【摘 要】
：
目的:为提高CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)靶向性奠定基础,同时证明酵母杂交系统在研究CRISPR/Cas
论文部分内容阅读
目的:为提高CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)靶向性奠定基础,同时证明酵母杂交系统在研究CRISPR/Cas9脱靶效应中的应用价值.方法:以实验室前期构建成功的activase基因编辑水稻株为研究对象,先采用T7核酸内切酶Ⅰ法初步预测30株基因编辑水稻株的脱靶率.随后以酵母杂交系统进一步预测脱靶率以及研究sgRNA结构对脱靶率的影响.首先,将activase靶向基因的标准sgRNA(standard sgRNA)和短sgRNA(truncated sgRNA)分别克隆至CRISPR/Cas9系统表达载体pDW3769中,构建对应的重组载体pHZ2和pHZ4,转化至YPH499酵母单倍体形成重组酵母YpHZ2和YpHZ4;其次,根据脱靶位点预测选择7组脱靶序列A、B、C、D、E、F、G以及靶向序列,分别克隆至包含报告基因mCherry的高拷贝载体pDW3133和低拷贝载体pDW3134,构建相应的高拷贝重组载体pHZ5、pHZ7、pHZ9、pHZ11、pHZ13、pHZ15、pHZ17和pHZ19,以及对应的低拷贝重组载体pHZ6、pHZ8、pHZ10、pHZ12、pHZ14、pHZ16、pHZ18和pHZ20,转化至YPH500酵母单倍体,构建重组酵母YpHZ5-20.随后,重组酵母YpHZ2和YpHZ4与重组酵母YpHZ5-20分别杂交,挑取双倍体酵母菌落,在不同的时间段下检测荧光数值,根据荧光值定量预测脱靶率.结果:酵母培养144～192 h时荧光最为显著,脱靶序列sgRNA与靶向基因sgRNA同源性越高,越易造成脱靶,但短sgRNA较标准sgRNA脱靶率低.根据水稻植株的脱靶检测显示脱靶率约20％,基于酵母杂交的检测结果显示脱靶率为20％～28％.结论:酵母细胞进入稳定期时荧光值最为显著,且与载体的拷贝数量成正比.sgRNA序列以及长短结构可影响CRISPR/Cas9的基因靶向性.两种方法的脱靶率预测结果相当,表明酵母杂交系统在评价CRISPR/Cas9系统的脱靶率以及研究脱靶影响因素中具有良好的应用价值.
其他文献
人参皂苷是我国传统中药人参的主要活性物质,稀有人参皂苷相较人参皂苷具有更好的生物活性,也更利于身体吸收,具有镇静催眠、促进细胞分化增殖、抗肿瘤、降血糖、提升免疫力等作用。然而,稀有人参皂苷结构复杂且在人参中含量极低,限制了其开发利用。随着生物技术的发展,利用生物法合成稀有人参皂苷成为本领域的研究热点。因此,对近年来生物合成稀有人参皂苷研究进行汇总梳理,总结稀有人参皂苷的主要种类结构及近年来生物转化法和异源合成法合成稀有人参皂苷的研究进展,生物转化法汇总了以人参皂苷为底物的转化生物,异源合成法总结人参皂苷的
为解决水波优化算法的全局搜索能力较弱和收敛速度较慢的问题,提出基于莱维飞行和自适应权重的水波优化算法,利用莱维飞行和自适应权重改进水波跳跃公式.采用莱维飞行使得水
抗生素抗性基因作为一种新型环境污染物,对生态环境安全和人类健康有严重的威胁。目前对抗生素抗性基因的研究大多是对城市土壤、污泥、农田土壤等受人为干扰较多的环境开展。然而,人为干扰少的土壤中抗性基因的背景值研究仍较为缺乏。针对贡嘎山不同海拔高度的土壤,采用高通量实时荧光定量PCR的方法,研究了其抗生素抗性基因和可移动遗传元件的多样性及丰度特征,并探究其与环境因子的相关性。结果发现:(1)贡嘎山海拔在2948~3651 m的7个土壤样品,共检测到132种不同的抗性基因和10种可移动遗传元件。每个样品中的抗性基因
随着新型冠状病毒肺炎(COVID-19)疫情在全球的不断蔓延,开发有效的治疗药物迫在眉睫。中和抗体作为最有希望的新型冠状病毒特异性治疗药物,已经在临床研究中展现很好的治疗效果。对抗新冠病毒单克隆中和抗体药物研发的进展、涉及的主要技术和主要临床试验结果进行了总结,以期为包括COVID-19在内的新发、突发传染病中和抗体药物研发提供参考。
Hot dry rock,as a renewable and sustainable energy source,can alleviate resource shortages and environmental pollution.Based on data from the Qiabuqia geotherma
新型冠状病毒肺炎疫情的全球大流行,对全球公共健康、社会和经济运转造成了重大影响。在药物研发迟滞及疫苗有效性未得到充分验证的情况下,对人群进行大规模的快速筛查,寻找潜在的感染者(尤其是轻症和无症状患者),并进行集中隔离,切断传播途径和保护易感人群是首要的任务。因此对于SARS-CoV-2感染,早期诊断尤为重要。总结现有市场上的新冠病毒抗原快速检测产品,对全球抗原快速检测市场进行分析,概述其研发的动向并展望了我国在新冠抗原检测新方法、新技术方面的自主创新能力。
为寻找天然、广谱及抗菌效果较好的抗菌物质,以短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)为研究材料,采用硫酸铵分级沉淀、DEAE-52阴离子交换层析、Sephadex G-100、SDS-PAGE和HPLC-MS/MS等方法对其所产的抗菌蛋白进行分离纯化及鉴定,结果显示该抗菌蛋白是一种分子量为32 kDa的鞭毛蛋白.进一步对其抗菌性能进行研究,发现该抗菌蛋白的抑菌谱较广,可抑制常见的食源性致病菌和植物病害真菌,对蜡样芽孢杆菌、产气大肠杆菌和小麦赤霉菌的抑菌圈分别达到:24.82±0.42 mm
抗体偶联药物(antibody-drug conjugates,ADC)由单克隆抗体和小分子细胞毒药物通过连接子偶联而成,因在血液瘤、实体瘤等临床治疗中被证明是一种极有前景的技术手段,已经成为国内外抗体药物研发的新热门方向。系统阐述了ADC药物开发及工业化生产中的核心五要素,对国内ADC的研发管线进行了梳理,并对参与ADC研发的核心企业的技术布局情况进行了分析,以期为相关企业的ADC研发方向选择及地区产业决策提供参考。
新冠病毒引发的急性呼吸道传染病造成了全球大流行的新冠肺炎,严重危害世界公共卫生安全,迫切需要研发有效治疗新冠肺炎的药物。综述了疫情暴发初期抗新冠肺炎药物研发的进展,重点介绍“老药新用”、小分子及抗体创新药物研发和中药等。通过“老药新用”研究发现多个老药具有抑制新冠病毒复制作用,其中瑞德西韦、法匹拉韦、氯喹和羟氯喹等进入临床研究,尤其是瑞德西韦成为被美国FDA批准用于新冠肺炎治疗的首个药物。针对新冠病毒识别宿主细胞受体的S蛋白开展的抗体发现和靶向3CL蛋白酶及RNA依赖的RNA聚合酶等新冠病毒复制过
Rotary engine is an ideal electric vehicle range extender.However,the combustion chamber of rotary engine is very narrow and long at the top dead center,which is detrimental to fuel combustion performance.In order to improve its economic and emission perf