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【摘 要】 目的：明确留兰香药材主要有效成分香芹酮的主要分布部位。方法：先采用薄层色谱法初步观察香芹酮在留兰香根茎叶中的含量差别，再采用气相色谱法定量测定留兰香药材不同部位中香芹酮的具体含量。结果：留兰香药材叶中香芹酮的含量最高，其次是茎，最后是根。结论：留兰香药材中香芹酮的主要分布部位为叶，根和茎中的含量很低。
【关键词】 留兰香;不同部位;香芹酮;薄层色谱法;气相色谱法
【中图分类号】R917【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2021）07-0017-05
Determination of Carvone of Spearmint by TLC Preliminarily and by GC Systematically
LUO Honglian WANHongcai LIU Xiaoyan XU Zuogang DUAN Ping REN Yongqi
Qiannan Food and Drug Inspection Institute， Duyun 558000，China
Abstract：Objective To identify the main distribution sites of varvone-a main effective composition in spearmint and to provide reliable basis for improve spearmint utilization efficiency. Methods The difference of carvone content in roots、stems and leaves of spearmint was preliminarily observed by TLC， and then the specific amount of carvone in different parts of spearmint was quantitatively determined by GC.Result The leaves of spearmint had the most content of carvone， followed by the stems and finally the roots.Conclusion The main distribution of carvone in spearmint is the leaves， and the content of carvone in the stems and the roots was very low.
Keywords：Spearmint; Different Parts; Carvone; Thit-layer Chromatography; Gas Chromatography
留蘭香（Mentha spicata L.）为唇形科薄荷属（Mentha Linn）植物，又名狗肉香，在我国贵州、云南、四川、新疆等地均有栽培，其味辛、甘，性微温，具有疏风解表、理气止痛、之功效。现代药理研究表明：留兰香具有抗菌、抗炎、抗病毒及抗氧化活性[1-4]，常用于治疗感冒发热、咳嗽、头痛、咽痛、跌打瘀痛、胃肠胀气、乌疔、鸡窝寒、全身麻木和小儿疮疖。留兰香味清新、凉爽、香甜，其嫩叶常做调味香料食用，其挥发油广泛应用于牙膏、口香糖、糖果、香皂等物品的加香[5]。根据文献报道香芹酮为留兰香挥发油的主要有效成分[6]，但其在全草中的含量分布情况尚不明确，为提高留兰香资源的利用效率，本实验采用气相色谱法（GC）及薄层色谱法对其根、茎、叶中的香芹酮含量差异进行比较。
1 仪器与试药
Aglient 7890B 气相色谱仪（美国Aglient公司），SK250LHC超声波清洗仪（上海科导仪器有限公司），AG135电子天平（梅特勒托利多）;香芹酮对照品（德国Dr.Ehrenstorfer GmbH 批号： 141713，含量：99.0%），正十一烷对照品（德国Dr.Ehrenstorfer GmbH批号：G169369，含量99.6%），其他试剂均为化学分析纯。10批次留兰香药材分别采集于都匀大坪（批号：201901）、都匀邦水（批号：201902）、开阳毛云（批号：201903）、独山麻万（批号：201904）、独山影山（批号：201905）、遵义桐梓（批号：201906）、都匀剑江河（批号：201907）、都匀洛邦（批号：201908）、威宁草海（批号：201909）、毕节清水（批号：201910），均经贵州省食品药品检验所李扬主任药师鉴定为留兰香药材。
2 方法与结果
2.1 留兰香根茎叶的薄层图谱 分别称取3批次留兰香药材（批号分别为：201901、201902、201903）根、茎、叶细粉3.0 g，加乙醇30 mL，水浴回流30 min，滤过，取续滤液2 mL作为供试品溶液。另取香芹酮对照品约10mg，置10ml量瓶中，用乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。吸取对照品溶液与供试品溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷：乙酸乙酯：甲酸（10∶1∶0.1）为展开剂，展开后，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，105℃加热至斑点显色清晰。3个批次的留兰香叶供试品溶液色谱中，在与香芹酮对照品色谱相应的位置上显相同颜色斑点，在茎与根的供试品溶液色谱中，几乎看不见与香芹酮对应的斑点。色谱图如图1所示。
2.2 留兰香根茎叶中的香芹酮GC含量测定
2.2.1 内标溶液的制备 取正十一烷对照品适量，精密称定，用正己烷稀释制成正十一烷浓度为0.2 mg/mL的溶液，作为内标溶液。
2.2.2 对照品溶液的制备 取香芹酮对照品适量，用内标溶液稀释制成香芹酮浓度约为0.2 mg/mL的溶液，作为对照品溶液。 2.2.3 供试品溶液的制备 取留兰香粉末约0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入10 mL内标溶液，加塞，超声30 min，放冷至室温，用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。
2.2.4 色譜条件及系统适用性试验 色谱柱HP-5弹性石英毛细管柱（30 m×0.32 mm×0.25μm）;检测器氢火焰离子化检测器;程序升温条件初始温度50 ℃，以2 ℃ /min 升温至 115 ℃，以 5 ℃ /min 升温至 150 ℃ ;气化室温度 250 ℃ ;检测室温度 280 ℃;尾吹 20 mL;空气 400 mL;氢气 40 mL;进样量 1 μL。在上述试验条件下，样品中的香芹酮、内标正十一烷与其他各杂质峰的分离度达到要求且峰形良好，符合《中华人民共和国药典》2015年版 四部通则0513气相色谱法项下的规定。
2.2.5 线性试验 精密称取32 mg香芹酮对照品置10 mL量瓶中，用内标溶液溶解并稀释制成3.2 mg/mL的溶液，作为对照品贮备液，精密量取对照品贮备液适量，用内标溶液逐级稀释制成浓度分别为1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05 mg/mL的对照品溶液。分别精密吸取1μL按2.2.4色谱条件测定，记录色谱图。以香芹酮对照品溶液与内标溶液峰面积之比为纵坐标（Y），以香芹酮对照品质量浓度 C（mg/mL） 为横坐标（X）绘制标准曲线，并进行线性回归，得到香芹酮的回归方程：Y=0.848X -0.0119（R=0.9998），即香芹酮质量浓度在 0.05 ～ 3.2 mg/mL间呈良好的线性关系。见表1、图5。
2.2.6 精密度试验 取同一对照品溶液重复进样6次，考察系统的精密度。香芹酮峰面积与内标峰面积之比的RSD为0.04%，符合《中华人民共和国药典》2015 年版四部通则9101药品质量标准分析方法验证指导原则中对精密度的要求（RSD≤2%）。见表2。
2.2.7 稳定性试验 分别于0、2、4、6、8、10 h精密吸取供试品溶液1μL按2.2.4色谱条件测定，记录色谱图。香芹酮峰面积与内标峰面积之比的RSD为0、06%，表明此条件下香芹酮在10 h内稳定。见表3。
2.2.8 重复性试验 平行取批号为201902的留兰香药材叶粉末样品6份，按上述方法制备供试品溶液及对照品溶液，按2.2.4色谱条件测定，记录色谱图，按内标法以峰面积计算，6份样品中香芹酮百分含量之间的RSD为1.88%。见表4。
2.2.9 回收试验 精密称取香芹酮对照品25 mg，用内标溶液稀释制成2.5 mg/mL的对照品贮备液。分别精密吸取对照品贮备液1 mL、2 mL、3 mL置50 mL量瓶中，用内标溶液稀释制成香芹酮浓度分别为0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.15 mg/mL的溶液，分别作a、b、c溶液。取9份已知香芹酮含量的留兰香叶粉末（香芹酮含量为0.384%，见表4）约0.25g，精密称定，分别置9个具塞锥形瓶中，每三份分别精密加入a、b、c溶液10 mL，加塞，超声30 min，放冷至室温，用0.45μm微孔滤膜过滤，分别精密吸取1μL按2.2.4色谱条件测定，记录色谱图，考察系统的回收率。平均回收率为96.5%，RSD%为1.3%，符合《中华人民共和国药典》2015 年版四部通则9101药品质量标准分析方法验证指导原则中对回收率的要求。见表5。
2.2.10 留兰香根茎叶中香芹酮含量的测定结果 取10个不同批次留兰香样品，按上述方法制备供试品溶液及对照品溶液，各精密吸取1μL按2.4色谱条件测定，记录色谱图，按内标法以峰面积计算，测定结果见表6。
3 讨论
本试验首先选用合适的薄层色谱法[7]，对不同批次留兰香根、茎、叶中的香芹酮含量进行测定，由图1可见，3个批次的留兰香叶供试品溶液色谱中，在与香芹酮对照品色谱相应的位置上显相同斑点，在茎与根的供试品溶液色谱中，几乎看不见与香芹酮对应的斑点，表明留兰香叶中香芹酮的含量较高，能在薄层图谱中显清晰斑点，而茎根中香芹酮的含量很低以致此薄层色谱方法未能鉴别出。为进一步确定根茎叶中香芹酮的含量，经查阅文献，本试验选用上述气相色谱条件[8]，建立留兰香药材中香芹酮的GC含量测定方法，并对此方法进行方法学考察，确定该方法准确、可靠。测定结果表明，留兰香药材不同部位中的香芹酮含量差异显著，含量高低为：叶>茎>根。此次研究明确了留兰香药材中香芹酮的主要分布部位，为其药用部位的选择提供实验数据依据，以提高留兰香资源的利用效率。
参考文献
[1]
韩卫丽，崔保安，张红英.留兰香提取物体外抗菌作用初步研究[J].中国农学通报，2010，26（1）：1-4.
[2]赵春贞，王砚，唐法娣.留兰香油对大鼠慢性阻塞性肺疾病模型组织炎症氧化改变和Nrf2蛋白表达的影响[J].浙江大学学报：医学版， 2008，37（4）：357-363.
[3]韩卫丽，崔保安，张红英，等.留兰香提取物体外抗猪细小病毒的作用[J].江苏农业学报，2011（3）：556-560.
[4]班斓，孙雁，黄生树.留兰香提取物延缓牛奶氧化的研究[J].中国食品添加剂，2016（4）：139-149.
[5]王同军.留兰香的加工和利用技术[J].科学种养，2014（3）：59.
[6]陈静威，吴振，闫鹏飞.留兰香挥发油化学成分的研究[J].哈尔滨商业大学学报，2003（1）：72-75.
[7]万红才，徐作刚，刘晓艳，等.留兰香质量标准探讨[J].中国药业，2019（4）：20-22.
[8]康艳蕾，苏璇，唐法娣.留兰香油主要成分香芹酮和柠檬烯的GC含量测定及薄层鉴别[J].中华中医药学刊，2014（3）：661-664.
（收稿日期：2020-09-14 编辑：程鹏飞）
【关键词】 留兰香;不同部位;香芹酮;薄层色谱法;气相色谱法
【中图分类号】R917【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2021）07-0017-05
Determination of Carvone of Spearmint by TLC Preliminarily and by GC Systematically
LUO Honglian WANHongcai LIU Xiaoyan XU Zuogang DUAN Ping REN Yongqi
Qiannan Food and Drug Inspection Institute， Duyun 558000，China
Abstract：Objective To identify the main distribution sites of varvone-a main effective composition in spearmint and to provide reliable basis for improve spearmint utilization efficiency. Methods The difference of carvone content in roots、stems and leaves of spearmint was preliminarily observed by TLC， and then the specific amount of carvone in different parts of spearmint was quantitatively determined by GC.Result The leaves of spearmint had the most content of carvone， followed by the stems and finally the roots.Conclusion The main distribution of carvone in spearmint is the leaves， and the content of carvone in the stems and the roots was very low.
Keywords：Spearmint; Different Parts; Carvone; Thit-layer Chromatography; Gas Chromatography
留蘭香（Mentha spicata L.）为唇形科薄荷属（Mentha Linn）植物，又名狗肉香，在我国贵州、云南、四川、新疆等地均有栽培，其味辛、甘，性微温，具有疏风解表、理气止痛、之功效。现代药理研究表明：留兰香具有抗菌、抗炎、抗病毒及抗氧化活性[1-4]，常用于治疗感冒发热、咳嗽、头痛、咽痛、跌打瘀痛、胃肠胀气、乌疔、鸡窝寒、全身麻木和小儿疮疖。留兰香味清新、凉爽、香甜，其嫩叶常做调味香料食用，其挥发油广泛应用于牙膏、口香糖、糖果、香皂等物品的加香[5]。根据文献报道香芹酮为留兰香挥发油的主要有效成分[6]，但其在全草中的含量分布情况尚不明确，为提高留兰香资源的利用效率，本实验采用气相色谱法（GC）及薄层色谱法对其根、茎、叶中的香芹酮含量差异进行比较。
1 仪器与试药
Aglient 7890B 气相色谱仪（美国Aglient公司），SK250LHC超声波清洗仪（上海科导仪器有限公司），AG135电子天平（梅特勒托利多）;香芹酮对照品（德国Dr.Ehrenstorfer GmbH 批号： 141713，含量：99.0%），正十一烷对照品（德国Dr.Ehrenstorfer GmbH批号：G169369，含量99.6%），其他试剂均为化学分析纯。10批次留兰香药材分别采集于都匀大坪（批号：201901）、都匀邦水（批号：201902）、开阳毛云（批号：201903）、独山麻万（批号：201904）、独山影山（批号：201905）、遵义桐梓（批号：201906）、都匀剑江河（批号：201907）、都匀洛邦（批号：201908）、威宁草海（批号：201909）、毕节清水（批号：201910），均经贵州省食品药品检验所李扬主任药师鉴定为留兰香药材。
2 方法与结果
2.1 留兰香根茎叶的薄层图谱 分别称取3批次留兰香药材（批号分别为：201901、201902、201903）根、茎、叶细粉3.0 g，加乙醇30 mL，水浴回流30 min，滤过，取续滤液2 mL作为供试品溶液。另取香芹酮对照品约10mg，置10ml量瓶中，用乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。吸取对照品溶液与供试品溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷：乙酸乙酯：甲酸（10∶1∶0.1）为展开剂，展开后，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，105℃加热至斑点显色清晰。3个批次的留兰香叶供试品溶液色谱中，在与香芹酮对照品色谱相应的位置上显相同颜色斑点，在茎与根的供试品溶液色谱中，几乎看不见与香芹酮对应的斑点。色谱图如图1所示。
2.2 留兰香根茎叶中的香芹酮GC含量测定
2.2.1 内标溶液的制备 取正十一烷对照品适量，精密称定，用正己烷稀释制成正十一烷浓度为0.2 mg/mL的溶液，作为内标溶液。
2.2.2 对照品溶液的制备 取香芹酮对照品适量，用内标溶液稀释制成香芹酮浓度约为0.2 mg/mL的溶液，作为对照品溶液。 2.2.3 供试品溶液的制备 取留兰香粉末约0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入10 mL内标溶液，加塞，超声30 min，放冷至室温，用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。
2.2.4 色譜条件及系统适用性试验 色谱柱HP-5弹性石英毛细管柱（30 m×0.32 mm×0.25μm）;检测器氢火焰离子化检测器;程序升温条件初始温度50 ℃，以2 ℃ /min 升温至 115 ℃，以 5 ℃ /min 升温至 150 ℃ ;气化室温度 250 ℃ ;检测室温度 280 ℃;尾吹 20 mL;空气 400 mL;氢气 40 mL;进样量 1 μL。在上述试验条件下，样品中的香芹酮、内标正十一烷与其他各杂质峰的分离度达到要求且峰形良好，符合《中华人民共和国药典》2015年版 四部通则0513气相色谱法项下的规定。
2.2.5 线性试验 精密称取32 mg香芹酮对照品置10 mL量瓶中，用内标溶液溶解并稀释制成3.2 mg/mL的溶液，作为对照品贮备液，精密量取对照品贮备液适量，用内标溶液逐级稀释制成浓度分别为1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05 mg/mL的对照品溶液。分别精密吸取1μL按2.2.4色谱条件测定，记录色谱图。以香芹酮对照品溶液与内标溶液峰面积之比为纵坐标（Y），以香芹酮对照品质量浓度 C（mg/mL） 为横坐标（X）绘制标准曲线，并进行线性回归，得到香芹酮的回归方程：Y=0.848X -0.0119（R=0.9998），即香芹酮质量浓度在 0.05 ～ 3.2 mg/mL间呈良好的线性关系。见表1、图5。
2.2.6 精密度试验 取同一对照品溶液重复进样6次，考察系统的精密度。香芹酮峰面积与内标峰面积之比的RSD为0.04%，符合《中华人民共和国药典》2015 年版四部通则9101药品质量标准分析方法验证指导原则中对精密度的要求（RSD≤2%）。见表2。
2.2.7 稳定性试验 分别于0、2、4、6、8、10 h精密吸取供试品溶液1μL按2.2.4色谱条件测定，记录色谱图。香芹酮峰面积与内标峰面积之比的RSD为0、06%，表明此条件下香芹酮在10 h内稳定。见表3。
2.2.8 重复性试验 平行取批号为201902的留兰香药材叶粉末样品6份，按上述方法制备供试品溶液及对照品溶液，按2.2.4色谱条件测定，记录色谱图，按内标法以峰面积计算，6份样品中香芹酮百分含量之间的RSD为1.88%。见表4。
2.2.9 回收试验 精密称取香芹酮对照品25 mg，用内标溶液稀释制成2.5 mg/mL的对照品贮备液。分别精密吸取对照品贮备液1 mL、2 mL、3 mL置50 mL量瓶中，用内标溶液稀释制成香芹酮浓度分别为0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.15 mg/mL的溶液，分别作a、b、c溶液。取9份已知香芹酮含量的留兰香叶粉末（香芹酮含量为0.384%，见表4）约0.25g，精密称定，分别置9个具塞锥形瓶中，每三份分别精密加入a、b、c溶液10 mL，加塞，超声30 min，放冷至室温，用0.45μm微孔滤膜过滤，分别精密吸取1μL按2.2.4色谱条件测定，记录色谱图，考察系统的回收率。平均回收率为96.5%，RSD%为1.3%，符合《中华人民共和国药典》2015 年版四部通则9101药品质量标准分析方法验证指导原则中对回收率的要求。见表5。
2.2.10 留兰香根茎叶中香芹酮含量的测定结果 取10个不同批次留兰香样品，按上述方法制备供试品溶液及对照品溶液，各精密吸取1μL按2.4色谱条件测定，记录色谱图，按内标法以峰面积计算，测定结果见表6。
3 讨论
本试验首先选用合适的薄层色谱法[7]，对不同批次留兰香根、茎、叶中的香芹酮含量进行测定，由图1可见，3个批次的留兰香叶供试品溶液色谱中，在与香芹酮对照品色谱相应的位置上显相同斑点，在茎与根的供试品溶液色谱中，几乎看不见与香芹酮对应的斑点，表明留兰香叶中香芹酮的含量较高，能在薄层图谱中显清晰斑点，而茎根中香芹酮的含量很低以致此薄层色谱方法未能鉴别出。为进一步确定根茎叶中香芹酮的含量，经查阅文献，本试验选用上述气相色谱条件[8]，建立留兰香药材中香芹酮的GC含量测定方法，并对此方法进行方法学考察，确定该方法准确、可靠。测定结果表明，留兰香药材不同部位中的香芹酮含量差异显著，含量高低为：叶>茎>根。此次研究明确了留兰香药材中香芹酮的主要分布部位，为其药用部位的选择提供实验数据依据，以提高留兰香资源的利用效率。
参考文献
[1]
韩卫丽，崔保安，张红英.留兰香提取物体外抗菌作用初步研究[J].中国农学通报，2010，26（1）：1-4.
[2]赵春贞，王砚，唐法娣.留兰香油对大鼠慢性阻塞性肺疾病模型组织炎症氧化改变和Nrf2蛋白表达的影响[J].浙江大学学报：医学版， 2008，37（4）：357-363.
[3]韩卫丽，崔保安，张红英，等.留兰香提取物体外抗猪细小病毒的作用[J].江苏农业学报，2011（3）：556-560.
[4]班斓，孙雁，黄生树.留兰香提取物延缓牛奶氧化的研究[J].中国食品添加剂，2016（4）：139-149.
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[6]陈静威，吴振，闫鹏飞.留兰香挥发油化学成分的研究[J].哈尔滨商业大学学报，2003（1）：72-75.
[7]万红才，徐作刚，刘晓艳，等.留兰香质量标准探讨[J].中国药业，2019（4）：20-22.
[8]康艳蕾，苏璇，唐法娣.留兰香油主要成分香芹酮和柠檬烯的GC含量测定及薄层鉴别[J].中华中医药学刊，2014（3）：661-664.
（收稿日期：2020-09-14 编辑：程鹏飞）