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摘要 [目的]对北方黄酒麦曲中真菌的5.8S rDNA.ITS序列进行PCR扩增、测序以鉴定其中的真菌。[方法]利用梯度稀释法和划线纯化法共分离纯化得到5株霉菌和1株酵母，并对分离得到的真菌进行基因组DNA提取获得模板，用特异性引物进行PCR扩增，得到真菌的5.8SrDNA.ITS片段，片段测序后进行Blast比对鉴定，构建系统发育树。[结果]将5株霉菌鉴定为多枝横梗霉（Lichtheimia ramosa），米曲霉（Aspergillus oryzae），产紫青霉（Penicillium purpurogenum），杂色曲霉（Aspergillus versicolor），交链孢霉（Alternaria mali），将一株酵母鉴定为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。[结论] 利用分子生物学的方法对北方黄酒麦曲样品中的真菌进行了分离、纯化和鉴定。
关键词 北方黄酒；麦曲；真菌；5.8SrDNA.ITS序列
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）17-015-02
Abstract [Objective] 5.8S rDNA.ITS fragments of fungi in the wheat starter from north yellow millet wine were amplified and sequenced in order to identify the fungi. [Method] Five strains of moulds and one yeast strain were separated and purified by gradient dilution method and crossed purification. The genomic DNA of fungi cells were extracted as the PCR template， and 5.8SrDNA.ITS fragments of fungi were amplified and sequenced respectively for blasting identify and phylogenetic tree construction. [Result]The moulds were identified as Lichtheimia ramosa， Aspergillus oryzae， Penicillium purpurogenum， Aspergillus versicolor， Alternaria mali，and one yeast strain was identified as Saccharomyces cerevisiae. [Conclusion] Fungi in the wheat starter from north yellow millet wine were separated， purificated and identificated.
Key words North yellow millet wine； Wheat starter； Fungi； 5.8SrDNA.ITS sequence
黄酒具有几千年的历史，北方黄酒麦曲是将小麦进行过筛、轧碎、加水拌曲、踏曲、曲房堆曲、保温培养、通风干燥、陈伏后制成[1]，是黄酒的糖化发酵粗酶制剂。麦曲中的微生物主要有霉菌、细菌及少量酵母，麦曲中的微生物参与黄酒的酿造过程，微生物及其代谢产物对黄酒的风味和口感具有十分重要的影响[2]。因此，对黄酒麦曲中微生物进行分类鉴定以及特性研究可以为黄酒的酿造提供理论依据，对于继承和保护北方黄酒的传统酿造工艺和口味具有积极的作用。
真菌核糖体基因转录间隔区，又叫内转录间隔区，是位于真菌核糖体DNA（rDNA）上18S和28S基因之间的区域片段，由ITS1区、5.8 S rDNA和ITS2区组成[3-4]。5.8 S rDNA-ITS序列有极大的保守性，具有显著的种间差异性，在大多数真核生物中表现出极为广泛的序列多态性。ITS适合于真菌物种的分子鉴定以及属内物种间或种内差异较明显的菌群间的系统发育关系分析[5]。此外ITS序列片段较小、易于分析。笔者对北方黄酒麦曲中真菌的5.8S rDNA.ITS序列进行了PCR扩增、测序以鉴定其中的真菌。
1 材料与方法
1.1 材料
试验所用的麦曲由山东即墨妙府老酒有限公司提供。
1.2 培养基的配制
YPD培养基：酵母提取物10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，加入蒸馏水，调节pH至7.5，定容至1 L，115 ℃ 下灭菌30 min。
麦汁培养基：10度麦汁 1 L，琼脂 20 g，115 ℃下灭菌30 min。
察氏培养基：硝酸钠3 g，磷酸氢二钾1 g，硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.5 g，氯化钾0.5 g，硫酸亚铁0.01 g，蔗糖30 g，琼脂20 g，加入蒸馏水定容至1 L，0.1 MPa下灭菌20 min。
在灭菌后的培养基中添加50 mg/L的链霉素，抑制细菌生长；加入100 mg/L的去氧胆酸钠，抑制菌丝蔓延。
1.3 方法
1.3.1 麦曲浸出液的制备。
将粉碎好的麦曲20 g加入100 ml 0.9%的无菌生理盐水中，加入玻璃珠放入摇床振荡培养30 min，使麦曲中的微生物均匀地分散于无菌生理盐水中，制成麦曲浸出液。
1.3.2 真菌的分离纯化。
将麦曲浸出液稀释至10-1，10-2，10-3，10-4，10-5倍，并分别涂布于麦汁培养基和察氏培养基上，每个稀释倍数分别平行涂布3个平板，于28 ℃恒温培养箱中倒置培养48 h。挑取平板中肉眼可见的单菌落进行平板划线，转接划线直至得到单菌落，之后进行镜检，确定是单一菌后，用YPD斜面进行保种，放入4 ℃冰箱中保存备用。 1.3.3 真菌的形态学观察。
取分离得到的真菌菌株接种至YPD培养基，恒温培养箱28 ℃培养48 h，观察菌落的颜色、形态等菌落特征。
1.3.4 真菌的分子学鉴定。
利用石英砂法提取真菌DNA。采用通用引物 pITS1（5′.TCCGTAGGTGAACCTGCCG.3′）和 pITS4（5′. TCCTCCGCTTATTGATATGC.3′）扩增真菌的 ITS 序列[3]。
25 μl 反应体系：18.35 μl ddH2O、2.5 μl 10×PCR Buffer、2 μl 4×dNTP、0.15 μl Taq 酶，0.5 μl pITS1、0.5 μl pITS4、1 μl模板。 扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环，然后72 ℃延伸10 min，-20 ℃保存备用。PCR 反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。
使用DNA胶回收试剂盒进行回收纯化，纯化后的PCR产物克隆至pMD18.T载体上，连接后转化至TOP10感受态细胞中[5]，筛选阳性克隆送至上海生工生物有限公司进行测序。登陆NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast），将测得的试验菌株序列在NCBI 的Genbank 中进行Blast分析，选取相似性较高的模式菌株的5.8S rDNA.ITS序列，与试验菌株序列一起经Clustal X 软件进行匹配后，用Mega 3.1 软件进行分子系统学分析并构建系统发育树。
2 结果与分析
2.1 真菌的形态学观察
共从麦曲浸出液中分离出6株霉菌和1株酵母，真菌依次编号为WSM.1、WSM.2、WSM.3、WSM.4、WSM.5和WTY。其形态学鉴定结果见表1。
2.2 真菌的分子鉴定
所测5.8S rDNA.ITS序列提交GenBank进行Blast比对，对霉菌进行鉴定。同源性分析（表2）显示这6种霉菌片段大小在571～859 bp。由试验菌株和相关模式菌株所构建的系统发育树（图1）可以看出，25株菌株处于四大分支上。WSM.2与米曲霉（Aspergillus oryzae）和黄曲霉（Aspergillus flavus）聚为一支，且与米曲霉（A.oryzae）相似度为99%；WSM.4与聚多曲霉（Aspergillus sydowii）和杂色曲霉（Aspergillus versicolor）聚为一支，且与杂色曲霉（A.versicolor）相似度为100%；WSM.3与朱黄青霉（Penicillium minioluteum）和产紫青霉（Penicillium purpurogenum）聚为一支，且与产紫青霉（P.purpurogenum）相似度为99%；WSM.5与交链孢霉（Alternaria mali）聚为一支，相似度为100%；WSM.1与多枝横梗霉（Lichtheimia ramosa）聚为一支，且相似度为99%。故WSM.1、WSM.2、WSM.3、WSM.4、WSM.5分别被鉴定为多枝横梗霉（L.ramosa）、米曲霉（A.oryzae）、产紫青霉（P.purpurogenum）、杂色曲霉（A.versicolor）、交链孢霉（A.mali）。
由酵母和相关模式菌株所构建的系统发育树（图2）可以看出，WTY与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）亲缘关系相近，可将其鉴定为酿酒酵母（S.cerevisiae）。
3 结论与讨论
该研究对北方黄酒麦曲样品中的真菌进行了分离纯化，共得到5株霉菌和1株酵母，利用分子生物学方法将5株霉菌鉴定为多枝横梗霉（L.ramosa）、米曲霉（A.oryzae）、产紫青霉（P.purpurogenum）、杂色曲霉（A.versicolor）、交链孢霉（A.mali）。将一株酵母鉴定为酿酒酵母（S.cerevisiae）。
方华等[6]采用土豆琼脂培养基、麦汁琼脂培养基和察氏培养基对绍兴黄酒麦曲中的真菌进行了分离、培养和鉴定，共分离出 16 株霉菌，其主要霉菌分别是微小毛霉、伞枝犁头霉、米曲霉、米根霉和烟曲霉。与该研究相比，北方黄酒麦曲中的霉菌与绍兴黄酒麦曲中都有米曲霉的存在，但多枝横梗霉、产紫青霉、杂色曲霉、交链孢霉是北方黄酒麦曲所特有的。
参考文献
[1] 陈细丹.黄酒生麦曲的传统制作工艺[J].酿酒，2011，38（1）：59-60.
[2] 汪建国.传统麦曲在黄酒酿造中的作用和特色[J].中国酿造，2004（10）：29-31.
[3] 赵杰.ITS序列分析及其在植物真菌病害分子检测中的应用[J].陕西农业科学，2004（4）：35-37.
[4] BELLOCH C，BARRIO E，URUBURU F，et al.Characterization of four species of the genus Kluyveromyces by mitochondrial DNA restriction analysis[J].Syst Appl Microbiol，1997，20：397-408.
[5] 郑雪松，杨虹，李道棠，等.基因间隔序列（ITS）在细菌分类鉴定和种群分析中的应用[J].应用与环境生物学报，2003，9（6）：678-684.
[6] 方华，曹钰，陆健，等.黄酒麦曲中主要霉菌的分子鉴定及分类[J].酿酒科技，2006，3（14）：45-47.
关键词 北方黄酒；麦曲；真菌；5.8SrDNA.ITS序列
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）17-015-02
Abstract [Objective] 5.8S rDNA.ITS fragments of fungi in the wheat starter from north yellow millet wine were amplified and sequenced in order to identify the fungi. [Method] Five strains of moulds and one yeast strain were separated and purified by gradient dilution method and crossed purification. The genomic DNA of fungi cells were extracted as the PCR template， and 5.8SrDNA.ITS fragments of fungi were amplified and sequenced respectively for blasting identify and phylogenetic tree construction. [Result]The moulds were identified as Lichtheimia ramosa， Aspergillus oryzae， Penicillium purpurogenum， Aspergillus versicolor， Alternaria mali，and one yeast strain was identified as Saccharomyces cerevisiae. [Conclusion] Fungi in the wheat starter from north yellow millet wine were separated， purificated and identificated.
Key words North yellow millet wine； Wheat starter； Fungi； 5.8SrDNA.ITS sequence
黄酒具有几千年的历史，北方黄酒麦曲是将小麦进行过筛、轧碎、加水拌曲、踏曲、曲房堆曲、保温培养、通风干燥、陈伏后制成[1]，是黄酒的糖化发酵粗酶制剂。麦曲中的微生物主要有霉菌、细菌及少量酵母，麦曲中的微生物参与黄酒的酿造过程，微生物及其代谢产物对黄酒的风味和口感具有十分重要的影响[2]。因此，对黄酒麦曲中微生物进行分类鉴定以及特性研究可以为黄酒的酿造提供理论依据，对于继承和保护北方黄酒的传统酿造工艺和口味具有积极的作用。
真菌核糖体基因转录间隔区，又叫内转录间隔区，是位于真菌核糖体DNA（rDNA）上18S和28S基因之间的区域片段，由ITS1区、5.8 S rDNA和ITS2区组成[3-4]。5.8 S rDNA-ITS序列有极大的保守性，具有显著的种间差异性，在大多数真核生物中表现出极为广泛的序列多态性。ITS适合于真菌物种的分子鉴定以及属内物种间或种内差异较明显的菌群间的系统发育关系分析[5]。此外ITS序列片段较小、易于分析。笔者对北方黄酒麦曲中真菌的5.8S rDNA.ITS序列进行了PCR扩增、测序以鉴定其中的真菌。
1 材料与方法
1.1 材料
试验所用的麦曲由山东即墨妙府老酒有限公司提供。
1.2 培养基的配制
YPD培养基：酵母提取物10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，加入蒸馏水，调节pH至7.5，定容至1 L，115 ℃ 下灭菌30 min。
麦汁培养基：10度麦汁 1 L，琼脂 20 g，115 ℃下灭菌30 min。
察氏培养基：硝酸钠3 g，磷酸氢二钾1 g，硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.5 g，氯化钾0.5 g，硫酸亚铁0.01 g，蔗糖30 g，琼脂20 g，加入蒸馏水定容至1 L，0.1 MPa下灭菌20 min。
在灭菌后的培养基中添加50 mg/L的链霉素，抑制细菌生长；加入100 mg/L的去氧胆酸钠，抑制菌丝蔓延。
1.3 方法
1.3.1 麦曲浸出液的制备。
将粉碎好的麦曲20 g加入100 ml 0.9%的无菌生理盐水中，加入玻璃珠放入摇床振荡培养30 min，使麦曲中的微生物均匀地分散于无菌生理盐水中，制成麦曲浸出液。
1.3.2 真菌的分离纯化。
将麦曲浸出液稀释至10-1，10-2，10-3，10-4，10-5倍，并分别涂布于麦汁培养基和察氏培养基上，每个稀释倍数分别平行涂布3个平板，于28 ℃恒温培养箱中倒置培养48 h。挑取平板中肉眼可见的单菌落进行平板划线，转接划线直至得到单菌落，之后进行镜检，确定是单一菌后，用YPD斜面进行保种，放入4 ℃冰箱中保存备用。 1.3.3 真菌的形态学观察。
取分离得到的真菌菌株接种至YPD培养基，恒温培养箱28 ℃培养48 h，观察菌落的颜色、形态等菌落特征。
1.3.4 真菌的分子学鉴定。
利用石英砂法提取真菌DNA。采用通用引物 pITS1（5′.TCCGTAGGTGAACCTGCCG.3′）和 pITS4（5′. TCCTCCGCTTATTGATATGC.3′）扩增真菌的 ITS 序列[3]。
25 μl 反应体系：18.35 μl ddH2O、2.5 μl 10×PCR Buffer、2 μl 4×dNTP、0.15 μl Taq 酶，0.5 μl pITS1、0.5 μl pITS4、1 μl模板。 扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环，然后72 ℃延伸10 min，-20 ℃保存备用。PCR 反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。
使用DNA胶回收试剂盒进行回收纯化，纯化后的PCR产物克隆至pMD18.T载体上，连接后转化至TOP10感受态细胞中[5]，筛选阳性克隆送至上海生工生物有限公司进行测序。登陆NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast），将测得的试验菌株序列在NCBI 的Genbank 中进行Blast分析，选取相似性较高的模式菌株的5.8S rDNA.ITS序列，与试验菌株序列一起经Clustal X 软件进行匹配后，用Mega 3.1 软件进行分子系统学分析并构建系统发育树。
2 结果与分析
2.1 真菌的形态学观察
共从麦曲浸出液中分离出6株霉菌和1株酵母，真菌依次编号为WSM.1、WSM.2、WSM.3、WSM.4、WSM.5和WTY。其形态学鉴定结果见表1。
2.2 真菌的分子鉴定
所测5.8S rDNA.ITS序列提交GenBank进行Blast比对，对霉菌进行鉴定。同源性分析（表2）显示这6种霉菌片段大小在571～859 bp。由试验菌株和相关模式菌株所构建的系统发育树（图1）可以看出，25株菌株处于四大分支上。WSM.2与米曲霉（Aspergillus oryzae）和黄曲霉（Aspergillus flavus）聚为一支，且与米曲霉（A.oryzae）相似度为99%；WSM.4与聚多曲霉（Aspergillus sydowii）和杂色曲霉（Aspergillus versicolor）聚为一支，且与杂色曲霉（A.versicolor）相似度为100%；WSM.3与朱黄青霉（Penicillium minioluteum）和产紫青霉（Penicillium purpurogenum）聚为一支，且与产紫青霉（P.purpurogenum）相似度为99%；WSM.5与交链孢霉（Alternaria mali）聚为一支，相似度为100%；WSM.1与多枝横梗霉（Lichtheimia ramosa）聚为一支，且相似度为99%。故WSM.1、WSM.2、WSM.3、WSM.4、WSM.5分别被鉴定为多枝横梗霉（L.ramosa）、米曲霉（A.oryzae）、产紫青霉（P.purpurogenum）、杂色曲霉（A.versicolor）、交链孢霉（A.mali）。
由酵母和相关模式菌株所构建的系统发育树（图2）可以看出，WTY与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）亲缘关系相近，可将其鉴定为酿酒酵母（S.cerevisiae）。
3 结论与讨论
该研究对北方黄酒麦曲样品中的真菌进行了分离纯化，共得到5株霉菌和1株酵母，利用分子生物学方法将5株霉菌鉴定为多枝横梗霉（L.ramosa）、米曲霉（A.oryzae）、产紫青霉（P.purpurogenum）、杂色曲霉（A.versicolor）、交链孢霉（A.mali）。将一株酵母鉴定为酿酒酵母（S.cerevisiae）。
方华等[6]采用土豆琼脂培养基、麦汁琼脂培养基和察氏培养基对绍兴黄酒麦曲中的真菌进行了分离、培养和鉴定，共分离出 16 株霉菌，其主要霉菌分别是微小毛霉、伞枝犁头霉、米曲霉、米根霉和烟曲霉。与该研究相比，北方黄酒麦曲中的霉菌与绍兴黄酒麦曲中都有米曲霉的存在，但多枝横梗霉、产紫青霉、杂色曲霉、交链孢霉是北方黄酒麦曲所特有的。
参考文献
[1] 陈细丹.黄酒生麦曲的传统制作工艺[J].酿酒，2011，38（1）：59-60.
[2] 汪建国.传统麦曲在黄酒酿造中的作用和特色[J].中国酿造，2004（10）：29-31.
[3] 赵杰.ITS序列分析及其在植物真菌病害分子检测中的应用[J].陕西农业科学，2004（4）：35-37.
[4] BELLOCH C，BARRIO E，URUBURU F，et al.Characterization of four species of the genus Kluyveromyces by mitochondrial DNA restriction analysis[J].Syst Appl Microbiol，1997，20：397-408.
[5] 郑雪松，杨虹，李道棠，等.基因间隔序列（ITS）在细菌分类鉴定和种群分析中的应用[J].应用与环境生物学报，2003，9（6）：678-684.
[6] 方华，曹钰，陆健，等.黄酒麦曲中主要霉菌的分子鉴定及分类[J].酿酒科技，2006，3（14）：45-47.