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【摘 要】目的：正交优化土牛膝中蜕皮甾酮的提取工艺。方法：采用单因素实验、正交试验设计和高效液相色谱法，以色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18（250×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇∶水=39∶61；流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃；进量体积：10 μL；检测波长：250 nm条件下对土牛膝中蜕皮甾酮的提取工艺进行研究。结果：蜕皮甾酮在0.117～5.85 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系，蜕皮甾酮的标准曲线方程y=1 367.7x，r=0.999 8；土牛膝中蜕皮甾酮最佳提取工艺为每0.5 g土牛膝药材粉末以60倍30%甲醇超声提取2次每次1.5 h。结论：该提取工艺简便、合理，可为土牛膝中蜕皮甾酮的制备及土牛膝的进一步开发利用提供参考。
【关键词】土牛膝；蜕皮甾酮；正交设计；提取工艺
【中图分类号】R286 【文献标识码】A 【文章编号】1674-0688（2018）06-0049-03
土牛膝为苋科植物粗毛牛膝（Achyranthes aspera L.）的干燥根和根茎[1]，其味苦、酸，性微寒，具有清热毒、除湿邪、调水道、驱瘴毒的功效；主治闭经、痛经、月经不调、淋证、痢疾、瘴病、痧病、水肿、冻疮等疾病[2]。目前，临床上常用于治疗白喉、咽喉肿痛、感冒发热、流行性腮腺炎、疟疾、肾炎水肿的治疗[3]。現代医学研究报道，土牛膝具明显的杀菌、镇痛、降血糖和抗脂质过氧化的作用，可以有效降低血清中胆固醇的含量，减少血小板的聚集性作用[4]，且在治疗呼吸道、泌尿系统感染上效果显著[5]，并对多种疾病具有预防作用[6-7]。本文对土牛膝中的药效成分蜕皮甾酮进行正交提取工艺研究。
1 实验试药与仪器
1.1 实验材料
本实验所用的土牛膝根和根茎采集于广西金秀县，经广西中医药大学药学院高级实验师廖月葵鉴定为苋科植物粗毛土牛膝Achyranthes aspera L.的根和根茎，蜕皮甾酮对照品（四川维克奇生物科技有限公司；批号：130428；纯度：HPLC≥98%）。
1.2 实验仪器
Agilent 1260高效液相色谱仪（Agilent美国安捷伦）、SQP电子天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）、L600台式低速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）、TGL-16G高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）、KQ5200B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、DHG-9203A电热恒温鼓风干燥箱（上海齐欣科学仪器有限公司）、HWS-2l电热恒温水浴锅（上海齐欣科学仪器有限公司），等等。
1.3 试剂与溶剂
甲醇（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）；去离子水；其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 对照品溶液制备
精密称量蜕皮甾酮对照品11.70 mg，置10 mL容量瓶中，加流动相溶解稀释至刻度，摇匀，精密移取2 mL置于10 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即可。
2.2 供试品溶液制备
取土牛膝药材粉末（过三号筛）约0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入30%甲醇溶液30 mL，称重，超声处理1.5 h，静置冷却后补足失重，离心15 min（转速为4 200 rpm），取上清液置于蒸发皿中，残渣重复做实验，浓缩至近干，用甲醇溶液定容至5 mL容量瓶，摇匀，取1 mL试液离心15 min（转速为13 000 rpm），即得供试品溶液。
2.3 色谱条件
色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18（250×4.6 mm，5μm）；流动相：甲醇∶水=39∶61；流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃；进量体积：10μL；检测波长：250 nm。
2.4 系统适应性试验
分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各5 μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图（如图1～图2所示）。结果表明：蜕皮甾酮峰在16.9 min附近出峰，无干扰。
2.5 标准曲线绘制
分别精密吸取蜕皮甾酮对照品溶液（0.234 mg/mL） 0.5、1、5、10、15、25 μL，注入液相色谱仪，按上述“2.3”项下的色谱条件测定峰面积，以峰面积y与蜕皮甾酮进样量x（μg）进行线性回归，得标准曲线方程y=1 367.7x，r=0.999 8。表明蜕皮甾酮在0.117～5.85 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。
2.6 提取溶液的考察
分别取约0.5 g土牛膝粉末（过50目筛），精密称定，置于具塞锥形瓶中，分别加入不同浓度的乙醇（10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%）、水、不同浓度的甲醇（10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%）提取溶剂30 mL，一式2份，称重，超声处理1 h，放冷，称重，分别加入相应的提取溶剂补足重量，摇匀，静置，取上清液，水浴烘干。用甲醇溶液定容至5 mL的容量瓶中，取溶液1 mL进行离心，进样，测定。将各提取样品的检测峰面积代入蜕皮甾酮的线性方程中进行计算，算出各样品中蜕皮甾酮的含量。结果表明30%甲醇对土牛膝根和根茎药材中的蜕皮甾酮的提取效果较好。
2.7 其他试验条件正交优化研究
以土牛膝中蜕皮甾酮为考察指标，以提取时间（h）、提取次数、甲醇浓度（%）、加溶剂量倍数等因素，应用L9（34）正交进行试验设计，具体试验因素水平与设计见表1、表2。
取土牛膝根和根茎粉末（过50目筛），取各约0.5 g，精密称定，分别置于锥形瓶中，按表2中的因素水平序号进行正交提取，一式2份。表2中的各因素水平具体见表1。每次提取后都静置、补足重量，多次提取的，合并上清液，后水浴干燥，用甲醇定容至5 mL。取样，离心，测定，得到峰面积代入标准曲线的线性方程进行计算，计算出各提取样品中所含的蜕皮甾酮含量。 3 讨论
通过蜕皮甾酮对照品HPLC检测的3D图谱可知蜕皮甾酮的最大吸收峰为250 nm；对土牛膝样品进行检测结果表明：以甲醇∶水=39∶61为流动相时，土牛膝样品中的蜕皮甾酮的分离效果较为理想。因此，本实验选择流动相为甲醇∶水=39∶61。笔者还采用超声、静置、加热回流等不同提取方法对土牛膝中的蜕皮甾酮效果进行比较，结果表明超声提取和回流提取的效果相当，均优于静置提取的效果，但由于超声提取消耗能量较少，且操作简便，故选用超声做为提取。由实验结果的直观分析得出，各因素对测得蜕皮甾酮的含量的影響大小依次如下：提取容剂（D）>提取次数（B）>甲醇浓度（C）=提取时间（A）。极差分析数据表明：δ31>δ21>δ11；δ22>δ32>δ12；δ23>δ13=δ33；δ34>δ24>δ14。因此，各因素水平最佳的实验组合为A3B2C2D3，表明土牛膝中的蜕皮甾酮最佳提取工艺为每0.5 g用60倍的30%甲醇超声提取2次，每次1.5 h。
蜕皮甾酮为土牛膝的主要活性成分之一，可用于调整人体内新陈代谢，提高身体的免疫功能，且对炎症、高血糖、抗动脉粥硬化等多种疾病的治疗效果良好而受到广泛关注。本文对土牛膝中的蜕皮甾酮进行正交提取工艺研究，可为土牛膝中蜕皮甾酮的制备及土牛膝的进一步开发利用提供参考。
参 考 文 献
[1]国家药典委员会.中国药典（Ⅴ部）[M].北京：化学工业出版社，2015：418.
[2]钟鸣，韦松基.常用壮药临床手册[M].南宁：广西科学技术出版社，2010：292-293.
[3]何显玲.牛膝与川牛膝及土牛膝鉴别应用[J].实用中医药杂志，2013，29（2）：136-137.
[4]魏得良，黄志芳，黄志红，等.土牛膝水煮液对正常及四氧嘧啶糖尿病模型小鼠血糖的影响[J].中外医疗，2010，24（1）：8-9.
[5]李晓亮，邵旭，何万龙，等.预防治疗呼吸道、泌尿系统感染的土牛膝酮苷药物及其制剂、制备方法[P].中国专利：CN102406673A，2012-04-11.
[6]张然，熊文梅，涂学志，等.复方土牛膝合剂抗菌和抗病毒作用的实验研究[J].抗感染药学，2006，3（3）：136-138.
[7]张庆远，夏西超，王中晓，等.20-羟基蜕皮甾酮对Ⅰ型糖尿病小鼠葡萄糖激酶和肿瘤坏死因子-α表达的影响[J].现代预防医学，2015，42（16）：2989-2992. [责任编辑：钟声贤]
【关键词】土牛膝；蜕皮甾酮；正交设计；提取工艺
【中图分类号】R286 【文献标识码】A 【文章编号】1674-0688（2018）06-0049-03
土牛膝为苋科植物粗毛牛膝（Achyranthes aspera L.）的干燥根和根茎[1]，其味苦、酸，性微寒，具有清热毒、除湿邪、调水道、驱瘴毒的功效；主治闭经、痛经、月经不调、淋证、痢疾、瘴病、痧病、水肿、冻疮等疾病[2]。目前，临床上常用于治疗白喉、咽喉肿痛、感冒发热、流行性腮腺炎、疟疾、肾炎水肿的治疗[3]。現代医学研究报道，土牛膝具明显的杀菌、镇痛、降血糖和抗脂质过氧化的作用，可以有效降低血清中胆固醇的含量，减少血小板的聚集性作用[4]，且在治疗呼吸道、泌尿系统感染上效果显著[5]，并对多种疾病具有预防作用[6-7]。本文对土牛膝中的药效成分蜕皮甾酮进行正交提取工艺研究。
1 实验试药与仪器
1.1 实验材料
本实验所用的土牛膝根和根茎采集于广西金秀县，经广西中医药大学药学院高级实验师廖月葵鉴定为苋科植物粗毛土牛膝Achyranthes aspera L.的根和根茎，蜕皮甾酮对照品（四川维克奇生物科技有限公司；批号：130428；纯度：HPLC≥98%）。
1.2 实验仪器
Agilent 1260高效液相色谱仪（Agilent美国安捷伦）、SQP电子天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）、L600台式低速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）、TGL-16G高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）、KQ5200B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、DHG-9203A电热恒温鼓风干燥箱（上海齐欣科学仪器有限公司）、HWS-2l电热恒温水浴锅（上海齐欣科学仪器有限公司），等等。
1.3 试剂与溶剂
甲醇（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）；去离子水；其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 对照品溶液制备
精密称量蜕皮甾酮对照品11.70 mg，置10 mL容量瓶中，加流动相溶解稀释至刻度，摇匀，精密移取2 mL置于10 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即可。
2.2 供试品溶液制备
取土牛膝药材粉末（过三号筛）约0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入30%甲醇溶液30 mL，称重，超声处理1.5 h，静置冷却后补足失重，离心15 min（转速为4 200 rpm），取上清液置于蒸发皿中，残渣重复做实验，浓缩至近干，用甲醇溶液定容至5 mL容量瓶，摇匀，取1 mL试液离心15 min（转速为13 000 rpm），即得供试品溶液。
2.3 色谱条件
色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18（250×4.6 mm，5μm）；流动相：甲醇∶水=39∶61；流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃；进量体积：10μL；检测波长：250 nm。
2.4 系统适应性试验
分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各5 μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图（如图1～图2所示）。结果表明：蜕皮甾酮峰在16.9 min附近出峰，无干扰。
2.5 标准曲线绘制
分别精密吸取蜕皮甾酮对照品溶液（0.234 mg/mL） 0.5、1、5、10、15、25 μL，注入液相色谱仪，按上述“2.3”项下的色谱条件测定峰面积，以峰面积y与蜕皮甾酮进样量x（μg）进行线性回归，得标准曲线方程y=1 367.7x，r=0.999 8。表明蜕皮甾酮在0.117～5.85 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。
2.6 提取溶液的考察
分别取约0.5 g土牛膝粉末（过50目筛），精密称定，置于具塞锥形瓶中，分别加入不同浓度的乙醇（10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%）、水、不同浓度的甲醇（10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%）提取溶剂30 mL，一式2份，称重，超声处理1 h，放冷，称重，分别加入相应的提取溶剂补足重量，摇匀，静置，取上清液，水浴烘干。用甲醇溶液定容至5 mL的容量瓶中，取溶液1 mL进行离心，进样，测定。将各提取样品的检测峰面积代入蜕皮甾酮的线性方程中进行计算，算出各样品中蜕皮甾酮的含量。结果表明30%甲醇对土牛膝根和根茎药材中的蜕皮甾酮的提取效果较好。
2.7 其他试验条件正交优化研究
以土牛膝中蜕皮甾酮为考察指标，以提取时间（h）、提取次数、甲醇浓度（%）、加溶剂量倍数等因素，应用L9（34）正交进行试验设计，具体试验因素水平与设计见表1、表2。
取土牛膝根和根茎粉末（过50目筛），取各约0.5 g，精密称定，分别置于锥形瓶中，按表2中的因素水平序号进行正交提取，一式2份。表2中的各因素水平具体见表1。每次提取后都静置、补足重量，多次提取的，合并上清液，后水浴干燥，用甲醇定容至5 mL。取样，离心，测定，得到峰面积代入标准曲线的线性方程进行计算，计算出各提取样品中所含的蜕皮甾酮含量。 3 讨论
通过蜕皮甾酮对照品HPLC检测的3D图谱可知蜕皮甾酮的最大吸收峰为250 nm；对土牛膝样品进行检测结果表明：以甲醇∶水=39∶61为流动相时，土牛膝样品中的蜕皮甾酮的分离效果较为理想。因此，本实验选择流动相为甲醇∶水=39∶61。笔者还采用超声、静置、加热回流等不同提取方法对土牛膝中的蜕皮甾酮效果进行比较，结果表明超声提取和回流提取的效果相当，均优于静置提取的效果，但由于超声提取消耗能量较少，且操作简便，故选用超声做为提取。由实验结果的直观分析得出，各因素对测得蜕皮甾酮的含量的影響大小依次如下：提取容剂（D）>提取次数（B）>甲醇浓度（C）=提取时间（A）。极差分析数据表明：δ31>δ21>δ11；δ22>δ32>δ12；δ23>δ13=δ33；δ34>δ24>δ14。因此，各因素水平最佳的实验组合为A3B2C2D3，表明土牛膝中的蜕皮甾酮最佳提取工艺为每0.5 g用60倍的30%甲醇超声提取2次，每次1.5 h。
蜕皮甾酮为土牛膝的主要活性成分之一，可用于调整人体内新陈代谢，提高身体的免疫功能，且对炎症、高血糖、抗动脉粥硬化等多种疾病的治疗效果良好而受到广泛关注。本文对土牛膝中的蜕皮甾酮进行正交提取工艺研究，可为土牛膝中蜕皮甾酮的制备及土牛膝的进一步开发利用提供参考。
参 考 文 献
[1]国家药典委员会.中国药典（Ⅴ部）[M].北京：化学工业出版社，2015：418.
[2]钟鸣，韦松基.常用壮药临床手册[M].南宁：广西科学技术出版社，2010：292-293.
[3]何显玲.牛膝与川牛膝及土牛膝鉴别应用[J].实用中医药杂志，2013，29（2）：136-137.
[4]魏得良，黄志芳，黄志红，等.土牛膝水煮液对正常及四氧嘧啶糖尿病模型小鼠血糖的影响[J].中外医疗，2010，24（1）：8-9.
[5]李晓亮，邵旭，何万龙，等.预防治疗呼吸道、泌尿系统感染的土牛膝酮苷药物及其制剂、制备方法[P].中国专利：CN102406673A，2012-04-11.
[6]张然，熊文梅，涂学志，等.复方土牛膝合剂抗菌和抗病毒作用的实验研究[J].抗感染药学，2006，3（3）：136-138.
[7]张庆远，夏西超，王中晓，等.20-羟基蜕皮甾酮对Ⅰ型糖尿病小鼠葡萄糖激酶和肿瘤坏死因子-α表达的影响[J].现代预防医学，2015，42（16）：2989-2992. [责任编辑：钟声贤]