【摘 要】
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目的 构建大鼠骨桥蛋白(OPN)基因的shRNA慢病毒表达载体,并观察其对大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)增殖和凋亡的影响.方法 针对OPN基因的不同部位设计3对shRNA的寡核苷酸片段,克隆到慢病毒载体PLKO.1中,构建靶向OPN基因的慢病毒载体PLKO.1-OPN-shRNA,检测并筛选最佳抑制效率的shRNA干扰载体.并将其转染大鼠血管平滑肌细胞,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测V
【机 构】
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目的 构建大鼠骨桥蛋白(OPN)基因的shRNA慢病毒表达载体,并观察其对大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)增殖和凋亡的影响.方法 针对OPN基因的不同部位设计3对shRNA的寡核苷酸片段,克隆到慢病毒载体PLKO.1中,构建靶向OPN基因的慢病毒载体PLKO.1-OPN-shRNA,检测并筛选最佳抑制效率的shRNA干扰载体.并将其转染大鼠血管平滑肌细胞,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测VSMCs OPN mRNA表达水平；蛋白免疫印迹法(Western blot)检测VSMC OPN蛋白表达水平；噻唑蓝(MTT)比色法和流式细胞仪检测沉默OPN基因后对VSMC增殖和凋亡能力的影响.结果 靶向OPN慢病毒表达载体构建成功.重组慢病毒载体PLKO.1-OPN-shRNA转染后可显著抑制VSMCs的OPN mRNA及蛋白的表达水平,OPN蛋白表达明显下降,其中以PLKO.1-OPN2-shRNA最为明显,达到90％以上；转染PLKO.1-OPN2-shRNA后72 h的细胞增殖能力[吸光度(A)值=0.365 ±0.011]明显低于未处理组(A值=0.941±0.028)和阴性对照组细胞(A值=0.941±0.040,P＜0.05)；而早期细胞凋亡率(20.44±2.69)％和晚期细胞凋亡率(16.79±1.01)％均明显高于未转染组和阴性对照组(P＜0.01).结论 成功构建并筛选最佳抑制效率的靶向OPN慢病毒表达载体PLKO.1-OPN2-shRNA,该载体能有效抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖,并促进细胞凋亡。
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