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摘要根据番茄细菌性叶斑病菌(Pseudomonas syringae pv. tomato, Pst)的一段特异蛋白基因序列，按照锁式探针的设计原理设计探针和扩增引物，优化系列反应条件，建立了特异性的Pst超分支滚环扩增技术。试验结果表明：该检测技术能够从供试的10种不同的病原菌中特异性地检测出番茄细菌性叶斑病菌，DNA检测的最低浓度为500 fg/μL，检测灵敏度高于常规PCR。
关键词番茄细菌性叶斑病菌；超分支滚环扩增；锁式探针
中图分类号:S 436.412文献标识码：ADOI：10.3969/j.issn.05291542.2014.02.017Rapid detection of Pseudomonas syringae pv. tomato
using hyperbranched rolling circle amplificationWang Nianwu 1,2，Wang Ting1，Shen Jianguo2，Hu Fangping1（1. College of Plant Protection, Fujian Agricultural and Forestry University, Fuzhou350002, China;
2. Fujian Bureau of ExitEntry Inspection and Quarantine, Fuzhou350001, China）AbstractA padlock probe was designed based on the sequence of the unique hypothetic protein gene in the complete genome of Pseudomonas syringae pv. tomato (Pst), according to the design principle of padlock probe and primers. Detection system of hyperbranched rolling circle amplification (HRCA) was established and optimized. The results showed that Pst could be specifically detected by this method, while other reference plant pathogens could not be detected. The detection sensitivity of HRCA was about 500 fg/μL of DNA concentration, higher than that of the conventional PCR method.
Key wordsPseudomonas syringae pv. tomato;hyperbranched rolling circle amplification;padlock probe 番茄細菌性叶斑病（bacterial speck of tomato）是番茄上重要的病害之一，病原菌为Pseudomonas syringae pv. tomato (Okabe) Young ，Dye ＆ Wilkie（Pst）。该病害最早于1933年在美国的布雷登顿市被发现，但因为这种病害很容易和其他细菌性病害混淆，致使在其他地方很少被报道，直到1977-1978年在霍姆斯特德地区大暴发之后才被重视［1］。该病菌仅危害番茄，可造成叶片斑点、坏死，导致植株生长不良而减产；在果实上危害形成瑕疵症状，影响番茄的感官品质而导致难以销售［2］。该病害因缺少典型的诊断鉴别症状极易和其他病害的症状混淆，另外，病原菌又可由种子携带，所以对该病害的快速诊断和病原菌的快速检测是植病工作者的研究内容之一。
传统的方法可用于诊断和鉴定P.syringae pv. tomato病原，但费力费时；用非放射性元素标记DNA探针可用于检测番茄植株上的叶斑病菌，但因菌株自身产生毒素，检测结果常受到影响［3］；Zaccardelli等［4］利用hrpZ基因特异性序列通过常规PCR方法来检测受感染的植株和幼苗，获得了一定的成功。但常规PCR的方法有一定的局限性，容易受污染形成假阳性结果，而且不能高通量检测病原物。自锁式探针被报道以来［5］，它以灵敏、特异、稳定等特点被广泛应用到分子检测中。锁式探针是由3′和5′端两段靶标序列和中间的一段对检测结果没有影响的连接序列构成的一种较长的单链寡核苷酸片段。其工作原理是当检测体系中存在靶标DNA时，锁式探针两端的靶标序列就会与靶标DNA完全互补配对，线型锁式探针在连接酶的作用下被有效地连接成环型，而在没有相应靶标DNA存在时锁式探针不被连接酶连接，仅以线性形式存在。在核酸外切酶的作用下，多余的线性锁式探针被消化水解，连接成环状的锁式探针在Bst DNA聚合酶和通用引物的作用下恒温扩增［6］，其扩增效率在1 h之内就可以达到109或更多拷贝［7］。锁式探针的恒温扩增具有极好的检测灵敏度、特异性和实用性，近几年已被广泛地应用于细胞原位检测、微生物、医学病原检测鉴定等领域［89］。40卷第2期王念武等：番茄细菌性叶斑病菌超分支滚环扩增快速检测技术2014Schopf 等［10］通过琼脂糖珠表面修饰扩增引物，然后进行滚环扩增，并通过荧光探针检测，DNA检测限达到1 amol；Su等［11］利用一种高灵敏的磁珠电化学发光方法，结合滚环扩增技术来分析单链核苷酸多态性，结果可以将1/100 000突变型样品从野生型中区分开；Li等［12］利用纳米技术结合滚环扩增技术，通过金纳米粒子探针与酶消化的滚环扩增产物杂交，实现用肉眼比较颜色来进行检测；Cheng等［13］在双抗体免疫夹心的基础上建立了免疫滚环扩增方法，通过在引物5′ 端标记生物素，实现探针与扩增产物原位杂交检测；Yan等［14］利用了纳米金能够同时结合蛋白和核酸的特性，将用于RCA反应的DNA引物和抗体通过纳米金连接起来，形成一个更强信号的扩增反应，其灵敏度可达到5 amol/L，比传统的ELISA方法扩大5个数量级；郭艳玲等［15］用超分支滚环扩增技术对60例肺结核病人、38例非结核对照组和20例健康人的痰标本进行检测，灵敏度达740 amol/L，检测菌悬液的灵敏度达200 cfu/mL；在植物病原检测中，Szemes等［6］设计了11种锁式探针，采用锁式探针与微阵列相结合的方法，对11种植物病原物(真菌和线虫)进行分析，建立了特异性强、灵敏度高的检测技术体系，黄冠军［16］等据柑橘溃疡病菌(Xanthomonas axonopodis pv．citri)独有的蛋白基因序列设计特异性锁式探针进行滚环扩增，建立了柑橘溃疡病菌滚环扩增检测技术体系。本研究旨在依据番茄细菌性叶斑病菌独有的蛋白基因序列，设计特异的锁式探针及其扩增引物，建立特异、灵敏的番茄细菌性叶斑病菌超分支滚环扩增（HRCA）检测技术，为我国的口岸把关，也为番茄细菌性叶斑病菌的疫情动态监测提供新的分子检测技术。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1供试菌株
番茄溃疡病菌［Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis （Smith）Davis et al.］，由福建省农业科学院作物研究所邱思鑫提供；番茄细菌性叶斑病菌（Pseudomonas syringae pv. tomato）、番茄青枯病菌［Ralstonia solanacearum(Smith) Yabuuchi et al. ］、西瓜细菌性果斑病菌（Acidovorax avenae subsp. citrulli Willems et al.）、水稻细菌性条斑病菌［Xanthomonas oryzae pv. oryzicola (Fang et al.) Swing et al. ］、杨桃细菌性斑点病菌［P.syringae pv. averrhoii(van Hall) Bergey］、柑橘溃疡病菌［Xanthomonas citri (Hasse) Dawson］、枯草芽胞杆菌［ Bacillus subtilis (Ehrenberg) Cohn］、香蕉枯萎病菌［Fusarium oxysporum f.sp. cubense (E.F.Smith) W.C. Snyd.
关键词番茄细菌性叶斑病菌；超分支滚环扩增；锁式探针
中图分类号:S 436.412文献标识码：ADOI：10.3969/j.issn.05291542.2014.02.017Rapid detection of Pseudomonas syringae pv. tomato
using hyperbranched rolling circle amplificationWang Nianwu 1,2，Wang Ting1，Shen Jianguo2，Hu Fangping1（1. College of Plant Protection, Fujian Agricultural and Forestry University, Fuzhou350002, China;
2. Fujian Bureau of ExitEntry Inspection and Quarantine, Fuzhou350001, China）AbstractA padlock probe was designed based on the sequence of the unique hypothetic protein gene in the complete genome of Pseudomonas syringae pv. tomato (Pst), according to the design principle of padlock probe and primers. Detection system of hyperbranched rolling circle amplification (HRCA) was established and optimized. The results showed that Pst could be specifically detected by this method, while other reference plant pathogens could not be detected. The detection sensitivity of HRCA was about 500 fg/μL of DNA concentration, higher than that of the conventional PCR method.
Key wordsPseudomonas syringae pv. tomato;hyperbranched rolling circle amplification;padlock probe 番茄細菌性叶斑病（bacterial speck of tomato）是番茄上重要的病害之一，病原菌为Pseudomonas syringae pv. tomato (Okabe) Young ，Dye ＆ Wilkie（Pst）。该病害最早于1933年在美国的布雷登顿市被发现，但因为这种病害很容易和其他细菌性病害混淆，致使在其他地方很少被报道，直到1977-1978年在霍姆斯特德地区大暴发之后才被重视［1］。该病菌仅危害番茄，可造成叶片斑点、坏死，导致植株生长不良而减产；在果实上危害形成瑕疵症状，影响番茄的感官品质而导致难以销售［2］。该病害因缺少典型的诊断鉴别症状极易和其他病害的症状混淆，另外，病原菌又可由种子携带，所以对该病害的快速诊断和病原菌的快速检测是植病工作者的研究内容之一。
传统的方法可用于诊断和鉴定P.syringae pv. tomato病原，但费力费时；用非放射性元素标记DNA探针可用于检测番茄植株上的叶斑病菌，但因菌株自身产生毒素，检测结果常受到影响［3］；Zaccardelli等［4］利用hrpZ基因特异性序列通过常规PCR方法来检测受感染的植株和幼苗，获得了一定的成功。但常规PCR的方法有一定的局限性，容易受污染形成假阳性结果，而且不能高通量检测病原物。自锁式探针被报道以来［5］，它以灵敏、特异、稳定等特点被广泛应用到分子检测中。锁式探针是由3′和5′端两段靶标序列和中间的一段对检测结果没有影响的连接序列构成的一种较长的单链寡核苷酸片段。其工作原理是当检测体系中存在靶标DNA时，锁式探针两端的靶标序列就会与靶标DNA完全互补配对，线型锁式探针在连接酶的作用下被有效地连接成环型，而在没有相应靶标DNA存在时锁式探针不被连接酶连接，仅以线性形式存在。在核酸外切酶的作用下，多余的线性锁式探针被消化水解，连接成环状的锁式探针在Bst DNA聚合酶和通用引物的作用下恒温扩增［6］，其扩增效率在1 h之内就可以达到109或更多拷贝［7］。锁式探针的恒温扩增具有极好的检测灵敏度、特异性和实用性，近几年已被广泛地应用于细胞原位检测、微生物、医学病原检测鉴定等领域［89］。40卷第2期王念武等：番茄细菌性叶斑病菌超分支滚环扩增快速检测技术2014Schopf 等［10］通过琼脂糖珠表面修饰扩增引物，然后进行滚环扩增，并通过荧光探针检测，DNA检测限达到1 amol；Su等［11］利用一种高灵敏的磁珠电化学发光方法，结合滚环扩增技术来分析单链核苷酸多态性，结果可以将1/100 000突变型样品从野生型中区分开；Li等［12］利用纳米技术结合滚环扩增技术，通过金纳米粒子探针与酶消化的滚环扩增产物杂交，实现用肉眼比较颜色来进行检测；Cheng等［13］在双抗体免疫夹心的基础上建立了免疫滚环扩增方法，通过在引物5′ 端标记生物素，实现探针与扩增产物原位杂交检测；Yan等［14］利用了纳米金能够同时结合蛋白和核酸的特性，将用于RCA反应的DNA引物和抗体通过纳米金连接起来，形成一个更强信号的扩增反应，其灵敏度可达到5 amol/L，比传统的ELISA方法扩大5个数量级；郭艳玲等［15］用超分支滚环扩增技术对60例肺结核病人、38例非结核对照组和20例健康人的痰标本进行检测，灵敏度达740 amol/L，检测菌悬液的灵敏度达200 cfu/mL；在植物病原检测中，Szemes等［6］设计了11种锁式探针，采用锁式探针与微阵列相结合的方法，对11种植物病原物(真菌和线虫)进行分析，建立了特异性强、灵敏度高的检测技术体系，黄冠军［16］等据柑橘溃疡病菌(Xanthomonas axonopodis pv．citri)独有的蛋白基因序列设计特异性锁式探针进行滚环扩增，建立了柑橘溃疡病菌滚环扩增检测技术体系。本研究旨在依据番茄细菌性叶斑病菌独有的蛋白基因序列，设计特异的锁式探针及其扩增引物，建立特异、灵敏的番茄细菌性叶斑病菌超分支滚环扩增（HRCA）检测技术，为我国的口岸把关，也为番茄细菌性叶斑病菌的疫情动态监测提供新的分子检测技术。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1供试菌株
番茄溃疡病菌［Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis （Smith）Davis et al.］，由福建省农业科学院作物研究所邱思鑫提供；番茄细菌性叶斑病菌（Pseudomonas syringae pv. tomato）、番茄青枯病菌［Ralstonia solanacearum(Smith) Yabuuchi et al. ］、西瓜细菌性果斑病菌（Acidovorax avenae subsp. citrulli Willems et al.）、水稻细菌性条斑病菌［Xanthomonas oryzae pv. oryzicola (Fang et al.) Swing et al. ］、杨桃细菌性斑点病菌［P.syringae pv. averrhoii(van Hall) Bergey］、柑橘溃疡病菌［Xanthomonas citri (Hasse) Dawson］、枯草芽胞杆菌［ Bacillus subtilis (Ehrenberg) Cohn］、香蕉枯萎病菌［Fusarium oxysporum f.sp. cubense (E.F.Smith) W.C. Snyd.