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摘要：【目的】分析评价金针菇菌株的农艺性状及其遗传多样性，为金针菇种质资源分类鉴定、保藏及遗传育种等提供理论参考。【方法】采用拮抗对峙试验、ISSR标记分析和农艺性状测定相結合的方法综合分析29株采自山东和江苏地区的金针菇菌株遗传多样性，并利用NTSYSpc 2.11F计算菌株间遗传相似系数，采用非加权配对算数平均法（UPGMA）构建聚类树状图。【结果】29株金针菇菌株间有246组发生拮抗反应，有160组未发生拮抗反应。供试菌株的菌盖和菌柄颜色有黄色、浅黄色、乳白色和白色4种，菌柄长度15.00～21.20 cm，菌盖直径0.73～1.72 cm，单袋产量332～513 g，生育期41～68 d。白色或乳白色金针菇菌株的生物学效率为73.0%～102.6%，生育期48～68 d;黄色或浅黄色金针菇菌株的生物学效率为66.4%～87.2%，生育期41～58 d，表明白色或乳白色金针菇菌株较黄色或浅黄色菌株产量较高，商品性状优良，但生育期较长。筛选出的8条ISSR引物共计扩增多态性位点270个，多态性比率为94%。供试金针菇菌株遗传相似系数为0.860～0.900，在遗传相似系数0.870处，29株金针菇菌株可分为五大类群。【结论】菌株间是否发生拮抗反应与菌株子实体颜色无关。江苏和山东两地区的金针菇菌株具有较丰富的遗传差异和遗传多样性，但亲缘关系较近。
关键词： 金针菇;遗传多样性;农艺性状;ISSR;拮抗反应;遗传相似系数
中图分类号： S646.150.24 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2018）12-2371-08
Agronomic traits evaluation and genetic diversity analysis of Flammulina filiformis
YANG He-chuan， TAN Yi-luo， SU Wen-ying， QIN Yu-ying，
MA Teng， ZHOU Zhen-ling， PU Han-chun*
（Lianyungang Academy of Agricultural Sciences， Lianyungang， Jiangsu 222000， China）
Abstract：【Objective】To provide valuable references for identification， protection and breeding of Flammulina filiformis，the agronomic traits and genetic diversity of F. filiformis strains were analyzed. 【Method】Antagonistic reaction，ISSR marker analysis and agronomic traits test were used to investigate the genetic diversity of 29 tested strains from Shandong and Jiangsu. The genetic similarity coefficient among tested strains was calculated by NTSYSpc 2.11F， and the clustering tree was constructed by unweighted pairwise arithmetic average method（UPGMA）. 【Result] In the antagonistic reaction，246 groups had antagonistic phenomenon and 160 groups did not in the 29 strains. There were four types of strain cap and stipe color：yellow，light yellow，milky white and white. The length of the stipe was 15.00-21.20 cm，the diameter of the cap was 0.73-1.72 cm，and the yield of single bag was 332-513 g. The growth period was 41-68 d. The biological efficiency of white and milky strains was 73.0%-102.6%，and the growth period was 48-68 d. The biological efficiency of yellow and light yellow strains was 66.4%-87.2%，and the growth period was 41-58 d，indicating that the yield of white and milky F. filiformis strains were generally higher than the yellow and light yellow strains，and their commodity characters were fine， but the growth period was relatively longer. A total of two hundred and seventy polymorphic sites were amplified by eight ISSR primers，and the percentage of polymorphism was 94%. The genetic similarity coefficient among the 29 tested strains ranged from 0.860 to 0.900. All the twenty-nine strains could be clustered into five groups at the genetic similarity coefficient of 0.870. 【Conclusion】The results showed that the antagonistic reaction between F. filiformis strains is independent of the fruit body color. F. filiformis strains in Jiangsu and Shandong have rich genetic differences and gene-tic diversity， but their genetic relationship is relatively close. Key words： Flammulina filiformis; genetic diversity; agronomic characters; ISSR;antagonistic reaction; genetic similarity coefficient
0 引言
【研究意義】金针菇（Flammulina filiformis）又名朴菇、冬菇等（Wang et al.，2018），是世界第四大食用菌，具有广阔的市场前景。我国金针菇栽培历史悠久，东起福建，西至四川，北起黑龙江，南至广东，均有大面积栽培（张介驰等，2007）。目前市场上金针菇菌种生产销售混乱，同种异名、异种同名现象较普遍，不仅影响实际生产中的菌种管理，还给金针菇种性鉴定、良种选育等科研及产业体系建立带来巨大困难。因此，分析金针菇种质资源遗传多样性，对金针菇种质资源保藏与鉴定、遗传育种和产业发展等具有重要意义。【前人研究进展】简单重复序列区间（ISSR）（Karoly，2004）、酯酶同工酶（王波等，2008）、相关序列扩增多态性（SRAP）（许峰等，2010）、目标起始密码子多态性（SCoT）（张斌，2013）、扩增片段长度多态性（AFLP）（陆欢等，2014）、简单重复序列（SSR）（陆欢等，2015）、随机扩增多态性DNA（RAPD）（李红等，2018）等是从蛋白质或DNA水平鉴定菌株间的遗传差异，现已广泛应用于金针菇遗传多样性研究。其中，ISSR是一种新型微卫星类分子标记，通过锚定SSR对简单重复序列的遗传信息进行多态性扩增，综合了多态性丰富、重复性好、成本低等优点，且无需预知基因组序列信息（Xie et al.，2018）。刘勇男等（2015）采用ISSR、RAPD和SRAP分子标记对6株金针菇菌株的遗传多样性进行综合分析，结果表明3种分子标记的综合分析结果比单一分子标记的分析结果更准确可靠。刘昊（2016）利用SSR分子标记分析33株金针菇菌株遗传多样性，结果表明我国金针菇种质资源存在较高的遗传变异。黄龙花等（2018）分析11株野生金针菇的遗传多样性，结果表明地域分布越近的菌株更易聚为一支，且分子鉴定结果与传统形态鉴定结果吻合。【本研究切入点】山东和江苏是我国食用菌的主产区，金针菇种质资源的研究多集中于遗传多样性分析或农艺性状测定，其中遗传多样性分析主要采用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法。与上述传统检测方法相比，荧光标记毛细管电泳的准确性和灵敏度更高，适合大量样本检测，但目前鲜见有关利用荧光标记毛细管电泳技术研究金针菇种质资源遗传多样性的文献报道。【拟解决的关键问题】采用拮抗对峙试验、ISSR分子标记分析和农艺性状测定相结合的方法综合分析29株采自山东和江苏地区的金针菇菌株遗传多样性，并利用NTSYSpc 2.11F计算菌株间遗传相似系数，采用非加权配对算数平均法（UPGMA）构建聚类树状图，以期为金针菇种质资源分类鉴定、保藏及遗传育种等提供理论参考。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
供试材料为29株采自山东和江苏地区的金针菇菌株，其编号和来源地如表1所示。10×PCR Bu-ffer（含Mg2+）、Taq DNA聚合酶、dNTP和ROX1000 Marker均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。主要仪器设备：高速台式低温离心机（Eppendorf，德国），PCR仪（Eppendorf，德国），DG-3D电泳槽（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司），ABI PRISM 377 Sequencer测序仪（ABI，美国）。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 拮抗对峙试验 分别取培养7 d的29株金针菇菌株菌落边缘（0.5 mm2）接种于MYG固体培养基（葡萄糖5 g、麦芽糖10 g、酵母粉5 g、琼脂粉15 g和水1000 mL，pH自然）平皿的3个象限进行对峙培养。将培养基平皿置于25 ℃恒温培养箱中培养10 d，观察并记录菌丝间的拮抗反应（陈雪凤等，2016）。
1. 2. 2 农艺性状测定 将菌种接种于MYG液体培养基，25 ℃下摇床（150 r/min）培养7 d。不同供试菌株分别采用对折径聚丙烯栽培袋（17.5 cm×38.0 cm）进行出菇试验。栽培料配方为棉籽壳38%、木屑25%、麸皮32%、玉米粉3%、轻质碳酸钙1.5%和过磷酸钙0.5%，每袋菌包干重500 g，121 ℃高压灭菌2 h，冷却后接种液体菌种，置于20～22 ℃下培养。每菌株接种50袋，每组10袋，共设5组。菌丝长满袋后按常规方法进行出菇管理，出菇温度10～12 ℃。出菇后，各菌株随机挑选5个菌包，测量并记录菌株的主要农艺性状，并对菌柄长度、菌盖直径和单袋均产进行方差分析。
1. 2. 3 DNA提取 将供试菌株分别接种于MYG固体培养基平皿，25 ℃恒温培养10 d，收集菌株气生菌丝体于1.5 mL离心管中，液氮研磨成粉末后采用CTAB法提取DNA，-20 ℃保存备用。
1. 2. 4 ISSR引物筛选 从加拿大哥伦比亚大学（UBC）公布的96条ISSR引物中随机挑选15条引物序列（表2），由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成。利用15条ISSR引物分别对2株白色金针菇菌株和2株黄色金针菇菌株进行PCR扩增，筛选条带清晰、多态性丰富的引物进行后续试验。
1. 2. 5 ISSR-PCR扩增 ISSR-PCR反应体系25.0 μL：DNA模板2.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，dNTPs 0.5 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O补足至25.0 μL。扩增程序：95 ℃预变性5 min;95 ℃ 30 s，退火温度（表2）退火45 s，72 ℃ 2 min，进行45个循环;72 ℃延伸2 min，4 ℃保存。PCR产物采用荧光标记毛细管电泳技术进行检测。 1. 2. 6 数据处理 观察电泳图谱，并进行条带数目统计，相同位置上有条带记为1，无条带记为0，转换为0/1矩阵。采用NTSYSpc 2.11F计算菌株间遗传相似系数，并通過非加权配对算数平均法（UPGMA）构建聚类树状图。
2 结果与分析
2. 1 拮抗对峙试验结果
拮抗反应是初步鉴定食用菌菌株差异的重要方法。不同菌株在同一平皿培养后，菌丝接触能融合且与其他象限内菌丝无明显差异，鉴定为无拮抗反应;若菌丝接触后在菌丝接触区域气生菌丝稀疏甚至无气生菌丝的隔离带或菌丝接触区域气生菌丝稠密交织形成隆起，甚至在隔离带的基质内产生黄褐色物质（以上简称为拮抗线），则鉴定为有拮抗反应。由图1可看出，F03、F08和F09组合间均无拮抗反应（图1-A），说明亲缘关系较近;F01、F06和F07间均出现明显拮抗线（图1-B），F01分别与F12和F13出现明显拮抗线（图1-D），F07分别与F03和F06间出现明显拮抗线（图1-C），说明亲缘关系较远。据此统计29株供试金针菇菌株拮抗结果（表3），发现有246组发生拮抗反应，160组未发生拮抗反应，表明菌株间是否发生拮抗反应与菌株子实体颜色无关，29株供试菌株具有较丰富的遗传差异。
2. 2 主要农艺性状测定结果
对29株金针菇菌株进行出菇试验，并测定主要农艺性状，结果如表4所示。29株金针菇菌株的菌盖和菌柄颜色有黄色、浅黄色、乳白色和白色4种，根据菌盖颜色划分，F01、F02、F03、F04、F05、F08、F09、F10、F11、F18、F19、F20、F21、F25、F26和F27属于白色或乳白色菌株，F06、F07、F12、F13、F14、F15、F16、F17、F22、F23、F24、F28和F29属于黄色或浅黄色菌株，各菌株的菌盖和菌柄颜色相似或一致（除F06和F07外）。根据菌柄直径，29株金针菇菌株可分为粗柄型（直径≥0.50 mm）和细柄型（直径<0.50 mm）两大类，其中F03、F04、F10、F13、F22、F23和F29为粗柄型，其余菌株为细柄型。29株金针菇菌株生育期为41～68 d，可分为早熟菌株和晚熟菌株两大类，其中早熟菌株生育期41～54 d，晚熟菌株生育期58～68 d。29株金针菇菌株平均单袋产量332～513 g，生物学效率为66.4%～102.6%，可将其分为三大类：生物学效率85.0%及以上为高产菌株，占24.1%;生物学效率75.0%～84.9%为中产菌株，占55.2%;生物学效率74.9%及以下为低产菌株，占20.7%。综合分析发现，29株金针菇菌株中，白色或乳白色菌株的生物学效率为73.0%～102.6%，生育期48～68 d;黄色或浅黄色菌株的生物学效率为66.4%～87.2%，生育期41～58 d，表明白色或乳白色金针菇菌株较黄色或浅黄色菌株产量较高，商品性状优良，但生育期较长。
2. 3 ISSR分析结果
从15条ISSR引物中筛选出8条条带清晰、多态性丰富的ISSR引物，分别是UBC807、UBC809、UBC811、UBC841、UBC842、UBC880、UBC881和UBC888（图2）。利用其对金针菇菌株进行遗传多样性分析，结果显示，共扩增出287个位点，其中多态性位点270个，多态性比率为94%，表明29株金针菇菌株具有丰富的遗传多样性（图3）。
2. 4 聚类分析结果
根据菌株间遗传相似系数构建29株金针菇菌株的UPGMA聚类树状图（图4），29株金针菇菌株遗传相似系数为0.860～0.900，其中以F12和F16的遗传相似系数最高，说明二者亲缘关系最近;以F02和F29的遗传相似系数最低，即二者亲缘关系最远。在遗传相似系数0.860处，29株金针菇菌株聚为同一类群，其中，F29单独聚为一亚类，说明F29与其他菌株遗传差异明显，亲缘关系较远。在遗传相似系数0.870处，29株金针菇菌株分为五大类群，类群Ⅰ包含5株菌株，类群Ⅱ包含2株菌株，类群Ⅲ包含18株菌株，类群Ⅳ包含3株菌株，类群Ⅴ包含1株菌株。
当29株金针菇菌株分为五大类群时，类群Ⅰ子实体菌盖和菌柄均为白色，且类群内各菌株均不发生拮抗反应;类群Ⅱ包含2株白色金针菇菌株，二者不发生拮抗反应，说明同一类群内金针菇菌株亲缘关系较近。虽然类群Ⅳ内菌株间也不发生拮抗反应，但子实体颜色不同;除类群Ⅴ外，白色金针菇菌株在其他4个类群中均有分布，表明白色金针菇菌株具有丰富的遗传多样性。综上所述，ISSR标记的聚类分析结果可较准确揭示金针菇菌株的遗传差异、亲缘关系及遗传多样性。
3 讨论
拮抗反应是体细胞不亲和性的具体表现，可作为鉴定菌株遗传差异的传统方法，日本的食用菌品种登记制度也将其列为一个重要指标。王守现等（2009）研究表明，6株供试金针菇菌株的拮抗对峙试验结果与聚类分析结果一致，说明拮抗对峙试验是对菌株的初步鉴定。本研究通过拮抗对峙试验发现，406组中有160组不发生拮抗反应，且大部分拮抗对峙试验结果与聚类分析结果一致，如菌株F12和F16、F23和F28、F25和F26等，但少部分拮抗对峙试验结果与聚类分析存在差异，如在拮抗对峙试验中菌株F29与F7、F12等12株菌株均不发生拮抗反应，但在聚类分析时其与菌株F07和F12亲缘关系较远，说明拮抗对峙试验不能完全准确鉴定金针菇菌株的遗传差异。赵淑英和王立安（2012）研究也发现，金针菇拮抗对峙试验结果与亲缘关系分析结果存在差异，推测拮抗对峙试验结果受菌种继代次数和培养基的影响。此外，本研究发现在金针菇菌株间存在拮抗线不明显的现象，因此，观察拮抗线时会受主观因素影响，说明拮抗对峙试验可作为菌株鉴定的辅助方法，还需结合分子标记等方法进行综合分析评价。
ISSR分子标记可从DNA水平反映菌株间的遗传变异，近年来被广泛应用于食用菌鉴定及遗传多样性分析（王翠，2010）。本研究利用筛选出的8条ISSR分子标记引物从29株金针菇菌株扩增出287个位点，多态性比率94%，表明金针菇菌株具有较丰富的遗传多样性。至今，大量科研人员对金针菇种质资源的遗传多样性进行分析，由于供试菌株、引物种类和数量等不同，多态性水平和遗传相似系数等也有所不同。王波和鲜灵（2013）研究发现，8条ISSR引物从国内外114株菌株中扩增获得的条带中多态性比率为93.97%，菌株间遗传相似系数为0.660～0.950;谭艳（2016）研究发现，8条ISSR引物从29株金针菇菌株中扩增获得的条带中多态性比率为79.52%，遗传相似系数为0.670～0.890;宿红艳等（2008）研究发现，8条ISSR引物从6株金针菇菌株扩增获得的条带中多态性比率为81.60%，遗传相似系数为0.600～0.900。这些研究测定的多态性比率比本研究低，说明本研究筛选获得的ISSR引物具有较好的多态性，但本研究供试菌株间的遗传相似系数比上述研究高，说明供试菌株间的亲缘关系较近，究其原因可能是供试菌株为山东和江苏地区的常用菌种，地区间的相互引种导致供试菌株间的遗传差异较小。此外，检测方法不同也会导致试验结果出现差异，本研究采用荧光标记毛细管电泳技术，与传统的琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳相比，其在分离小片段DNA和分辨率方面更具优势（常玉卉等，2017）。 目前，金针菇生产用菌种按生产模式主要分为农户栽培品种和工厂化栽培品种两类。本研究发现在0.870上，类群Ⅰ包含4株工厂化栽培菌株和1株农户栽培菌株，类群Ⅱ均是工厂化栽培菌株，类群Ⅲ和类群Ⅴ均是农户栽培菌株，说明生产性质相同的菌株亲缘关系较近，可能是同类菌株起源相似且生产环境接近，进化差异小。陆欢等（2014）研究表明，我国市场上金针菇工厂化菌种亲缘关系较近，与本研究结果相符。本研究结果显示，聚类结果与菌株来源地无明显相关性，不同地区的菌株聚为一类，说明供试菌株遗传基础较集中，推测是由品种选育和栽培中不同地区相互引种或亲本杂交所造成。
农艺性状测定是金针菇种质资源开发利用及优质品种选育的基础工作。本研究29株金针菇菌株农艺性状测定结果表明，不同品种金针菇子实体间的表观特征存在明显差异，其中，菌株F12、F15、F22和F24等生育期较短，菌株F02、F05和F19等产量较高且菌盖较小、商品性好，可作为杂交育种的优良亲本选育早熟、高产、优质的金针菇新品种。本研究供试菌株主要引自江苏和山东地区，今后应扩大菌种采集范围，收集具有地方特征的优势品种，并结合多种分子标记技术，综合分析金针菇的遗传多样性，为金针菇新品种选育和杂种优势的預测提供参考。
4 结论
菌株间是否发生拮抗反应与菌株子实体颜色无关。江苏和山东两地区的金针菇菌株具有较丰富的遗传差异和遗传多样性，但亲缘关系较近。
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关键词： 金针菇;遗传多样性;农艺性状;ISSR;拮抗反应;遗传相似系数
中图分类号： S646.150.24 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2018）12-2371-08
Agronomic traits evaluation and genetic diversity analysis of Flammulina filiformis
YANG He-chuan， TAN Yi-luo， SU Wen-ying， QIN Yu-ying，
MA Teng， ZHOU Zhen-ling， PU Han-chun*
（Lianyungang Academy of Agricultural Sciences， Lianyungang， Jiangsu 222000， China）
Abstract：【Objective】To provide valuable references for identification， protection and breeding of Flammulina filiformis，the agronomic traits and genetic diversity of F. filiformis strains were analyzed. 【Method】Antagonistic reaction，ISSR marker analysis and agronomic traits test were used to investigate the genetic diversity of 29 tested strains from Shandong and Jiangsu. The genetic similarity coefficient among tested strains was calculated by NTSYSpc 2.11F， and the clustering tree was constructed by unweighted pairwise arithmetic average method（UPGMA）. 【Result] In the antagonistic reaction，246 groups had antagonistic phenomenon and 160 groups did not in the 29 strains. There were four types of strain cap and stipe color：yellow，light yellow，milky white and white. The length of the stipe was 15.00-21.20 cm，the diameter of the cap was 0.73-1.72 cm，and the yield of single bag was 332-513 g. The growth period was 41-68 d. The biological efficiency of white and milky strains was 73.0%-102.6%，and the growth period was 48-68 d. The biological efficiency of yellow and light yellow strains was 66.4%-87.2%，and the growth period was 41-58 d，indicating that the yield of white and milky F. filiformis strains were generally higher than the yellow and light yellow strains，and their commodity characters were fine， but the growth period was relatively longer. A total of two hundred and seventy polymorphic sites were amplified by eight ISSR primers，and the percentage of polymorphism was 94%. The genetic similarity coefficient among the 29 tested strains ranged from 0.860 to 0.900. All the twenty-nine strains could be clustered into five groups at the genetic similarity coefficient of 0.870. 【Conclusion】The results showed that the antagonistic reaction between F. filiformis strains is independent of the fruit body color. F. filiformis strains in Jiangsu and Shandong have rich genetic differences and gene-tic diversity， but their genetic relationship is relatively close. Key words： Flammulina filiformis; genetic diversity; agronomic characters; ISSR;antagonistic reaction; genetic similarity coefficient
0 引言
【研究意義】金针菇（Flammulina filiformis）又名朴菇、冬菇等（Wang et al.，2018），是世界第四大食用菌，具有广阔的市场前景。我国金针菇栽培历史悠久，东起福建，西至四川，北起黑龙江，南至广东，均有大面积栽培（张介驰等，2007）。目前市场上金针菇菌种生产销售混乱，同种异名、异种同名现象较普遍，不仅影响实际生产中的菌种管理，还给金针菇种性鉴定、良种选育等科研及产业体系建立带来巨大困难。因此，分析金针菇种质资源遗传多样性，对金针菇种质资源保藏与鉴定、遗传育种和产业发展等具有重要意义。【前人研究进展】简单重复序列区间（ISSR）（Karoly，2004）、酯酶同工酶（王波等，2008）、相关序列扩增多态性（SRAP）（许峰等，2010）、目标起始密码子多态性（SCoT）（张斌，2013）、扩增片段长度多态性（AFLP）（陆欢等，2014）、简单重复序列（SSR）（陆欢等，2015）、随机扩增多态性DNA（RAPD）（李红等，2018）等是从蛋白质或DNA水平鉴定菌株间的遗传差异，现已广泛应用于金针菇遗传多样性研究。其中，ISSR是一种新型微卫星类分子标记，通过锚定SSR对简单重复序列的遗传信息进行多态性扩增，综合了多态性丰富、重复性好、成本低等优点，且无需预知基因组序列信息（Xie et al.，2018）。刘勇男等（2015）采用ISSR、RAPD和SRAP分子标记对6株金针菇菌株的遗传多样性进行综合分析，结果表明3种分子标记的综合分析结果比单一分子标记的分析结果更准确可靠。刘昊（2016）利用SSR分子标记分析33株金针菇菌株遗传多样性，结果表明我国金针菇种质资源存在较高的遗传变异。黄龙花等（2018）分析11株野生金针菇的遗传多样性，结果表明地域分布越近的菌株更易聚为一支，且分子鉴定结果与传统形态鉴定结果吻合。【本研究切入点】山东和江苏是我国食用菌的主产区，金针菇种质资源的研究多集中于遗传多样性分析或农艺性状测定，其中遗传多样性分析主要采用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法。与上述传统检测方法相比，荧光标记毛细管电泳的准确性和灵敏度更高，适合大量样本检测，但目前鲜见有关利用荧光标记毛细管电泳技术研究金针菇种质资源遗传多样性的文献报道。【拟解决的关键问题】采用拮抗对峙试验、ISSR分子标记分析和农艺性状测定相结合的方法综合分析29株采自山东和江苏地区的金针菇菌株遗传多样性，并利用NTSYSpc 2.11F计算菌株间遗传相似系数，采用非加权配对算数平均法（UPGMA）构建聚类树状图，以期为金针菇种质资源分类鉴定、保藏及遗传育种等提供理论参考。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
供试材料为29株采自山东和江苏地区的金针菇菌株，其编号和来源地如表1所示。10×PCR Bu-ffer（含Mg2+）、Taq DNA聚合酶、dNTP和ROX1000 Marker均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。主要仪器设备：高速台式低温离心机（Eppendorf，德国），PCR仪（Eppendorf，德国），DG-3D电泳槽（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司），ABI PRISM 377 Sequencer测序仪（ABI，美国）。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 拮抗对峙试验 分别取培养7 d的29株金针菇菌株菌落边缘（0.5 mm2）接种于MYG固体培养基（葡萄糖5 g、麦芽糖10 g、酵母粉5 g、琼脂粉15 g和水1000 mL，pH自然）平皿的3个象限进行对峙培养。将培养基平皿置于25 ℃恒温培养箱中培养10 d，观察并记录菌丝间的拮抗反应（陈雪凤等，2016）。
1. 2. 2 农艺性状测定 将菌种接种于MYG液体培养基，25 ℃下摇床（150 r/min）培养7 d。不同供试菌株分别采用对折径聚丙烯栽培袋（17.5 cm×38.0 cm）进行出菇试验。栽培料配方为棉籽壳38%、木屑25%、麸皮32%、玉米粉3%、轻质碳酸钙1.5%和过磷酸钙0.5%，每袋菌包干重500 g，121 ℃高压灭菌2 h，冷却后接种液体菌种，置于20～22 ℃下培养。每菌株接种50袋，每组10袋，共设5组。菌丝长满袋后按常规方法进行出菇管理，出菇温度10～12 ℃。出菇后，各菌株随机挑选5个菌包，测量并记录菌株的主要农艺性状，并对菌柄长度、菌盖直径和单袋均产进行方差分析。
1. 2. 3 DNA提取 将供试菌株分别接种于MYG固体培养基平皿，25 ℃恒温培养10 d，收集菌株气生菌丝体于1.5 mL离心管中，液氮研磨成粉末后采用CTAB法提取DNA，-20 ℃保存备用。
1. 2. 4 ISSR引物筛选 从加拿大哥伦比亚大学（UBC）公布的96条ISSR引物中随机挑选15条引物序列（表2），由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成。利用15条ISSR引物分别对2株白色金针菇菌株和2株黄色金针菇菌株进行PCR扩增，筛选条带清晰、多态性丰富的引物进行后续试验。
1. 2. 5 ISSR-PCR扩增 ISSR-PCR反应体系25.0 μL：DNA模板2.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，dNTPs 0.5 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O补足至25.0 μL。扩增程序：95 ℃预变性5 min;95 ℃ 30 s，退火温度（表2）退火45 s，72 ℃ 2 min，进行45个循环;72 ℃延伸2 min，4 ℃保存。PCR产物采用荧光标记毛细管电泳技术进行检测。 1. 2. 6 数据处理 观察电泳图谱，并进行条带数目统计，相同位置上有条带记为1，无条带记为0，转换为0/1矩阵。采用NTSYSpc 2.11F计算菌株间遗传相似系数，并通過非加权配对算数平均法（UPGMA）构建聚类树状图。
2 结果与分析
2. 1 拮抗对峙试验结果
拮抗反应是初步鉴定食用菌菌株差异的重要方法。不同菌株在同一平皿培养后，菌丝接触能融合且与其他象限内菌丝无明显差异，鉴定为无拮抗反应;若菌丝接触后在菌丝接触区域气生菌丝稀疏甚至无气生菌丝的隔离带或菌丝接触区域气生菌丝稠密交织形成隆起，甚至在隔离带的基质内产生黄褐色物质（以上简称为拮抗线），则鉴定为有拮抗反应。由图1可看出，F03、F08和F09组合间均无拮抗反应（图1-A），说明亲缘关系较近;F01、F06和F07间均出现明显拮抗线（图1-B），F01分别与F12和F13出现明显拮抗线（图1-D），F07分别与F03和F06间出现明显拮抗线（图1-C），说明亲缘关系较远。据此统计29株供试金针菇菌株拮抗结果（表3），发现有246组发生拮抗反应，160组未发生拮抗反应，表明菌株间是否发生拮抗反应与菌株子实体颜色无关，29株供试菌株具有较丰富的遗传差异。
2. 2 主要农艺性状测定结果
对29株金针菇菌株进行出菇试验，并测定主要农艺性状，结果如表4所示。29株金针菇菌株的菌盖和菌柄颜色有黄色、浅黄色、乳白色和白色4种，根据菌盖颜色划分，F01、F02、F03、F04、F05、F08、F09、F10、F11、F18、F19、F20、F21、F25、F26和F27属于白色或乳白色菌株，F06、F07、F12、F13、F14、F15、F16、F17、F22、F23、F24、F28和F29属于黄色或浅黄色菌株，各菌株的菌盖和菌柄颜色相似或一致（除F06和F07外）。根据菌柄直径，29株金针菇菌株可分为粗柄型（直径≥0.50 mm）和细柄型（直径<0.50 mm）两大类，其中F03、F04、F10、F13、F22、F23和F29为粗柄型，其余菌株为细柄型。29株金针菇菌株生育期为41～68 d，可分为早熟菌株和晚熟菌株两大类，其中早熟菌株生育期41～54 d，晚熟菌株生育期58～68 d。29株金针菇菌株平均单袋产量332～513 g，生物学效率为66.4%～102.6%，可将其分为三大类：生物学效率85.0%及以上为高产菌株，占24.1%;生物学效率75.0%～84.9%为中产菌株，占55.2%;生物学效率74.9%及以下为低产菌株，占20.7%。综合分析发现，29株金针菇菌株中，白色或乳白色菌株的生物学效率为73.0%～102.6%，生育期48～68 d;黄色或浅黄色菌株的生物学效率为66.4%～87.2%，生育期41～58 d，表明白色或乳白色金针菇菌株较黄色或浅黄色菌株产量较高，商品性状优良，但生育期较长。
2. 3 ISSR分析结果
从15条ISSR引物中筛选出8条条带清晰、多态性丰富的ISSR引物，分别是UBC807、UBC809、UBC811、UBC841、UBC842、UBC880、UBC881和UBC888（图2）。利用其对金针菇菌株进行遗传多样性分析，结果显示，共扩增出287个位点，其中多态性位点270个，多态性比率为94%，表明29株金针菇菌株具有丰富的遗传多样性（图3）。
2. 4 聚类分析结果
根据菌株间遗传相似系数构建29株金针菇菌株的UPGMA聚类树状图（图4），29株金针菇菌株遗传相似系数为0.860～0.900，其中以F12和F16的遗传相似系数最高，说明二者亲缘关系最近;以F02和F29的遗传相似系数最低，即二者亲缘关系最远。在遗传相似系数0.860处，29株金针菇菌株聚为同一类群，其中，F29单独聚为一亚类，说明F29与其他菌株遗传差异明显，亲缘关系较远。在遗传相似系数0.870处，29株金针菇菌株分为五大类群，类群Ⅰ包含5株菌株，类群Ⅱ包含2株菌株，类群Ⅲ包含18株菌株，类群Ⅳ包含3株菌株，类群Ⅴ包含1株菌株。
当29株金针菇菌株分为五大类群时，类群Ⅰ子实体菌盖和菌柄均为白色，且类群内各菌株均不发生拮抗反应;类群Ⅱ包含2株白色金针菇菌株，二者不发生拮抗反应，说明同一类群内金针菇菌株亲缘关系较近。虽然类群Ⅳ内菌株间也不发生拮抗反应，但子实体颜色不同;除类群Ⅴ外，白色金针菇菌株在其他4个类群中均有分布，表明白色金针菇菌株具有丰富的遗传多样性。综上所述，ISSR标记的聚类分析结果可较准确揭示金针菇菌株的遗传差异、亲缘关系及遗传多样性。
3 讨论
拮抗反应是体细胞不亲和性的具体表现，可作为鉴定菌株遗传差异的传统方法，日本的食用菌品种登记制度也将其列为一个重要指标。王守现等（2009）研究表明，6株供试金针菇菌株的拮抗对峙试验结果与聚类分析结果一致，说明拮抗对峙试验是对菌株的初步鉴定。本研究通过拮抗对峙试验发现，406组中有160组不发生拮抗反应，且大部分拮抗对峙试验结果与聚类分析结果一致，如菌株F12和F16、F23和F28、F25和F26等，但少部分拮抗对峙试验结果与聚类分析存在差异，如在拮抗对峙试验中菌株F29与F7、F12等12株菌株均不发生拮抗反应，但在聚类分析时其与菌株F07和F12亲缘关系较远，说明拮抗对峙试验不能完全准确鉴定金针菇菌株的遗传差异。赵淑英和王立安（2012）研究也发现，金针菇拮抗对峙试验结果与亲缘关系分析结果存在差异，推测拮抗对峙试验结果受菌种继代次数和培养基的影响。此外，本研究发现在金针菇菌株间存在拮抗线不明显的现象，因此，观察拮抗线时会受主观因素影响，说明拮抗对峙试验可作为菌株鉴定的辅助方法，还需结合分子标记等方法进行综合分析评价。
ISSR分子标记可从DNA水平反映菌株间的遗传变异，近年来被广泛应用于食用菌鉴定及遗传多样性分析（王翠，2010）。本研究利用筛选出的8条ISSR分子标记引物从29株金针菇菌株扩增出287个位点，多态性比率94%，表明金针菇菌株具有较丰富的遗传多样性。至今，大量科研人员对金针菇种质资源的遗传多样性进行分析，由于供试菌株、引物种类和数量等不同，多态性水平和遗传相似系数等也有所不同。王波和鲜灵（2013）研究发现，8条ISSR引物从国内外114株菌株中扩增获得的条带中多态性比率为93.97%，菌株间遗传相似系数为0.660～0.950;谭艳（2016）研究发现，8条ISSR引物从29株金针菇菌株中扩增获得的条带中多态性比率为79.52%，遗传相似系数为0.670～0.890;宿红艳等（2008）研究发现，8条ISSR引物从6株金针菇菌株扩增获得的条带中多态性比率为81.60%，遗传相似系数为0.600～0.900。这些研究测定的多态性比率比本研究低，说明本研究筛选获得的ISSR引物具有较好的多态性，但本研究供试菌株间的遗传相似系数比上述研究高，说明供试菌株间的亲缘关系较近，究其原因可能是供试菌株为山东和江苏地区的常用菌种，地区间的相互引种导致供试菌株间的遗传差异较小。此外，检测方法不同也会导致试验结果出现差异，本研究采用荧光标记毛细管电泳技术，与传统的琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳相比，其在分离小片段DNA和分辨率方面更具优势（常玉卉等，2017）。 目前，金针菇生产用菌种按生产模式主要分为农户栽培品种和工厂化栽培品种两类。本研究发现在0.870上，类群Ⅰ包含4株工厂化栽培菌株和1株农户栽培菌株，类群Ⅱ均是工厂化栽培菌株，类群Ⅲ和类群Ⅴ均是农户栽培菌株，说明生产性质相同的菌株亲缘关系较近，可能是同类菌株起源相似且生产环境接近，进化差异小。陆欢等（2014）研究表明，我国市场上金针菇工厂化菌种亲缘关系较近，与本研究结果相符。本研究结果显示，聚类结果与菌株来源地无明显相关性，不同地区的菌株聚为一类，说明供试菌株遗传基础较集中，推测是由品种选育和栽培中不同地区相互引种或亲本杂交所造成。
农艺性状测定是金针菇种质资源开发利用及优质品种选育的基础工作。本研究29株金针菇菌株农艺性状测定结果表明，不同品种金针菇子实体间的表观特征存在明显差异，其中，菌株F12、F15、F22和F24等生育期较短，菌株F02、F05和F19等产量较高且菌盖较小、商品性好，可作为杂交育种的优良亲本选育早熟、高产、优质的金针菇新品种。本研究供试菌株主要引自江苏和山东地区，今后应扩大菌种采集范围，收集具有地方特征的优势品种，并结合多种分子标记技术，综合分析金针菇的遗传多样性，为金针菇新品种选育和杂种优势的預测提供参考。
4 结论
菌株间是否发生拮抗反应与菌株子实体颜色无关。江苏和山东两地区的金针菇菌株具有较丰富的遗传差异和遗传多样性，但亲缘关系较近。
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