【摘 要】
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目的 构建潜在相关肽(LAP)为潜伏位点,基质金属蛋白酶(MMP)切位点为导向位点,转化生长因子(TGF)-β3活性部分(mTGF-β3)为治疗位点的具有靶向治疗作用的新型TGF-β3融合蛋白L
【机 构】
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华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科
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目的 构建潜在相关肽(LAP)为潜伏位点,基质金属蛋白酶(MMP)切位点为导向位点,转化生长因子(TGF)-β3活性部分(mTGF-β3)为治疗位点的具有靶向治疗作用的新型TGF-β3融合蛋白LAP-MMP-mTGF-β3,并转染大鼠来源的骨髓基质干细胞(MSCs),并检验其特异性的靶向治疗作用.方法 将人工合成的编码MMP酶切位点氨基酸的正反义DNA序列经基因重组定向克隆插入真核表达载体pIRES-EGFP中,获得pIRES-EGFP-MMP重组体,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从大鼠胚胎组织中获取TGF-β3的LAP(781 bp)段和TGF-β3的活性片段mTGF-β3(313bp),分别插入pIRES-EGFP-MMP中MMP的上游和下游,获得pIRES-EGFP-LAP-MMP-mTGF-β3重组质粒.然后将其转染入大鼠来源的MSCs,将转染后的MSCs在有MMP-1和无MMP-1的条件下进行球团培养,分别于第7、14、21天检测胶原2(COLⅡ),Aggrecan(Agc)和TIPM的表达.结果 经过测序和酶切鉴定,构建pIRES-EGFP-LAP-MMP-mTGF-β3质粒;转染MSCs后,我们成功获得了LAP-MMP-mTGF-β3融合蛋白(39 kDa)的表达,并验证了其只有在MMP酶环境中才能被激活生成具有生物学效应的特异性的mTGF-β3二聚体(22.2 kDa);球团培养中,MMP酶存在的条件下第21天COLⅡ、Agc、TIPM的相对表达量分别为1.45±0.07、1.61±0.09、1.80±0.08,无MMP酶存在的条件下第21天COLⅡ、Agc、TIPM的相对表达量分别为0.42±0.09、0.38±0.15、0.27±0.07.结论 构建了一种新型具有靶向治疗作用的融合蛋白LAP-MMP-mTGF-β3.
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