系为2 μL 10×PCR Buffer（10 mmol/L TrisHCl;50 mmol/L KCl）,1.5 mmol/L Mg2 ,0.25 mmol/L dNTPs，0.9 μmol/L引物，1U Taq Polymerase和50 ng 模板DNA，ddH2O补充至20 μL。本研究采用的10条引物的最佳退火温度在51.0~54.0 ℃间，以引物相应最优退火温度和40次反应循环可获得较好的白背飞虱ISSRPCR结果。
　　关键词白背飞虱；正交设计；ISSR
　　中图分类号:S 435.112.3文献标识码：ADOI：10.3969/j.issn.05291542.2014.02.021Establishment and optimization of ISSRPCR reaction system with
　　orthogonal design for Sogatella furciferaXie Jianan,Guo Jianjun,Jin Daochao(Provincial Key Laboratory for Agricultural Pest Management of Mountainous Regions, Institute
　　of Entomology, Guizhou University, Guiyang550025, China)AbstractSogatella furcifera is one of the most important rice pests. To establish and optimize ISSRPCR reaction system for S.furcifera, the factors influencing ISSR system were studied with L16(45) orthogonal design, and the optimal annealing temperature and cycle times were proposed. The results showed that the optimal conditions for ISSRPCR system were 2 μL 10×PCR buffer (10 mmol/L TrisHCl, 50 mmol/L KCl), 1.5 mmol/L Mg2 , 0.25 mmol/L dNTPs mixture, 0.9 μmol/L of each primer, 1U Taq DNA polymerase (TaKaRa) and 50 ng template DNA in 20 μL reaction volume. The optimal annealing temperatures were 51.0-54.0 ℃ for the 10 primers used in the present study. The clear and reproducible DNA bands were obtained by the optimal annealing temperature and 40 reaction cycles.
　　Key words Sogatella furcifera;orthogonal design;ISSR ISSR(intersimple sequence repeat)标记是一种基于微卫星基础的分子技术［1］，其用小段重复序列加2~4个随机核苷酸为引物，PCR扩增模板DNA重复序列间基因片段，采用聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分析扩增获得的条带，研究其基因多态性。该技术较SSR技术引物开发简单、通用性好；较RAPD技术信息量大、多态性高；精确度几乎可与RFLP相媲美，具有良好的稳定性和检测方便等特性［2］，已广泛用于地理种群遗传多样性研究［35］。在ISSR标记的实际应用中需首先优化PCR反应体系，才能获得可靠的试验结果。
　　白背飞虱［Sogatella furcifera (Horváth)］属半翅目(Hemiptera)飞虱科(Delphacidae)［6］，是广布性重要水稻害虫［7］；自20世纪50年代后期水稻种植制度改制以来，白背飞虱为害逐年扩大，特别在近年因其暴发为害造成水稻大量减产甚至绝收的情况屡见不鲜［8］。在此背景下，展开了稻飞虱的广泛研究［912］，但对白背飞虱ISSRPCR体系系统优化研究尚未见报道。
　　本研究采用正交设计法对白背飞虱ISSRPCR体系进行了优化研究，分析了Mg2 浓度、Taq DNA聚合酶量、dNTPs浓度、模板DNA量和Primer浓度对白背飞虱ISSRPCR体系的影响，获得了白背飞虱ISSRPCR反应的最优体系，为白背飞虱的遗传多样性分析和分子生态学研究提供了有益借鉴。
　　1材料与方法
　　1.1试验材料
　　样本：白背飞虱成虫，经饲养去寄生和饥饿处理。
　　引物：英属哥伦比亚大学（UBC）生物技术实验室开发，委托上海生物工程公司合成。
　　40卷第2期谢家楠等：白背飞虱ISSRPCR反应体系构建的正交设计优化2014试剂：dNTPs、Taq DNA聚合酶、10×PCR buffer、MgCl2为宝生物工程有限公司产品。
　　1.2基因组DNA提取
　　白背飞虱基因组DNA提取采用SDS法［13］并略加修改。BIORAD SmartSpec plus核酸蛋白测定仪检测DNA浓度和质量。琼脂糖凝胶电泳条带无杂带及弥散、A260/A280值1.8左右的基因组DNA-20 ℃保存。
　　1.3ISSRPCR体系正交设计
　　为获得白背飞虱最优ISSRPCR反应体系，使用正交设计助手II软件对Mg2 浓度、Taq DNA聚合酶量、dNTPs浓度、模板DNA量和引物浓度5个因素4个水平选用L16（45）正交优化表做正交优化试验(表1、表2)，试验重复3次。反应体系包括上述5个成分外，添加2 μL的10×PCR Buffer（10 mmol/L TrisHCl;50 mmol/L KCl）, 最后ddH2O补充至20 μL。
　　表1白背飞虱ISSRPCR体系因素水平设计
　　Table 1Factors and levels of ISSRPCR reaction for S.furcifera水平
　　Level因素FactorMg2 浓度
　　/mmol·L-1
　　Mg2 dNTPs
　　浓度
　　/mmol·L-1
　　dNTPs引物浓度
　　/μmol·L-1
　　PrimerTaq DNA
　　聚合酶量/U
　　 Taq DNA
　　polymerase DNA 模板
　　量/ng
　　DNA
　　template 11.50.150.30.61021.80.200.60.83032.10.250.91.05042.40.301.21.270
　　
　　1.4ISSRPCR扩增反应
　　PCR反应在iCycler Thermal Cycler(BIORAD)PCR仪上进行，参数为：94 ℃变性4 min；94 ℃变性1 min，退火1 min，72 ℃延伸2 min，40个循环；72 ℃延伸10 min。扩增产物2%琼脂糖凝胶（含GoldView I核酸染料）電泳检测，UNIVERSAL HOOD‖(BIORAD)凝胶成像系统拍照。
　　表2白背飞虱ISSRPCR正交试验设计［L16(45)］
　　Table 2Orthogonal design for ISSRPCR reaction for
　　S.furcifera ［L16(45)］水平
　　Level 因素FactorMg2 浓度
　　/mmol·L-1
　　Mg2 dNTPs浓度
　　/mmol·L-1
　　dNTPs引物浓度
　　/μmol·L-1
　　PrimerTaq DNA
　　聚合酶量/U
　　Taq DNA
　　polymeraseDNA 模板
　　量/ng
　　DNA
　　template 11.50.150.30.61021.50.200.60.83031.50.250.91.05041.50.301.21.27051.80.150.61.07061.80.200.31.25071.80.251.20.63081.80.300.90.81092.10.150.91.230102.10.201.21.010112.10.250.30.870122.10.300.60.650132.40.151.20.850142.40.200.90.670152.40.250.61.210162.40.300.31.030
　　
　　1.5引物退火温度及反应循环筛选
　　正交优化试验建立白背飞虱ISSRPCR体系，ISSR引物以Tm为基础浮动10 ℃进行退火温度筛选，以条带丰富、稳定为优。以35、40、45次3个梯度进行ISSRPCR反应循环次数筛选，试验重复3次。
　　2结果与分析
　　2.1直观分析法评分
　　分析白背飞虱ISSRPCR正交试验扩增产物电泳图（图1），依据条带丰富度、清晰度及背景干扰强弱做直观分析。泳道条带数量多、清晰度高、背景干扰低的PCR产物记分最高，记16，相反情况PCR产物记分最低，记1。图1自左至右结果记分依次记7、9、16、10、5、6、15、14、1、2、4、11、3、12、13、8。16个处理结果取3次重复试验记分平均值。
　　图1白背飞虱ISSRPCR正交试验产物电泳结果
　　Fig.1S.furcifera electrophoresis of
　　ISSRPCR products in the orthogonal tests 2.2ISSRPCR反应影响因素分析
　　采用正交设计助手II软件对试验结果进行方差分析，F比值表明：白背飞虱ISSRPCR反应5个因素影响程度不同：dNTPs 浓度> Mg2 浓度> 引物浓度> Taq DNA聚合酶量>模板DNA量。
　　2.2.1Mg2 浓度对白背飞虱ISSRPCR反应的影响
　　白背飞虱ISSRPCR反应Mg2 浓度指标曲线表明（图2）：Mg2 浓度由1.5 mmol/L至2.1 mmol/L变化，扩增结果记分降低；2.1 mmol/L至2.4 mmol/L，扩增结果记分上升，但较浓度1.5 mmol/L至1.8 mmol/L差。综合表明：白背飞虱ISSRPCR反应Mg2 浓度1.5 mmol/L时最优。
　　2.2.2dNTPs浓度对白背飞虱ISSRPCR反应的影响
　　白背飞虱ISSRPCR反应dNTPs浓度指标曲线表明（图2）：dNTPs浓度由0.15 mmol/L至0.25 mmol/L变化，扩增结果记分上升；0.25 mmol/L至0.30 mmol/L，扩增结果记分降低。白背飞虱ISSRPCR反应dNTPs最优浓度为0.25 mmol/L。
　　图2白背飞虱ISSRPCR反应因素指标曲线
　　Fig.2The ISSRPCR factor index curve for S.furcifera
　　2.2.3引物浓度对白背飞虱ISSRPCR反应的影响
　　白背飞虱ISSRPCR反应引物浓度指标曲线表明（图2）：引物浓度由0.3 μmol/L至0.9 μmol/L变化，扩增结果记分上升；0.9 μmol/L至12 μmol/L，扩增结果记分降低。白背飞虱ISSRPCR反应引物最优浓度为0.9 μmol/L。
　　2.2.4Taq DNA聚合酶量对白背飞虱ISSRPCR反应的影响白背飞虱ISSRPCR反应Taq DNA聚合酶量指标曲线表明（图2）：Taq DNA聚合酶量由0.6 U至0.8 U、1.0 U至1.2 U变化，扩增结果记分降低；08 U至1.0 U，扩增结果记分上升。0.6 U和1.0 U为记分值两个变化高峰值。综合Taq DNA聚合酶F比值分析表明：白背飞虱ISSRPCR反应Taq DNA聚合酶量1.0 U时最优。
　　2.2.5模板DNA量对白背飞虱ISSRPCR反应的影响
　　白背飞虱ISSRPCR反应模板DNA量指标曲线表明（图2）：模板DNA量由10 ng至30 ng、50 ng至70 ng变化，扩增结果记分降低；30 ng 至50 ng，扩增结果记分上升。白背飞虱ISSRPCR反应模板DNA量为50 ng时最优。
　　2.3退火温度对白背飞虱ISSRPCR反应的影响
　　退火温度对ISSRPCR反应结果具较大影响。由英属哥伦比亚大学生物技术实验室（UBC）开发的ISSR引物中筛选获得10条引物，做退火温度梯度筛选（图3），获得该10条引物的最优退火温度有所不同，在51.0~54.0 ℃间（表3）。
　　图3引物AG2退火温度梯度筛选
　　Fig.3The results of ISSRPCR at different
　　annealing temperatures with primer AG2
　　表3白背飞虱ISSRPCR引物信息1)
　　Table 3The primers of ISSRPCR for S.furcifera引物
　　Primer 碱基序列
　　Sequence(5′ to 3′)退火温度 /℃
　　Annealing temperature GA1(GA)8C52.3GA2(GA)8YG54.0AG1(AG)8YT52.3AG2(AG)8TA54.0CA1(CA)8A51.7CA2(CA)8RT51.2AC1(AC)8YG54.0AC2(AC)8TC53.0AC3(AC)8ATT52.3AC4(AC)8AG51.0
　　
　　1) Y=1/4(C,T); R=1/4(A,G)
　　
　　2.4循环次数对白背飞虱ISSRPCR反应的影响
　　白背飞虱ISSRPCR反应循环次数筛选试验设置了35、40、45次3个梯度，综合条带的丰富度及泳道弥散情况表明(图4)，40次循环为白背飞虱ISSRPCR反应最优循环次数。
　　图4白背飞虱ISSRPCR反应循环次数筛选
　　Fig.4The results of different ISSRPCR cycles
　　3结论与讨论
　　本研究结果揭示Mg2 、Taq DNA聚合酶、dNTPs、模板DNA和引物等因素综合影响PCR反应，因素间存在相互作用。正交设计优化以PCR体系各因素综合作用为研究对象，相对单因素分别优化法，正交设计优化试验简化了试验步骤，降低了试验成本，缩减了试验周期，获得的最优组合更符合试验实际情况。
　　Mg2 作为Taq DNA聚合酶激活剂，浓度过高导致非特异产物增加；浓度过低降低了聚合酶的作用，导致产物量降低。dNTPs作为PCR产物原料，浓度过高影响Mg2 的作用；过低则PCR反应不完全，产物量降低。模板DNA浓度影响与引物结合几率，过低或过高会降低结合几率，产物量降低［14］。本研究基于正交优化设计对白背飞虱ISSRPCR的5个因素进行4水平优化，构建了最优体系，即：2 μL 10×PCR Buffer（10 mmol/L TrisHCl;50 mmol/L KCl）,1.5 mmol/L Mg2 ,0.25 mmol/L dNTPs，0.9 μmol/L Primer，1 U Taq DNA聚合酶（TaKaRa）和50 ng 模板DNA，ddH2O補充至20 μL。
　　退火温度对PCR结果有较大影响［15］，温度过低会增加引物与DNA模板的非特异性结合，从而导致反应结果中出现大量非特异性结合条带；温度过高会降低引物与DNA模板的特异性结合，导致反应结果中特异性结合条带减少。本研究对10条白背飞虱ISSRPCR引物做退火温度梯度筛选，获得了各引物最优退火温度。各引物的最优退火温度有所不同，在51.0~54.0 ℃间。循环次数对ISSRPCR反应结果有一定的影响，较少的循环次数会导致扩增产物量减少，条带检测困难；较多的循环次数会导致非特异性产物的增加，导致泳道弥散严重。研究显示40次循环为白背飞虱ISSRPCR反应最優循环次数。
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