[目的]明晰混合甲烷氧化菌剂制备工艺及保护剂对菌群结构的影响。[方法]通过正交实验优化保护剂配方,并结合高通量测序分析菌剂制备前后菌群结构及甲烷降解能力变化。[结果]当保护剂配比为葡萄糖浓度(单位为g/mL菌液) 2. 5%、甘油15%、脱脂乳粉10%时,菌群存活率高达112. 7%;菌群结构由冻干前的优势菌Methylocystaceae(甲基孢囊菌属)、Acidovorax(食酸菌属)等演替为Ralstonia(罗尔斯顿菌属)、Stenotrophomonas(寡养单胞菌)等,其中对甲烷降解作用的Methylocystaceae(甲基孢囊菌属)冻前丰度71. 70%降为冻后的4. 26%;甲烷降解率由冻前的76. 21%降为冻后的74. 23%。[结论]混合菌剂制备过程中保护剂作为新碳源及能源影响了菌群结构,甲烷降解率下降2. 6%。菌群对外界因素的响应灵敏,但群体行为之间的关系和机理还有待探析。