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摘要 為了解安徽省猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）的遗传变异，对5株PEDV安徽流行株M基因进行RT-PCR扩增、序列测定和分析。结果表明，5株 PEDV 安徽流行毒株M基因的全长均为681 bp，编码226个氨基酸，核苷酸同源性为 99.1%～99.9%，其与国内外PEDV参考毒株核苷酸同源性为96.9%～100%。进化树分析显示，5株流行毒株与CV777、attenuated DR13、LZC和CHS亲缘关系较远，与2011年后国内外PEDV分离株的亲缘关系较近。
关键词 猪流行性腹泻;M基因;序列分析
中图分类号 S852.65+1文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2019）16-0116-03
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.16.034
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Cloning and Sequence Analysis of M Gene of 5 Epidemic Strains of Porcine Epidemic Diarrhea Virus from Anhui Province
PAN Xiao cheng1，2， SHEN Xue huai1，2， ZHAO Rui hong1，2 et al
（1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science， Anhui Academy of Agricultural Sciences， Hefei，Anhui230031; 2.Livestock and Poultry Epidemic Diseases Research Center of Anhui Province， Hefei，Anhui230031）
Abstract In order to study the genetic variation of porcine epidemic diarrhea virus （PEDV） in Anhui Province， M genes of 5 epidemic strains of PEDV isolated from Anhui Province were amplified by RT PCR，sequenced and analyzed. The results showed that the whole length of M genes of 5 epidemic strains of PEDV isolated from Anhui Province was all 681 bp， which encoded 226 amino acids， the nucleotide identity was 99.1%-99.9%. M genes of 5 epidemic strains of PEDV isolated from Anhui Province had the homology（96.9%-100%）with the reference strains of PEDV at home and abroad. Phylogenetic tree analysis indicated that 5 epidemic strains of PEDV isolated from Anhui Province were far from CV777， attenuated DR13， LZC and CHS strains， but they were close to reference PEDV strains isolated after 2011 from the aspect of genetic relationship. Key words Porcine epidemic diarrhea;M gene;Sequence analysis
猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea Virus，PEDV）属于冠状病毒科冠状病毒属，为单股正链有囊膜的RNA病毒，可导致猪的一种以水样腹泻、呕吐和脱水为特征的传染病。1971年首次在英国发现猪流行性腹泻病（porcine epidemic diarrhea，PED）[1]，我国内地自20世纪80年代初以来陆续有关于PEDV分离和鉴定的报道[2-3]。2010年底开始，PED在我国呈暴发性流行，流行广泛，主要表现为各年龄段猪均可发生腹泻，成年猪一般只表现为腹泻症状，仔猪死亡率高，10日龄内仔猪死亡率可达100%，给众多养猪场（户）带来了巨大的经济损失[4-5]。PEDV M基因由681个核苷酸组成，编码226个氨基酸。研究表明，M基因与PEDV病毒的组装和出芽以及诱导α干扰素的产生等有关[6-7]。笔者对安徽省PEDV安徽流行株的M基因进行了PCR扩增和序列分析，以期为PED的防控提供依据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂、材料
RNAiso Plus试剂、反转录试剂盒、Taq酶、pMD-18T载体等均购自TaKaRa公司;琼脂糖凝胶回收试剂盒、DH5α、DNA Marker等购自生工生物工程（上海）股份有限公司;豬流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪轮状病毒（GARV）的抗原快速检测试剂盒（胶体金试剂）购自BioNote公司。
1.2 病料
病料样品为刮取的肠道黏膜，采自安徽省境内疑似发生猪流行性腹泻的猪场（2013—2017年）。发病仔猪临床表现为水样腹泻、肠道出血，使用PEDV、TGEV和GARV的胶体金抗原快速检测试剂盒检测，结果为PEDV阳性，TGEV和GARV均为阴性。
1.3 引物合成
根据GenBank数据库中已发表的PEDV M基因序列，设计了1对引物：P 1（5’—3’）为CCCCAGTACTGTTATTGACGTATAAAC，P 2（5’—3’）为GTTTAGACTAAATGAAGCACTTTC，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，扩增715 bp的基因片段，包含PEDV M基因全长。
1.4 RNA提取及cDNA合成
刮取发病仔猪小肠黏膜层，按TaKaRa公司RNAiso Plus试剂盒说明书提取总RNA，用TaKaRa公司1st Strand cDNA Synthesis kit进行反转录合成cDNA，-20 ℃下保存备用。
1.5 PCR扩增
以合成的cDNA为模板，用引物对P 1、P 2进行PCR扩增，扩增体系为cDNA 3 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，上下游引物（P 1/P 2）各 1 μL（10 pmol/μL），Ex-Taq酶0.5 μL，ddH 2O 15 μL。PCR扩增程序如下：94 ℃ 5 min;94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35个循环;72 ℃延伸10 min。电泳鉴定为阳性的PCR产物，按照琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书对PCR产物进行回收，连接pMD-18T载体，转入DH5α，将鉴定为阳性的质粒送交生工生物工程（上海）股份有限公司测序。
1.6 基因序列分析
使用DNA Star、DNAMAN、Genetyx等软件，将扩增序列与GenBank数据库中的12个PEDV 分离株的M基因序列进行比对、同源性分析和遗传进化分析。试验所用参考毒株序列见表1。
2 结果与分析
2.1 RT-PCR扩增结果和测序结果
取PEDV胶体金抗原检测试剂检测为阳性，且来自安徽省不同地区7个猪场的样品用引物对P 1、P 2进行进行PCR扩增，电泳结果显示均扩增出约715 bp的基因片段（图1），与预期结果相符。测序结果显示，获得7株PEDV流行毒株的M基因序列，序列全长均为681个核苷酸，编码226个氨基酸，其中有2对流行毒株的基因核苷酸序列完全相同，将核苷酸序列不同的5株分别命名为AH-FD、AH-SX、AH-GD、AH-SD和AH-SH。
2.2 PEDV M基因核苷酸同源性分析
将该试验获得的5株安徽地方流行毒株（AH-FD、AH-SX、AH-GD、AH-SD和AH-SH）与参考毒株（GD-B、CH-FJND、CH-BJ2、CH-GDGZ、V7-HB2018、CHS、LZC、attenuated DR13、IA2、S12、MEX-GTO、CV777）进行M基因核苷酸序列同源性分析，结果见图2。从图2可以看出，5株安徽地方流行毒株M基因核苷酸序列同源性为99.1%～99.9%，与经典毒株（CV777）、疫苗株（attenuated DR13）和2011年前我国分离株（LZC和CHS）序列同源性较低，为 96.9%～98.2%;5株地方流行毒株M基因核苷酸序列与2011年后的国内外分离株（GD-B、CH-FJND、CH-BJ2、CH-GDGZ、V7-HB2018、IA2、S12、MEX-GTO）序列的同源性较高，为99.0%～100%，其中同源性最高的是AH-SH与美国分离株IA2以及我国分离株GD-B，均达100%。 2.3 PEDV M基因遗传进化分析
将该试验得到的5株安徽地方流行毒株（AH-FD、AH-SX、AH-GD、AH-SD和AH-SH）与参考毒株（GD-B、CH-FJND、CH-BJ2、CH-GDGZ、V7-HB2018、CHS、LZC、attenuated DR13、IA2、S12、MEX-GTO、CV777）的M基因核苷酸序列进行系统进化树分析，结果见图3。从图3可以看出，进化树分为Ⅰ和Ⅱ2个群，I群包括CHS、LZC、attenuated DR13和CV777，Ⅱ 群包括5株安徽地方流行毒株及GD-B、CH-FJND、CH-BJ2、CH-GDGZ、V7-HB2018、IA2、S12和MEX-GTO。這表明5株安徽地方流行毒株（AH-FD、AH-SX、AH-GD、AH-SD和AH-SH）与经典毒株（CV777）、疫苗株（attenuated DR13）和2011年前我国分离株（LZC和CHS）的亲缘关系较远。
3 讨论
该研究对2013—2017年安徽省境内经胶体金试纸条确认为PEDV感染的7个猪场病料进行PCR扩增，均扩增出序列全长为681个核苷酸PEDV M基因，将其中苷酸序列不同的5株安徽地方流行毒株（AH-FD、AH-SX、AH-GD、AH-SD和AH-SH）与参考毒株进行核苷酸序列同源性和遗传进化分析。结果表明，5株安徽地方流行毒株间以及它们与2011年后的国内外分离株（GD-B、CH-FJND、CH-BJ2、CH-GDGZ、V7-HB2018、IA2、S12、MEX-GTO）的核苷酸序列同源性均较高，分别为99.1%～99.9%和99.0%～100%;它们与经典毒株（CV777）、疫苗株（attenuated DR13）和2011年前我国分离株（LZC和CHS）的序列同源性较低，为 96.9%～98.2%，亲缘关系也较远。这说明一方面2011年前后的PEDV分离株存在相对较大的差异，且2011年后 PEDV的国内外主要分离株M基因差异不大，这与卢冰霞等[8]、张红垒等[9]、王隆柏等[10]研究结果基本一致，另一方面PEDV M基因具有高度保守性（核苷酸序列同源性为96.9%～100%），2011年后分离株虽然与此前毒株的基因序列存在相对较大差异，但这种差异是否导致了M蛋白功能仍需进一步研究。
参考文献
[1] PENSERT M B，DE BOUCK P.A new coronavirus-like particle associated with diarrhea in swine[J].Arch Virol，1978，58（3）：243-247.
[2] 蔡宝祥.介绍几种新近发现的猪传染病[J].畜牧与兽医，1982（5）：218-221.
[3] 芮聪杰，潘孝成，沈学怀，等.猪流行性腹泻病毒检测技术研究进展[J].安徽农业科学，2018，46（25）：22-25.
[4] 刘孝珍，陈建飞，时洪艳，等.2011年猪流行性腹泻病毒的遗传变异分析[J].中国预防兽医学报，2012，34（3）：180-183.
[5] LI W T，LI H，LIU Y B，et al.New variants of porcine epidemic diarrhea virus，China，2011[J].Emerging infectious diseases，2012，18（8）：1350-1353.
[6] DE HAAN C A M，KUO L，MASTERS P S，et al.Coronavirus particle assembly：Primary structure requirements of the membrane protein [J].J Virol，1998，72（8）：6838-6850.
[7] LAUDE H，GELFI J，LAVENANT L，et al.Single amino acid changes in theviral glycoproteinM affect induction of alpha interferon by the coronavirus transmissible gastroenteritis vims [J].J Virol，1992，66（2）：743-749.
[8] 卢冰霞，秦毅斌，何颖，等.2011年-2014年广西猪流行性腹泻病毒检测及其M基因的序列分析[J].中国畜牧兽医，2015，42（3）：549-557.
[9] 张红垒，董洁，梁亚冰，等.猪流行性腹泻病毒的RT-PCR鉴定及其M、N和E基因的序列分析[J].西北农业学报，2012，21（9）：24-28.
[10] 王隆柏，吴学敏，车勇良，等.猪流行性腹泻病毒ORF3和M基因的克隆与序列分析[J].中国动物传染病学报，2012，20（3）：67-72.
关键词 猪流行性腹泻;M基因;序列分析
中图分类号 S852.65+1文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2019）16-0116-03
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.16.034
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Cloning and Sequence Analysis of M Gene of 5 Epidemic Strains of Porcine Epidemic Diarrhea Virus from Anhui Province
PAN Xiao cheng1，2， SHEN Xue huai1，2， ZHAO Rui hong1，2 et al
（1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science， Anhui Academy of Agricultural Sciences， Hefei，Anhui230031; 2.Livestock and Poultry Epidemic Diseases Research Center of Anhui Province， Hefei，Anhui230031）
Abstract In order to study the genetic variation of porcine epidemic diarrhea virus （PEDV） in Anhui Province， M genes of 5 epidemic strains of PEDV isolated from Anhui Province were amplified by RT PCR，sequenced and analyzed. The results showed that the whole length of M genes of 5 epidemic strains of PEDV isolated from Anhui Province was all 681 bp， which encoded 226 amino acids， the nucleotide identity was 99.1%-99.9%. M genes of 5 epidemic strains of PEDV isolated from Anhui Province had the homology（96.9%-100%）with the reference strains of PEDV at home and abroad. Phylogenetic tree analysis indicated that 5 epidemic strains of PEDV isolated from Anhui Province were far from CV777， attenuated DR13， LZC and CHS strains， but they were close to reference PEDV strains isolated after 2011 from the aspect of genetic relationship. Key words Porcine epidemic diarrhea;M gene;Sequence analysis
猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea Virus，PEDV）属于冠状病毒科冠状病毒属，为单股正链有囊膜的RNA病毒，可导致猪的一种以水样腹泻、呕吐和脱水为特征的传染病。1971年首次在英国发现猪流行性腹泻病（porcine epidemic diarrhea，PED）[1]，我国内地自20世纪80年代初以来陆续有关于PEDV分离和鉴定的报道[2-3]。2010年底开始，PED在我国呈暴发性流行，流行广泛，主要表现为各年龄段猪均可发生腹泻，成年猪一般只表现为腹泻症状，仔猪死亡率高，10日龄内仔猪死亡率可达100%，给众多养猪场（户）带来了巨大的经济损失[4-5]。PEDV M基因由681个核苷酸组成，编码226个氨基酸。研究表明，M基因与PEDV病毒的组装和出芽以及诱导α干扰素的产生等有关[6-7]。笔者对安徽省PEDV安徽流行株的M基因进行了PCR扩增和序列分析，以期为PED的防控提供依据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂、材料
RNAiso Plus试剂、反转录试剂盒、Taq酶、pMD-18T载体等均购自TaKaRa公司;琼脂糖凝胶回收试剂盒、DH5α、DNA Marker等购自生工生物工程（上海）股份有限公司;豬流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪轮状病毒（GARV）的抗原快速检测试剂盒（胶体金试剂）购自BioNote公司。
1.2 病料
病料样品为刮取的肠道黏膜，采自安徽省境内疑似发生猪流行性腹泻的猪场（2013—2017年）。发病仔猪临床表现为水样腹泻、肠道出血，使用PEDV、TGEV和GARV的胶体金抗原快速检测试剂盒检测，结果为PEDV阳性，TGEV和GARV均为阴性。
1.3 引物合成
根据GenBank数据库中已发表的PEDV M基因序列，设计了1对引物：P 1（5’—3’）为CCCCAGTACTGTTATTGACGTATAAAC，P 2（5’—3’）为GTTTAGACTAAATGAAGCACTTTC，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，扩增715 bp的基因片段，包含PEDV M基因全长。
1.4 RNA提取及cDNA合成
刮取发病仔猪小肠黏膜层，按TaKaRa公司RNAiso Plus试剂盒说明书提取总RNA，用TaKaRa公司1st Strand cDNA Synthesis kit进行反转录合成cDNA，-20 ℃下保存备用。
1.5 PCR扩增
以合成的cDNA为模板，用引物对P 1、P 2进行PCR扩增，扩增体系为cDNA 3 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，上下游引物（P 1/P 2）各 1 μL（10 pmol/μL），Ex-Taq酶0.5 μL，ddH 2O 15 μL。PCR扩增程序如下：94 ℃ 5 min;94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35个循环;72 ℃延伸10 min。电泳鉴定为阳性的PCR产物，按照琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书对PCR产物进行回收，连接pMD-18T载体，转入DH5α，将鉴定为阳性的质粒送交生工生物工程（上海）股份有限公司测序。
1.6 基因序列分析
使用DNA Star、DNAMAN、Genetyx等软件，将扩增序列与GenBank数据库中的12个PEDV 分离株的M基因序列进行比对、同源性分析和遗传进化分析。试验所用参考毒株序列见表1。
2 结果与分析
2.1 RT-PCR扩增结果和测序结果
取PEDV胶体金抗原检测试剂检测为阳性，且来自安徽省不同地区7个猪场的样品用引物对P 1、P 2进行进行PCR扩增，电泳结果显示均扩增出约715 bp的基因片段（图1），与预期结果相符。测序结果显示，获得7株PEDV流行毒株的M基因序列，序列全长均为681个核苷酸，编码226个氨基酸，其中有2对流行毒株的基因核苷酸序列完全相同，将核苷酸序列不同的5株分别命名为AH-FD、AH-SX、AH-GD、AH-SD和AH-SH。
2.2 PEDV M基因核苷酸同源性分析
将该试验获得的5株安徽地方流行毒株（AH-FD、AH-SX、AH-GD、AH-SD和AH-SH）与参考毒株（GD-B、CH-FJND、CH-BJ2、CH-GDGZ、V7-HB2018、CHS、LZC、attenuated DR13、IA2、S12、MEX-GTO、CV777）进行M基因核苷酸序列同源性分析，结果见图2。从图2可以看出，5株安徽地方流行毒株M基因核苷酸序列同源性为99.1%～99.9%，与经典毒株（CV777）、疫苗株（attenuated DR13）和2011年前我国分离株（LZC和CHS）序列同源性较低，为 96.9%～98.2%;5株地方流行毒株M基因核苷酸序列与2011年后的国内外分离株（GD-B、CH-FJND、CH-BJ2、CH-GDGZ、V7-HB2018、IA2、S12、MEX-GTO）序列的同源性较高，为99.0%～100%，其中同源性最高的是AH-SH与美国分离株IA2以及我国分离株GD-B，均达100%。 2.3 PEDV M基因遗传进化分析
将该试验得到的5株安徽地方流行毒株（AH-FD、AH-SX、AH-GD、AH-SD和AH-SH）与参考毒株（GD-B、CH-FJND、CH-BJ2、CH-GDGZ、V7-HB2018、CHS、LZC、attenuated DR13、IA2、S12、MEX-GTO、CV777）的M基因核苷酸序列进行系统进化树分析，结果见图3。从图3可以看出，进化树分为Ⅰ和Ⅱ2个群，I群包括CHS、LZC、attenuated DR13和CV777，Ⅱ 群包括5株安徽地方流行毒株及GD-B、CH-FJND、CH-BJ2、CH-GDGZ、V7-HB2018、IA2、S12和MEX-GTO。這表明5株安徽地方流行毒株（AH-FD、AH-SX、AH-GD、AH-SD和AH-SH）与经典毒株（CV777）、疫苗株（attenuated DR13）和2011年前我国分离株（LZC和CHS）的亲缘关系较远。
3 讨论
该研究对2013—2017年安徽省境内经胶体金试纸条确认为PEDV感染的7个猪场病料进行PCR扩增，均扩增出序列全长为681个核苷酸PEDV M基因，将其中苷酸序列不同的5株安徽地方流行毒株（AH-FD、AH-SX、AH-GD、AH-SD和AH-SH）与参考毒株进行核苷酸序列同源性和遗传进化分析。结果表明，5株安徽地方流行毒株间以及它们与2011年后的国内外分离株（GD-B、CH-FJND、CH-BJ2、CH-GDGZ、V7-HB2018、IA2、S12、MEX-GTO）的核苷酸序列同源性均较高，分别为99.1%～99.9%和99.0%～100%;它们与经典毒株（CV777）、疫苗株（attenuated DR13）和2011年前我国分离株（LZC和CHS）的序列同源性较低，为 96.9%～98.2%，亲缘关系也较远。这说明一方面2011年前后的PEDV分离株存在相对较大的差异，且2011年后 PEDV的国内外主要分离株M基因差异不大，这与卢冰霞等[8]、张红垒等[9]、王隆柏等[10]研究结果基本一致，另一方面PEDV M基因具有高度保守性（核苷酸序列同源性为96.9%～100%），2011年后分离株虽然与此前毒株的基因序列存在相对较大差异，但这种差异是否导致了M蛋白功能仍需进一步研究。
参考文献
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[5] LI W T，LI H，LIU Y B，et al.New variants of porcine epidemic diarrhea virus，China，2011[J].Emerging infectious diseases，2012，18（8）：1350-1353.
[6] DE HAAN C A M，KUO L，MASTERS P S，et al.Coronavirus particle assembly：Primary structure requirements of the membrane protein [J].J Virol，1998，72（8）：6838-6850.
[7] LAUDE H，GELFI J，LAVENANT L，et al.Single amino acid changes in theviral glycoproteinM affect induction of alpha interferon by the coronavirus transmissible gastroenteritis vims [J].J Virol，1992，66（2）：743-749.
[8] 卢冰霞，秦毅斌，何颖，等.2011年-2014年广西猪流行性腹泻病毒检测及其M基因的序列分析[J].中国畜牧兽医，2015，42（3）：549-557.
[9] 张红垒，董洁，梁亚冰，等.猪流行性腹泻病毒的RT-PCR鉴定及其M、N和E基因的序列分析[J].西北农业学报，2012，21（9）：24-28.
[10] 王隆柏，吴学敏，车勇良，等.猪流行性腹泻病毒ORF3和M基因的克隆与序列分析[J].中国动物传染病学报，2012，20（3）：67-72.