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摘 要：通过单因素试验分别考察了不同蛋白酶、底物浓度、加酶量、缓冲液pH、水解温度、水解时间、超声功率和超声时间对鱼鳞水解物DPPH自由基清除率的影响，并经正交试验对水解工艺进行优化。结果表明：最优制备工艺参数为：碱性蛋白酶、底物浓度10%、加酶量9000U/g、缓冲液pH 11.0、水解温度50℃、水解时间3.0h、超声功率300W、超声时间25min，在该工艺参数下制备的鱼鳞胶原蛋白肽的DPPH自由基清除率为61.4%。
关键词：草鱼鱼鳞;胶原蛋白肽;超声波;酶解
中图分类号 TS254.9 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2021）20-0065-04
Preparation of Collagen Peptide from Grass Carp Scales by Ultrasonic-assisted Enzymatic Method
LIN Yanyun et al.
（Fuzhou University Zhicheng College， Fuzhou 350002， China）
Abstract： In this study， the effects of different protease， substrate concentration， enzyme dosage， buffer pH， hydrolysis temperature， hydrolysis time， ultrasonic power and ultrasonic time on DPPH free radical scavenging rate of fish scale hydrolysate were investigated by single factor experiment. The hydrolysis process was optimized by orthogonal experiment. The optimal extraction parameters were as follows： alkaline protease， substrate concentration 10%， enzyme dosage 9000U/g， pH value of buffer 11.0， hydrolysis temperature 50℃， hydrolysis time 3.0h， ultrasonic power 300W， ultrasonic time 25min. DPPH free radical scavenging rate of fish scale collagen peptide was 61.4%.
Key words： Grass Carp Ccales;Collagen Peptide;Ultrasonic;Enzymatic hydrolysis
胶原蛋白是由3条肽链螺旋形成的纤维状高分子蛋白质，是动物结缔组织中的主要组成成分，其作为哺乳类动物体内最主要的功能性蛋白质具有含量高和分布广的特点，与细胞再生、老化、伤口治愈和疾病等有非常重要的关系[1]。胶原蛋白肽作为胶原蛋白水解后的产物，具有多肽的生物活性，分子量小，載体运输能力强，其作用主要表现在增强身体的免疫力、降血压、抑制细菌、营养护肤等方面[2]。鱼鳞是鱼类皮肤经过长期进化形成的具有保湿性和一定硬度的扇状衍生物[3]，含有丰富的蛋白质、脂肪、矿物质以及多类维生素[4]。研究表明，鱼鳞的主要成分是蛋白质和羟基磷灰石，其中蛋白质占鱼鳞总重的50%以上[5]。鱼鳞胶原蛋白肽具有独特的分子结构和良好的分子间交联能力，含有多种人体必需氨基酸，可生物降解，营养价值高，因此在医药、食品等行业能作为重要的活性成分[6]。本研究以福州本地草鱼鱼鳞为原材料，经过鱼鳞脱钙、除杂等工艺后，制备鱼鳞胶原蛋白肽，为鱼类深加工产业的发展提供增加附加值的工艺方案，减少资源浪费[7]，降低水产品加工业下脚料对环境的污染。
1 材料与方法
1.1 试验材料 试验对象：市售新鲜草鱼鱼鳞。主要试剂：乳酸、氯化钠、氢氧化钠购自西陇科学股份有限公司，无水乙醇购自广东光华科技股份有限公司，DPPH购自上海麦克林生化科技有限公司，胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶购自源叶生物。
1.2 试验仪器 DK-S26恒温水浴锅，上海森信实验仪器有限公司;KQ-400ES超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司;DHG-9245A鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司;BSA224S-CW电子分析天平，赛多利斯科学仪器有限公司;Fe28 Standard pH计，梅特勒-托利多仪器有限公司;TG16高速离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司;V-5600可见分光光度计，上海元析仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 鱼鳞预处理 新鲜鱼鳞洗净杂质和污血，自然晾干，用粉碎机打碎2min;脱钙：将粉碎后的鱼鳞转移至烧杯，用10%乳酸浸泡2h[8]，料液比为1∶15，2h后用蒸馏水清洗至中性;除杂：将脱钙后的鱼鳞转移至烧杯，用3%NaCl浸泡24h，料液比为1∶20，用蒸馏水清洗并过滤，去除鱼鳞中的非胶原蛋白;烘干：清洗后的鱼鳞放进85℃干燥箱中烘1.5h。
1.3.2 鱼鳞胶原蛋白肽的制备 称量：室温下分别准确称取一定量预处理过的鱼鳞样品于锥形瓶中，向锥形瓶中加入缓冲液;超声波处理：将锥形瓶放入超声波仪器中，对样品进行超声处理;水解：向锥形瓶中加入蛋白酶，与样品混匀后置于恒温水浴锅中水解[8];灭活：水解后85℃水浴锅中灭活15min;离心：待水解液冷却至室温后离心，离心条件为4000r/min、3min，离心后吸取上清液测定指标。 1.3.3 单因素试验 试验选取酶的种类（胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶）、不同底物浓度（2%、4%、6%、8%、10%、12%）、不同加酶量（4000、5000、6000、7000、8000、9000U/g）、不同缓冲液pH（9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0）、不同超声功率（150、180、210、240、270、300W）、不同水解温度（40、45、50、55、60、65℃）、不同水解时间（1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5h）、不同超声时间（5、10、15、20、25、30min）8个因素，以DPPH自由基清除率为指标，进行单因素试验。
1.3.4 正交试验 通过单因素试验选取3个因素作为正交试验考察的因素，采用L9（34）正交表进行试验设计。
1.3.5 DPPH自由基清除法 采用DPPH自由基清除法[9]测定鱼鳞胶原蛋白肽的抗氧化活性。准确称取3.94mg DPPH溶于100mL无水乙醇中，取2mL待测样品与等体积DPPH溶液充分混合，室温下避光静置30min后在517nm下测定吸光值，以蒸馏水作空白对照。
DPPH自由基清除率（%）=（Ao-As）/Ao×100
式中：As为样品组吸光值;Ao为空白组吸光值。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 酶的种类 由图1可知，4种蛋白酶在其最适pH和最适温度下进行酶解，其自由基清除率从高到低依次为：碱性蛋白酶>木瓜蛋白酶>胃蛋白酶>胰蛋白酶，因此选择碱性蛋白酶。
2.1.2 底物浓度 由图2可知，自由基清除率随着底物浓度的增加呈现先增加后减少的趋势，当底物浓度为8%时，胶原蛋白肽的自由基清除率达到最高。底物浓度过低，酶解的效率低[10];但底物浓度过高时，可能由于胶原蛋白的胶体性质，溶液粘度增加[11]，导致胶原蛋白酶解效果下降。
2.1.3 加酶量 由图3可知，随着加酶量的增加，自由基清除率呈现先增加后减小的趋势，当加酶量为8000U/g时，自由基清除率达到最高。
2.1.4 缓冲液pH pH值是影响酶活的因素之一[12]，只有在最适pH值下，酶才能发挥最好的催化效果，pH过高或过低，都会影响酶的活性。由图4可知，随着pH的增大，自由基清除率呈现先上升后下降的趋势，当pH为11时，自由基清除能力最强。
2.1.5 水解温度 水解温度过低或者过高都会影响酶的活性[13]。由图5可知，随着温度的增加，自由基清除率呈现先增加后减小的趋势。当水解温度为50℃左右时，自由基清除率达到最大。
2.1.6 水解时间 由图6可知，自由基清除率随着水解时间的增加呈现先上升后下降的趋势，水解时间为4.0h时，自由基清除率最高。水解時间过短，不能进行充分酶解;而水解时间过长，可能由于酶解产物的积累反而抑制了酶的作用，导致酶解效果下降。
2.1.7 超声功率 由图7可知，超声功率从150W升高至300W时，胶原蛋白肽的自由基清除率不断增大，在超声功率为300W时其自由基清除率达到最大。
2.1.8 超声时间 由图8可知，鱼鳞胶原蛋白肽的自由基清除率随超声时间增加有所波动，超声时间为30min时，自由基清除率达到最高。超声时间越长，自由基清除率越大，超声波在一定程度上有利于鱼鳞胶原的水解[14]。
2.2 正交试验结果 依据单因素试验初步确定的条件，选取底物浓度（A）、加酶量（B）、超声时间（C）作为试验因素，以DPPH自由基清除率为指标，采用L9（34）正交试验设计，对超声辅助酶法制备鱼鳞胶原蛋白肽的工艺进行优化（表1）。
通过极差分析可知，影响自由基清除率的因素主次顺序为：底物浓度（A）>加酶量（B）>超声时间（C）;优水平为A3、B3、C1;优组合为A3B3C1，即底物浓度10%、加酶量9000U/g、超声时间25min;对此试验结果进行验证，自由基清除率为61.4%。
3 结论
本试验以福州地区市售新鲜草鱼鱼鳞为原料，采用超声波辅助酶法制备草鱼鱼鳞胶原蛋白肽，通过单因素试验和正交试验，以DPPH自由基清除率作为试验指标，探索超声波辅助酶法提取草鱼鱼鳞胶原蛋白肽的最佳提取工艺。最终确定的最佳工艺参数为：碱性蛋白酶、底物浓度10%、加酶量9000U/g、缓冲液pH 11.0、超声功率300W、水解温度50℃、水解时间3.0h、超声时间25min，在此条件下鱼鳞胶原蛋白肽的自由基清除率为61.4%。
参考文献
[1]文卓琼，黄爱妮.鱼类胶原蛋白的研究进展[J].黑龙江科技信息，2016（14）：103-104.
[2]马文领，秦铁军，孙永华.生物活性肽功能分类及研究进展[J].中华损伤与修复杂志，2019，14（2）：149-152.
[3]周垚卿，董静雯，何强.鱼类主要副产物的提取与利用[J].食品安全质量检测学报，2019，10（13）：4284-4289.
[4]张文，吴清平，吴军林.螺旋藻营养保健价值及开发应用进展[J].食品与发酵科技，2013，49（03）：89-92.
[5]吴锁连，康怀彬，李冬姣.鱼鳞有效成分提取技术的研究进展[J].安徽农业科学，2017，45（27）：110-112，141.
[6]肖枫.黄河鲤鱼鳞胶原蛋白的性质及胶原肽活性研究[D].苏州：江苏大学，2014.
[7]郑雪丽，王林玲.鱼鳞胶原蛋白的提取与应用研究进展[J].河北农机，2017（12）：30.
[8]黄宇玫，李敏，曾芳，等.酸提和酶解两步法连续提取鳙鱼鱼鳞胶原蛋白工艺研究[J].食品科技，2019，44（02）：152-158.
[9]林春通，柯欣欣，郭建辉，等.胶原蛋白与胶原蛋白肽的抗氧化关系初探[J].中国食品学报，2017，17（10）：44-50.
[10]李敏.青鱼鱼鳞胶原蛋白和羟基磷灰石综合提取研究[D].长沙：湖南农业大学，2008.
[11]于林.白鲢鱼鳞胶原蛋白复合膜的制备以及保鲜效果研究[D].上海：上海海洋大学，2017.
[12]刘永，李夏欣，刘玲，等.鱼鳞胶原蛋白肽钙螯合物制备工艺的优化[J].食品工业科技，2013，34（20）：235-240.
[13]刘雨萱，陈媛，李美良，等.罗非鱼鱼鳞胶原蛋白的研究进展[J].食品工业科技，2019，40（06）：355-360.
[14]Xue Liang， Shiyi Feng， Saeed Ahmed， et al. Effect of Potassium Sorbate and Ultrasonic Treatment on the Properties of Fish Scale Collagen/Polyvinyl Alcohol Composite Film[J].Molecules，2019，24（13）：2363.
关键词：草鱼鱼鳞;胶原蛋白肽;超声波;酶解
中图分类号 TS254.9 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2021）20-0065-04
Preparation of Collagen Peptide from Grass Carp Scales by Ultrasonic-assisted Enzymatic Method
LIN Yanyun et al.
（Fuzhou University Zhicheng College， Fuzhou 350002， China）
Abstract： In this study， the effects of different protease， substrate concentration， enzyme dosage， buffer pH， hydrolysis temperature， hydrolysis time， ultrasonic power and ultrasonic time on DPPH free radical scavenging rate of fish scale hydrolysate were investigated by single factor experiment. The hydrolysis process was optimized by orthogonal experiment. The optimal extraction parameters were as follows： alkaline protease， substrate concentration 10%， enzyme dosage 9000U/g， pH value of buffer 11.0， hydrolysis temperature 50℃， hydrolysis time 3.0h， ultrasonic power 300W， ultrasonic time 25min. DPPH free radical scavenging rate of fish scale collagen peptide was 61.4%.
Key words： Grass Carp Ccales;Collagen Peptide;Ultrasonic;Enzymatic hydrolysis
胶原蛋白是由3条肽链螺旋形成的纤维状高分子蛋白质，是动物结缔组织中的主要组成成分，其作为哺乳类动物体内最主要的功能性蛋白质具有含量高和分布广的特点，与细胞再生、老化、伤口治愈和疾病等有非常重要的关系[1]。胶原蛋白肽作为胶原蛋白水解后的产物，具有多肽的生物活性，分子量小，載体运输能力强，其作用主要表现在增强身体的免疫力、降血压、抑制细菌、营养护肤等方面[2]。鱼鳞是鱼类皮肤经过长期进化形成的具有保湿性和一定硬度的扇状衍生物[3]，含有丰富的蛋白质、脂肪、矿物质以及多类维生素[4]。研究表明，鱼鳞的主要成分是蛋白质和羟基磷灰石，其中蛋白质占鱼鳞总重的50%以上[5]。鱼鳞胶原蛋白肽具有独特的分子结构和良好的分子间交联能力，含有多种人体必需氨基酸，可生物降解，营养价值高，因此在医药、食品等行业能作为重要的活性成分[6]。本研究以福州本地草鱼鱼鳞为原材料，经过鱼鳞脱钙、除杂等工艺后，制备鱼鳞胶原蛋白肽，为鱼类深加工产业的发展提供增加附加值的工艺方案，减少资源浪费[7]，降低水产品加工业下脚料对环境的污染。
1 材料与方法
1.1 试验材料 试验对象：市售新鲜草鱼鱼鳞。主要试剂：乳酸、氯化钠、氢氧化钠购自西陇科学股份有限公司，无水乙醇购自广东光华科技股份有限公司，DPPH购自上海麦克林生化科技有限公司，胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶购自源叶生物。
1.2 试验仪器 DK-S26恒温水浴锅，上海森信实验仪器有限公司;KQ-400ES超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司;DHG-9245A鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司;BSA224S-CW电子分析天平，赛多利斯科学仪器有限公司;Fe28 Standard pH计，梅特勒-托利多仪器有限公司;TG16高速离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司;V-5600可见分光光度计，上海元析仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 鱼鳞预处理 新鲜鱼鳞洗净杂质和污血，自然晾干，用粉碎机打碎2min;脱钙：将粉碎后的鱼鳞转移至烧杯，用10%乳酸浸泡2h[8]，料液比为1∶15，2h后用蒸馏水清洗至中性;除杂：将脱钙后的鱼鳞转移至烧杯，用3%NaCl浸泡24h，料液比为1∶20，用蒸馏水清洗并过滤，去除鱼鳞中的非胶原蛋白;烘干：清洗后的鱼鳞放进85℃干燥箱中烘1.5h。
1.3.2 鱼鳞胶原蛋白肽的制备 称量：室温下分别准确称取一定量预处理过的鱼鳞样品于锥形瓶中，向锥形瓶中加入缓冲液;超声波处理：将锥形瓶放入超声波仪器中，对样品进行超声处理;水解：向锥形瓶中加入蛋白酶，与样品混匀后置于恒温水浴锅中水解[8];灭活：水解后85℃水浴锅中灭活15min;离心：待水解液冷却至室温后离心，离心条件为4000r/min、3min，离心后吸取上清液测定指标。 1.3.3 单因素试验 试验选取酶的种类（胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶）、不同底物浓度（2%、4%、6%、8%、10%、12%）、不同加酶量（4000、5000、6000、7000、8000、9000U/g）、不同缓冲液pH（9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0）、不同超声功率（150、180、210、240、270、300W）、不同水解温度（40、45、50、55、60、65℃）、不同水解时间（1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5h）、不同超声时间（5、10、15、20、25、30min）8个因素，以DPPH自由基清除率为指标，进行单因素试验。
1.3.4 正交试验 通过单因素试验选取3个因素作为正交试验考察的因素，采用L9（34）正交表进行试验设计。
1.3.5 DPPH自由基清除法 采用DPPH自由基清除法[9]测定鱼鳞胶原蛋白肽的抗氧化活性。准确称取3.94mg DPPH溶于100mL无水乙醇中，取2mL待测样品与等体积DPPH溶液充分混合，室温下避光静置30min后在517nm下测定吸光值，以蒸馏水作空白对照。
DPPH自由基清除率（%）=（Ao-As）/Ao×100
式中：As为样品组吸光值;Ao为空白组吸光值。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 酶的种类 由图1可知，4种蛋白酶在其最适pH和最适温度下进行酶解，其自由基清除率从高到低依次为：碱性蛋白酶>木瓜蛋白酶>胃蛋白酶>胰蛋白酶，因此选择碱性蛋白酶。
2.1.2 底物浓度 由图2可知，自由基清除率随着底物浓度的增加呈现先增加后减少的趋势，当底物浓度为8%时，胶原蛋白肽的自由基清除率达到最高。底物浓度过低，酶解的效率低[10];但底物浓度过高时，可能由于胶原蛋白的胶体性质，溶液粘度增加[11]，导致胶原蛋白酶解效果下降。
2.1.3 加酶量 由图3可知，随着加酶量的增加，自由基清除率呈现先增加后减小的趋势，当加酶量为8000U/g时，自由基清除率达到最高。
2.1.4 缓冲液pH pH值是影响酶活的因素之一[12]，只有在最适pH值下，酶才能发挥最好的催化效果，pH过高或过低，都会影响酶的活性。由图4可知，随着pH的增大，自由基清除率呈现先上升后下降的趋势，当pH为11时，自由基清除能力最强。
2.1.5 水解温度 水解温度过低或者过高都会影响酶的活性[13]。由图5可知，随着温度的增加，自由基清除率呈现先增加后减小的趋势。当水解温度为50℃左右时，自由基清除率达到最大。
2.1.6 水解时间 由图6可知，自由基清除率随着水解时间的增加呈现先上升后下降的趋势，水解时间为4.0h时，自由基清除率最高。水解時间过短，不能进行充分酶解;而水解时间过长，可能由于酶解产物的积累反而抑制了酶的作用，导致酶解效果下降。
2.1.7 超声功率 由图7可知，超声功率从150W升高至300W时，胶原蛋白肽的自由基清除率不断增大，在超声功率为300W时其自由基清除率达到最大。
2.1.8 超声时间 由图8可知，鱼鳞胶原蛋白肽的自由基清除率随超声时间增加有所波动，超声时间为30min时，自由基清除率达到最高。超声时间越长，自由基清除率越大，超声波在一定程度上有利于鱼鳞胶原的水解[14]。
2.2 正交试验结果 依据单因素试验初步确定的条件，选取底物浓度（A）、加酶量（B）、超声时间（C）作为试验因素，以DPPH自由基清除率为指标，采用L9（34）正交试验设计，对超声辅助酶法制备鱼鳞胶原蛋白肽的工艺进行优化（表1）。
通过极差分析可知，影响自由基清除率的因素主次顺序为：底物浓度（A）>加酶量（B）>超声时间（C）;优水平为A3、B3、C1;优组合为A3B3C1，即底物浓度10%、加酶量9000U/g、超声时间25min;对此试验结果进行验证，自由基清除率为61.4%。
3 结论
本试验以福州地区市售新鲜草鱼鱼鳞为原料，采用超声波辅助酶法制备草鱼鱼鳞胶原蛋白肽，通过单因素试验和正交试验，以DPPH自由基清除率作为试验指标，探索超声波辅助酶法提取草鱼鱼鳞胶原蛋白肽的最佳提取工艺。最终确定的最佳工艺参数为：碱性蛋白酶、底物浓度10%、加酶量9000U/g、缓冲液pH 11.0、超声功率300W、水解温度50℃、水解时间3.0h、超声时间25min，在此条件下鱼鳞胶原蛋白肽的自由基清除率为61.4%。
参考文献
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[3]周垚卿，董静雯，何强.鱼类主要副产物的提取与利用[J].食品安全质量检测学报，2019，10（13）：4284-4289.
[4]张文，吴清平，吴军林.螺旋藻营养保健价值及开发应用进展[J].食品与发酵科技，2013，49（03）：89-92.
[5]吴锁连，康怀彬，李冬姣.鱼鳞有效成分提取技术的研究进展[J].安徽农业科学，2017，45（27）：110-112，141.
[6]肖枫.黄河鲤鱼鳞胶原蛋白的性质及胶原肽活性研究[D].苏州：江苏大学，2014.
[7]郑雪丽，王林玲.鱼鳞胶原蛋白的提取与应用研究进展[J].河北农机，2017（12）：30.
[8]黄宇玫，李敏，曾芳，等.酸提和酶解两步法连续提取鳙鱼鱼鳞胶原蛋白工艺研究[J].食品科技，2019，44（02）：152-158.
[9]林春通，柯欣欣，郭建辉，等.胶原蛋白与胶原蛋白肽的抗氧化关系初探[J].中国食品学报，2017，17（10）：44-50.
[10]李敏.青鱼鱼鳞胶原蛋白和羟基磷灰石综合提取研究[D].长沙：湖南农业大学，2008.
[11]于林.白鲢鱼鳞胶原蛋白复合膜的制备以及保鲜效果研究[D].上海：上海海洋大学，2017.
[12]刘永，李夏欣，刘玲，等.鱼鳞胶原蛋白肽钙螯合物制备工艺的优化[J].食品工业科技，2013，34（20）：235-240.
[13]刘雨萱，陈媛，李美良，等.罗非鱼鱼鳞胶原蛋白的研究进展[J].食品工业科技，2019，40（06）：355-360.
[14]Xue Liang， Shiyi Feng， Saeed Ahmed， et al. Effect of Potassium Sorbate and Ultrasonic Treatment on the Properties of Fish Scale Collagen/Polyvinyl Alcohol Composite Film[J].Molecules，2019，24（13）：2363.