【摘 要】
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目的探讨mTOR信号通路在iPS定向分化RPE细胞中的调控机制。方法培养iPS细胞,悬浮培养后形成拟胚体EB,诱导分化为RPE细胞。通过免疫细胞化学的方法,观察iPS-RPE细胞分化一个月
【机 构】
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南京医科大学第一附属医院眼科实验室
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目的探讨mTOR信号通路在iPS定向分化RPE细胞中的调控机制。方法培养iPS细胞,悬浮培养后形成拟胚体EB,诱导分化为RPE细胞。通过免疫细胞化学的方法,观察iPS-RPE细胞分化一个月后特异性蛋白(RPE65、LRAT、zo-1)的表达。同时通过Q-PCR,Western Blotting的方法检测iPS-RPE在不同分化时间点(分化1个月、2个月、3个月)上,iPS-RPE细胞中特异性基因、蛋白的表达变化以及mTOR信号通路的活性。最后应用雷帕霉素抑制iPS-RPE细胞中mTOR的通路,进一步观察iPS-RPE细胞中的蛋白表达变化。Q-PCR采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)进行组间比较。结果荧光显微镜观察到iPS-RPE细胞在分化1个月时,表达RPE65、LRAT、zo-1蛋白。与对照组iPS比较,Q-PCR结果显示,实验组RPE65在分化1个月,2个月,3个月时的表达量分别为0.84±0.13,4.8±1.1,20.3±4.9(P=0.000);Best1分化1个月,2个月,3个月时的表达量分别为1.5±0.16,2.3±0.68,11.78±1.57(P=0.000);MerTK在分化1个月,2个月,3个月时的表达量分别为4.12±1.94,1.87±0.76,15.53±1.33(P=0.000),CK18分化1个月,2个月,3个月时的表达量分别为2.4±0.63,2.3±0.37,9.67±1.44(P=0.000),Western Blotting结果也表明,随着分化时间延长,iPS-RPE细胞中特异性蛋白(BEST1、catenin、MerTK)表达量有显著提高,而mTOR信号通路的活性受到抑制。与对照组(加DMSO)比较,雷帕霉素处理获得的iPS-RPE细胞中BEST1、MerTK、ck18蛋白表达量上升不是很明显,catenin蛋白显著提高。结论建立了体外高等分化、功能高效的iPS-RPE细胞,随iPS-RPE细胞分化时间延长,mTOR信号通路的活性是逐步抑制的。
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