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摘 要 将植物组织培养过程中的外植体消毒这一过程分为浸泡、擦拭、冲洗及初步消毒等9个模块，不同的模块组合与重复实验证明该方法可操作性强，比常规消毒方法效果显著。
关键词 外置体；消毒；污染；模块
中图分类号：Q94 文献标识码：A 文章编号：1671-7597（2013）16-0142-02
在植物组织培养研究中，有效无菌外植体的获得是最为关键的一步，如果处理不当，会造成培养物的污染和褐化，导致整个试验的失败。而不同的外植体需要不同的处理手段、流程与时间，对于初学者来说并不太容易把握。该研究利用最为常见的试剂及器材，将外植体消毒的不同步骤模块化和标准化并对其效果进行了研究。
1 外植体消毒过程的模块与操作标准
1.1 外植体清洗
1.1.1 浸泡
根据洁净程度将材料浸泡于含有0.1%-1%餐洗净的纯净水中5 min-15 min。整个材料要完全处于洗涤剂溶液中，水温要比室温高5℃-10℃。
1.1.2 擦拭
而后用软毛刷或少量脱脂棉蘸取洗涤液轻轻擦拭材料表面。不可造成材料划伤或挤压。受伤的材料应弃去不用。
1.1.3 冲洗
擦拭好的材料置于流水中15 min-30 min，污染严重的材料可延长至1 h。水流不可过大过急，材料在容器中能够不停随水流翻转即可。内生菌严重的材料可冲洗12 h以上。
1.2 外植体消毒
1.2.1 初步消毒
外植体用漂白粉饱和上清液浸泡10 min-15 min。对于表面有蜡质或细小绒毛的外植体可浸没于0.2%的84消毒液中处理15 min-30 min。时间不可随意延长。
1.2.2 酒精浸泡
一般实验材料浸泡于70%酒精中30 s-40 s，其间不断摇匀，剩余5 s-10 s时将酒精倒出。对于种子及木质化材料可延长至1 min-5 min。从该步开始在超净工作台上进行，时间不可随意延长。
1.2.3 升汞浸泡
一般实验材料于0.1%Hgcl2溶液中浸泡5 min-10 min，其间不断摇匀。
1.2.4 漂洗
将从消毒液中取出的外植体置于无菌蒸馏水中漂洗30 s，水要没过外植体，其间不断摇匀。可重复。
1.3 外植体接种
1.3.1 液体预培养
将2层无菌滤纸平铺于灭菌后的培养皿中，加入适量液体培养基浸润滤纸。将消毒好的外植体平放在滤纸上，密封后于25℃，黑暗培养3天。
1.3.2 固体培养
预培养结束后，将外植体接种于固体培养基中于正常光照下培养。
2 模块组合实例操作
将各模块编号A-I列于表1，操作顺序为A至I。大多参考文献中外植体的清洗消毒的方法为：C-E-G-F-G-I，标记为参照方法。
2.1 材料与方法
2.1.1 材料
供试材料绿菊花草及蓝莓由本实验室保存。茎段作为外植体备用。
2.1.2 方法
将外置体经过不同模块组合消毒处理后，接种于MS+1mg/L 2，4-D+20g/L蔗糖（固体培养基再加入7 g/L琼脂粉），分别于1天、3天、7天、10天、15天观察分析外植体的污染情况，。
模块组合1：A-B-C-D-E-F-3G-H-I
模块组合2：A-B-C-E-F-3G-H-I
模块组合3：C-D-E-F-3G-H-I
模块组合4：A-B-C-D-E-2（F-3G-H）-I
模块组合5：A-B-C-D-E-3（F-3G-H）-I
模块组合6：A-B-C-D-E-4（F-3G-H）-I
污染率（%）=（污染外植体数/接种外植体数）×100%
2.2 结果与分析
经过不同模块消毒处理后外植体的污染情况如图1及图2所示。从中可以看出随着培养时间的增加，污染率也在递增，参照方法及模块组合1-3第15天统计时污染率都达到100%。模块A和B有会无影响最初培养时的污染率，具备A和B模块的组合（1、3、4、5、6）都低于20%。组合3表明，缺失模块D会使培养第1天的污染率增加。而随着F-3G-H组合的增加，7天后的污染率呈下降趋势。
H模块的作用在于增加培养液的流通性，提高使初始培养物的成活率，同时也便于外植体从滤纸上取下再次消毒。从上述分析可以看出，A-I这9个模块中，A、B和D可以减少初始培养的污染率。而F-3G-H组合可以降低后期污染的水平。
3 讨论
在植物组织培养中内源菌较难控制，一般的消毒方法是不能完成的。可通过先对外植体植物进行预处理，并以此为基础，改进消毒方法。本试验选取的植物材料绿菊花草为水生植物，此类植物都普遍存在内生菌问题，这也是导致后期污染率升高的原因。F-3G-H组合虽然可以有效降低污染率，但同时也提高了褐化率，但仍不失为减少内生菌污染的有效方法。此外，模块组合1可以对一般来源外植体进行有效消毒，成功率在90%以上（另文叙述），步骤虽多但可操作性强。
基金项目
济宁市科技发展计划项目（kk2009005）
参考文献
[1]胡凯，张立军，白雪梅，等.植物组织培养污染原因分析及外植体的消毒[J].安徽农业科学，2007，35（3）：680-68.
[2]王清连.植物组织培养[M].北京：中国农业出版社，2004：20.
[3]王蒂.植物组织培养[M].北京：中国农业出版社，2004：28-30.
[4]邓小梅.植物组织培养过程中污染现象的研究进展[J].北方园艺，2006（6）：68-72.
[5]孙月芳，陸瑞菊，周润梅，等.观赏水草的离体培养[J].上海农业学报，2004，20（2）：17-19.
关键词 外置体；消毒；污染；模块
中图分类号：Q94 文献标识码：A 文章编号：1671-7597（2013）16-0142-02
在植物组织培养研究中，有效无菌外植体的获得是最为关键的一步，如果处理不当，会造成培养物的污染和褐化，导致整个试验的失败。而不同的外植体需要不同的处理手段、流程与时间，对于初学者来说并不太容易把握。该研究利用最为常见的试剂及器材，将外植体消毒的不同步骤模块化和标准化并对其效果进行了研究。
1 外植体消毒过程的模块与操作标准
1.1 外植体清洗
1.1.1 浸泡
根据洁净程度将材料浸泡于含有0.1%-1%餐洗净的纯净水中5 min-15 min。整个材料要完全处于洗涤剂溶液中，水温要比室温高5℃-10℃。
1.1.2 擦拭
而后用软毛刷或少量脱脂棉蘸取洗涤液轻轻擦拭材料表面。不可造成材料划伤或挤压。受伤的材料应弃去不用。
1.1.3 冲洗
擦拭好的材料置于流水中15 min-30 min，污染严重的材料可延长至1 h。水流不可过大过急，材料在容器中能够不停随水流翻转即可。内生菌严重的材料可冲洗12 h以上。
1.2 外植体消毒
1.2.1 初步消毒
外植体用漂白粉饱和上清液浸泡10 min-15 min。对于表面有蜡质或细小绒毛的外植体可浸没于0.2%的84消毒液中处理15 min-30 min。时间不可随意延长。
1.2.2 酒精浸泡
一般实验材料浸泡于70%酒精中30 s-40 s，其间不断摇匀，剩余5 s-10 s时将酒精倒出。对于种子及木质化材料可延长至1 min-5 min。从该步开始在超净工作台上进行，时间不可随意延长。
1.2.3 升汞浸泡
一般实验材料于0.1%Hgcl2溶液中浸泡5 min-10 min，其间不断摇匀。
1.2.4 漂洗
将从消毒液中取出的外植体置于无菌蒸馏水中漂洗30 s，水要没过外植体，其间不断摇匀。可重复。
1.3 外植体接种
1.3.1 液体预培养
将2层无菌滤纸平铺于灭菌后的培养皿中，加入适量液体培养基浸润滤纸。将消毒好的外植体平放在滤纸上，密封后于25℃，黑暗培养3天。
1.3.2 固体培养
预培养结束后，将外植体接种于固体培养基中于正常光照下培养。
2 模块组合实例操作
将各模块编号A-I列于表1，操作顺序为A至I。大多参考文献中外植体的清洗消毒的方法为：C-E-G-F-G-I，标记为参照方法。
2.1 材料与方法
2.1.1 材料
供试材料绿菊花草及蓝莓由本实验室保存。茎段作为外植体备用。
2.1.2 方法
将外置体经过不同模块组合消毒处理后，接种于MS+1mg/L 2，4-D+20g/L蔗糖（固体培养基再加入7 g/L琼脂粉），分别于1天、3天、7天、10天、15天观察分析外植体的污染情况，。
模块组合1：A-B-C-D-E-F-3G-H-I
模块组合2：A-B-C-E-F-3G-H-I
模块组合3：C-D-E-F-3G-H-I
模块组合4：A-B-C-D-E-2（F-3G-H）-I
模块组合5：A-B-C-D-E-3（F-3G-H）-I
模块组合6：A-B-C-D-E-4（F-3G-H）-I
污染率（%）=（污染外植体数/接种外植体数）×100%
2.2 结果与分析
经过不同模块消毒处理后外植体的污染情况如图1及图2所示。从中可以看出随着培养时间的增加，污染率也在递增，参照方法及模块组合1-3第15天统计时污染率都达到100%。模块A和B有会无影响最初培养时的污染率，具备A和B模块的组合（1、3、4、5、6）都低于20%。组合3表明，缺失模块D会使培养第1天的污染率增加。而随着F-3G-H组合的增加，7天后的污染率呈下降趋势。
H模块的作用在于增加培养液的流通性，提高使初始培养物的成活率，同时也便于外植体从滤纸上取下再次消毒。从上述分析可以看出，A-I这9个模块中，A、B和D可以减少初始培养的污染率。而F-3G-H组合可以降低后期污染的水平。
3 讨论
在植物组织培养中内源菌较难控制，一般的消毒方法是不能完成的。可通过先对外植体植物进行预处理，并以此为基础，改进消毒方法。本试验选取的植物材料绿菊花草为水生植物，此类植物都普遍存在内生菌问题，这也是导致后期污染率升高的原因。F-3G-H组合虽然可以有效降低污染率，但同时也提高了褐化率，但仍不失为减少内生菌污染的有效方法。此外，模块组合1可以对一般来源外植体进行有效消毒，成功率在90%以上（另文叙述），步骤虽多但可操作性强。
基金项目
济宁市科技发展计划项目（kk2009005）
参考文献
[1]胡凯，张立军，白雪梅，等.植物组织培养污染原因分析及外植体的消毒[J].安徽农业科学，2007，35（3）：680-68.
[2]王清连.植物组织培养[M].北京：中国农业出版社，2004：20.
[3]王蒂.植物组织培养[M].北京：中国农业出版社，2004：28-30.
[4]邓小梅.植物组织培养过程中污染现象的研究进展[J].北方园艺，2006（6）：68-72.
[5]孙月芳，陸瑞菊，周润梅，等.观赏水草的离体培养[J].上海农业学报，2004，20（2）：17-19.