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黄曲霉毒素M1(AflatOxin M1，AFMD是黄曲霉毒素中一种二氢呋喃杂萘邻酮衍生物，主要是由于奶牛食用了被黄曲霉毒素B1(Aflatoxln B1，AFBI)污染的饲料后，AFB，在奶牛体内代谢产生的羟基化代谢物，转化反应式如图1。AFMM1毒性强、对人体危害大，1993年WHO将AFM，归为对人类||类致癌物，其毒性是氰化钾的10倍，砒霜的68倍，主要危害的部位在肝脏。
AFM1很难降解，其熔点(裂解温度)为299℃对光、热和酸都比较稳定。牛奶加工常用的三种热处理方法
巴氏杀菌法(LTLT，63℃保持30min)、高温快速巴氏杀菌(HTST，72℃保持15s)和超高温灭菌(UHT，135℃保持1～2s)均不能破坏其毒性。因此，生鲜乳中存在的AFM1会导致乳制品中也含有AFM1。许多国家、国际组织依据本国国情制定了牛奶中AFM1的限量标准，并就AFM1的检测方法开展了许多研究工作。本文对不同国家、国际组织对牛奶中AFM1限量值进行了比对分析，并重点对其检测方法进行了综述，以期对我国奶业生产者和政府监管部门起到定借鉴作用，切实保证我国牛奶中的AFM1安全。牛奶中AFM1的限量
AFM1限量的确定是法律法规制定和风险控制的关键内容。牛奶中AFM1限量取决于科学、社会和经济方面的诸多因素，主要包括危害分析、暴露分析结果、抽样方案和方法、分析方法、贸易协调、国内食品供应6因素。这些因素都能制约AFM1限量值的确定，其中危害分析和暴露分析是风险评估内容，是风险评估中最重要的部分：抽样方案、方法和分析方法是确定限量值的实验手段，是获得真实数据的保证：贸易协调和国内食品供应是社会经济因素。这些因素相互影响。制约，综合地决定牛奶中AFM，限量值。
截至2004年底，已有60个国家制定了AFM1的限量值。牛奶中AFM1限量值采用0.05g／kg的国家最多，为34个其中绝大部分国家是欧盟成员国以及与欧盟有贸易的非洲、亚洲、拉丁美洲部分国家，欧盟对婴幼儿配方食品，包括婴幼儿配方牛奶限量0.025ug／kg。另个限量值为0.5ug／kg，有22个国家，包括美国、中国以及若干亚洲和欧洲国家。还有4个国家分别采用15、5、0.2“g／kg以及不得检出。一些主要国家牛奶中AFMI的限量标准见表1。饲料中黄曲霉毒素含量过高。发霉的谷物作为饲料饲喂奶牛后，24小时后便可在奶中检出AFM1。由于饲料原料很容易出现黄曲霉毒素污染，尤其是玉米和花生，因此目前各个国家对饲料中的黄曲霉毒素B1，以及牛奶中的黄曲霉毒素M1都有所限量，却不能要求完全不可检出。黄曲霉毒素被奶牛食用后，一部分会蓄积在动物的体内，另一部分则会转化到乳汁和尿液中。因此，为了保证牛奶中的黄曲霉毒素M1不超过0.5g／kg，美国食品和药品监督管理局(FDA)规定饲料中的黄曲霉毒素B1不得超过30g／kg。我国GB 13078-2001《饲料卫生标准》对饲料中的黄曲霉毒素B，限量也有着严格要求，见表2。
牛奶中AFM1的检测方法
牛奶中A FM1的检测程序
般包括样品的制备、AFM1的提取、提取物的净化和最终的定性、定量测定。牛奶中AFM1的定量定性分析方法主要有薄层色谱分析法(ThinLayer Ch romatog raphy,TLC)、高效液相色谱法(High Performance LiquidChromatography,HPLC)、液相色谱质谱法(Liquid Chromatog raphy with MassSpectrometry，LC MS)和快速法。
1 TLC法
TLC法是通过肉眼比较定性或者半定量的检测方法。样品经提取、浓缩、薄层分离后，AFMI在波长365nm的紫外光下产生蓝紫色荧光，根据其在薄层板上显示荧光的最低检出量与标准溶液的荧光强度相比较来测定含量。
TLC法是牛奶中黄曲霉毒素M，测定的官方规定方法之，GB 5009，242010食品中黄曲霉毒素M1和B，的测定、ISO 14674：2005(1DF 190：2005)牛奶和奶粉黄曲霉毒素M1的测定、AOAC974.17乳制品中黄曲霉毒素M1的测定和AOAC 980 21牛奶和奶酪黄曲霉毒素M1的测定就是TLC法。随着HPLC和LC-MS的发展，TLc应用程度有所下降，但由于其不依赖特殊仪器，成本低、操作简单快速，仍被用于大规模的筛查研究中。
2 HPLC法
HPLC法利用免疫亲和柱或C1 8柱净化后，HPLC串联不同检测器，如荧光(Fluo rescence Detection，FLD)、质谱(MassSpectrometry，MS)等的定量测定被广泛用于牛奶中AFM1的检测。
(1)HPLCFLD
用c18柱抽提纯化样品中的AFM，乙醚对c18柱洗涤，再用CH2C12醇洗脱AFM1，然后加入三氟乙酸(TFA)对AFMI进行衍生化处理，利用液相色谱荧光检测器检测，并与标准AFM1-TFA的衍生物比较，进行定性、定量分析。此法利用了牛奶中AFM，具有较强的发射荧光特性，具有灵敏性高、选择性强、价格经济、易于操作优点。我国GB 5413 37201 0乳和乳制品中黄曲霉毒素M，的测定(第二法免疫亲和层析净化高效液相色谱法)、GB／T 2321 2 2008牛奶和奶粉中黄曲霉毒素B1、B、G1、G、M1和M：的测定，XAOAC 2000，。8液态奶黄曲霉毒素M1含量的测定采用的就是LC FLD或HPLC FLD法。
(2)HPLC MS
由于AFMl的分离和检测条件致，电喷射(Efficient_lectrospray，ESl)、大气压化学电离(Atmospheric PressureChemical lonlzatlon，APCI)等技术应用于LC MS，质谱分析仪器领域的发展等 原因，MS检测器具有更高的选择性、对分析物分子标识的确证、可用同位素标记作为内标等优势，HPLC MS广泛应用于AFM1的检测中。ISO 14501：2007IDF171：2007)牛奶和奶粉黄曲霉毒素M1含量的测定和我国GB 5413.37-201 乳和乳制品中黄曲霉毒素M，的测定(第法免疫亲和层析净化液相色谱串联质谱法)采用的就LC MS法检测奶中的黄曲霉毒素M1。
3
快速法
快速法又称扫描法，是定性或半定量方法。定性的阈值是限量值，各国不同。现场快速的检测对于质量安全监管具有重要的意义。酶联免疫吸附测定法(Enzyme Linked lmmuno SorbentAssay，刚SA)、单克隆抗体试剂盒法、双流向酶联免疫吸附法(SNAP)、胶体盒法等半定量技术无需对牛奶进行前处理，检测时间短、操作方法简单且不依赖于任何仪器，被广泛地应用于牛奶，尤其是生乳的检测中。
(1)ELISA法
ELISA法原理是：样品中的AFMI与定量特异性抗体反应，多余的游离抗体与酶标板内的包被抗原结合，加入酶标记物和底物后显色，与标准比较来测定含量。该方法灵敏度高，特异性强，检测结果稳定准确，实验操作污染少，一次实验可检测多个样品。该方法灵敏度高、易操作，可用于现场检测。
对于乳及乳制品中AFMl的检测，我国DB33／T 556 2005乳和乳粉中黄曲霉毒素M1的测定使用酶联免疫吸附法和ISO 14675：2003(1DFl86：2003)牛奶和牛奶制品竞争酶联免疫分析的标准化描述指南黄曲霉毒素M，含量的测定即为ELISA法。
(2)单克隆抗体试剂盒法
单克隆抗体试剂盒是一种建立在以单克隆抗体技术与ELISA技术的基础上，针对原料奶中黄曲霉毒素M1，的快速检测的试剂盒，该方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等特点。
(3)胶体金法
此法基于竞争法胶体金免疫层析技术，用于快速筛查含有AFM1的液态奶、奶粉(含婴儿奶粉)和饲料等样品。将检测样品液加入速测卡上的样品孔，检测液中的AFM1与金标卡上的金标抗体结合形成复合物，若AFM1在检测液中浓度低于设定检测灵敏度值(阴性样本)，未结合的金标抗体流到T区时，被固定在膜上的抗原捕获，形成条可见的T线；若AFM，浓度高于设定检测灵敏度值，金标抗体即与AFMl全部形成复合物，不再与T线处抗原结合，T线不可见。C线为质控线，出现则说明该速测卡有效。
(4)SNAP法
利用酶联免疫竞争原理，样品中残留的黄曲霉毒素M1与定量特异性酶标抗体反应，多余的游离酶标抗体则与酶标板内的包被抗原结合，通过流动洗涤，加入酶显色底物显色后，与标准点比较定性。GB 5413.372010乳和乳制品中黄曲霉毒素M1的测定(第四法)和NY 1664-2008牛乳中黄曲霉毒素M1的测定均采用此法。总结
近年来，由于多级质谱(Multistage Mass Spectrometry，MS)的发展，HPLC-MS／MS法可对牛奶中多种霉菌毒素同时进行检测，且无须衍生化。该法预处理简单、检测速度快、灵敏度高的优点，可适用于复杂基质样品中多组分霉菌毒素的确认和准确定量检测。此外，乳及乳制品特别是生乳的贮存条件特殊，不宜长时间运输贮存，快速检测对大规模监测具有重要意义。同时，快速的现场检测可以提高检测效率，加大监测范围和力度，保证牛奶质量安全。但快速法筛选出的阳性或超标样品需要HPLC法、HPLC-MS法等定量法的进
步确证。
(基金项目：农业国际合作与交流项目资助；通讯作者：郑楠)
AFM1很难降解，其熔点(裂解温度)为299℃对光、热和酸都比较稳定。牛奶加工常用的三种热处理方法
巴氏杀菌法(LTLT，63℃保持30min)、高温快速巴氏杀菌(HTST，72℃保持15s)和超高温灭菌(UHT，135℃保持1～2s)均不能破坏其毒性。因此，生鲜乳中存在的AFM1会导致乳制品中也含有AFM1。许多国家、国际组织依据本国国情制定了牛奶中AFM1的限量标准，并就AFM1的检测方法开展了许多研究工作。本文对不同国家、国际组织对牛奶中AFM1限量值进行了比对分析，并重点对其检测方法进行了综述，以期对我国奶业生产者和政府监管部门起到定借鉴作用，切实保证我国牛奶中的AFM1安全。牛奶中AFM1的限量
AFM1限量的确定是法律法规制定和风险控制的关键内容。牛奶中AFM1限量取决于科学、社会和经济方面的诸多因素，主要包括危害分析、暴露分析结果、抽样方案和方法、分析方法、贸易协调、国内食品供应6因素。这些因素都能制约AFM1限量值的确定，其中危害分析和暴露分析是风险评估内容，是风险评估中最重要的部分：抽样方案、方法和分析方法是确定限量值的实验手段，是获得真实数据的保证：贸易协调和国内食品供应是社会经济因素。这些因素相互影响。制约，综合地决定牛奶中AFM，限量值。
截至2004年底，已有60个国家制定了AFM1的限量值。牛奶中AFM1限量值采用0.05g／kg的国家最多，为34个其中绝大部分国家是欧盟成员国以及与欧盟有贸易的非洲、亚洲、拉丁美洲部分国家，欧盟对婴幼儿配方食品，包括婴幼儿配方牛奶限量0.025ug／kg。另个限量值为0.5ug／kg，有22个国家，包括美国、中国以及若干亚洲和欧洲国家。还有4个国家分别采用15、5、0.2“g／kg以及不得检出。一些主要国家牛奶中AFMI的限量标准见表1。饲料中黄曲霉毒素含量过高。发霉的谷物作为饲料饲喂奶牛后，24小时后便可在奶中检出AFM1。由于饲料原料很容易出现黄曲霉毒素污染，尤其是玉米和花生，因此目前各个国家对饲料中的黄曲霉毒素B1，以及牛奶中的黄曲霉毒素M1都有所限量，却不能要求完全不可检出。黄曲霉毒素被奶牛食用后，一部分会蓄积在动物的体内，另一部分则会转化到乳汁和尿液中。因此，为了保证牛奶中的黄曲霉毒素M1不超过0.5g／kg，美国食品和药品监督管理局(FDA)规定饲料中的黄曲霉毒素B1不得超过30g／kg。我国GB 13078-2001《饲料卫生标准》对饲料中的黄曲霉毒素B，限量也有着严格要求，见表2。
牛奶中AFM1的检测方法
牛奶中A FM1的检测程序
般包括样品的制备、AFM1的提取、提取物的净化和最终的定性、定量测定。牛奶中AFM1的定量定性分析方法主要有薄层色谱分析法(ThinLayer Ch romatog raphy,TLC)、高效液相色谱法(High Performance LiquidChromatography,HPLC)、液相色谱质谱法(Liquid Chromatog raphy with MassSpectrometry，LC MS)和快速法。
1 TLC法
TLC法是通过肉眼比较定性或者半定量的检测方法。样品经提取、浓缩、薄层分离后，AFMI在波长365nm的紫外光下产生蓝紫色荧光，根据其在薄层板上显示荧光的最低检出量与标准溶液的荧光强度相比较来测定含量。
TLC法是牛奶中黄曲霉毒素M，测定的官方规定方法之，GB 5009，242010食品中黄曲霉毒素M1和B，的测定、ISO 14674：2005(1DF 190：2005)牛奶和奶粉黄曲霉毒素M1的测定、AOAC974.17乳制品中黄曲霉毒素M1的测定和AOAC 980 21牛奶和奶酪黄曲霉毒素M1的测定就是TLC法。随着HPLC和LC-MS的发展，TLc应用程度有所下降，但由于其不依赖特殊仪器，成本低、操作简单快速，仍被用于大规模的筛查研究中。
2 HPLC法
HPLC法利用免疫亲和柱或C1 8柱净化后，HPLC串联不同检测器，如荧光(Fluo rescence Detection，FLD)、质谱(MassSpectrometry，MS)等的定量测定被广泛用于牛奶中AFM1的检测。
(1)HPLCFLD
用c18柱抽提纯化样品中的AFM，乙醚对c18柱洗涤，再用CH2C12醇洗脱AFM1，然后加入三氟乙酸(TFA)对AFMI进行衍生化处理，利用液相色谱荧光检测器检测，并与标准AFM1-TFA的衍生物比较，进行定性、定量分析。此法利用了牛奶中AFM，具有较强的发射荧光特性，具有灵敏性高、选择性强、价格经济、易于操作优点。我国GB 5413 37201 0乳和乳制品中黄曲霉毒素M，的测定(第二法免疫亲和层析净化高效液相色谱法)、GB／T 2321 2 2008牛奶和奶粉中黄曲霉毒素B1、B、G1、G、M1和M：的测定，XAOAC 2000，。8液态奶黄曲霉毒素M1含量的测定采用的就是LC FLD或HPLC FLD法。
(2)HPLC MS
由于AFMl的分离和检测条件致，电喷射(Efficient_lectrospray，ESl)、大气压化学电离(Atmospheric PressureChemical lonlzatlon，APCI)等技术应用于LC MS，质谱分析仪器领域的发展等 原因，MS检测器具有更高的选择性、对分析物分子标识的确证、可用同位素标记作为内标等优势，HPLC MS广泛应用于AFM1的检测中。ISO 14501：2007IDF171：2007)牛奶和奶粉黄曲霉毒素M1含量的测定和我国GB 5413.37-201 乳和乳制品中黄曲霉毒素M，的测定(第法免疫亲和层析净化液相色谱串联质谱法)采用的就LC MS法检测奶中的黄曲霉毒素M1。
3
快速法
快速法又称扫描法，是定性或半定量方法。定性的阈值是限量值，各国不同。现场快速的检测对于质量安全监管具有重要的意义。酶联免疫吸附测定法(Enzyme Linked lmmuno SorbentAssay，刚SA)、单克隆抗体试剂盒法、双流向酶联免疫吸附法(SNAP)、胶体盒法等半定量技术无需对牛奶进行前处理，检测时间短、操作方法简单且不依赖于任何仪器，被广泛地应用于牛奶，尤其是生乳的检测中。
(1)ELISA法
ELISA法原理是：样品中的AFMI与定量特异性抗体反应，多余的游离抗体与酶标板内的包被抗原结合，加入酶标记物和底物后显色，与标准比较来测定含量。该方法灵敏度高，特异性强，检测结果稳定准确，实验操作污染少，一次实验可检测多个样品。该方法灵敏度高、易操作，可用于现场检测。
对于乳及乳制品中AFMl的检测，我国DB33／T 556 2005乳和乳粉中黄曲霉毒素M1的测定使用酶联免疫吸附法和ISO 14675：2003(1DFl86：2003)牛奶和牛奶制品竞争酶联免疫分析的标准化描述指南黄曲霉毒素M，含量的测定即为ELISA法。
(2)单克隆抗体试剂盒法
单克隆抗体试剂盒是一种建立在以单克隆抗体技术与ELISA技术的基础上，针对原料奶中黄曲霉毒素M1，的快速检测的试剂盒，该方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等特点。
(3)胶体金法
此法基于竞争法胶体金免疫层析技术，用于快速筛查含有AFM1的液态奶、奶粉(含婴儿奶粉)和饲料等样品。将检测样品液加入速测卡上的样品孔，检测液中的AFM1与金标卡上的金标抗体结合形成复合物，若AFM1在检测液中浓度低于设定检测灵敏度值(阴性样本)，未结合的金标抗体流到T区时，被固定在膜上的抗原捕获，形成条可见的T线；若AFM，浓度高于设定检测灵敏度值，金标抗体即与AFMl全部形成复合物，不再与T线处抗原结合，T线不可见。C线为质控线，出现则说明该速测卡有效。
(4)SNAP法
利用酶联免疫竞争原理，样品中残留的黄曲霉毒素M1与定量特异性酶标抗体反应，多余的游离酶标抗体则与酶标板内的包被抗原结合，通过流动洗涤，加入酶显色底物显色后，与标准点比较定性。GB 5413.372010乳和乳制品中黄曲霉毒素M1的测定(第四法)和NY 1664-2008牛乳中黄曲霉毒素M1的测定均采用此法。总结
近年来，由于多级质谱(Multistage Mass Spectrometry，MS)的发展，HPLC-MS／MS法可对牛奶中多种霉菌毒素同时进行检测，且无须衍生化。该法预处理简单、检测速度快、灵敏度高的优点，可适用于复杂基质样品中多组分霉菌毒素的确认和准确定量检测。此外，乳及乳制品特别是生乳的贮存条件特殊，不宜长时间运输贮存，快速检测对大规模监测具有重要意义。同时，快速的现场检测可以提高检测效率，加大监测范围和力度，保证牛奶质量安全。但快速法筛选出的阳性或超标样品需要HPLC法、HPLC-MS法等定量法的进
步确证。
(基金项目：农业国际合作与交流项目资助；通讯作者：郑楠)