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摘要
[目的]探讨培养基起始pH、碳源、氮源和发酵温度对高产纤维素酶菌株B.subtilis SD76产酶的影响。[方法]通过正交分析确定菌株B.subtilis SD76产纤维素酶（CMCase）的最佳培养条件。[结果]菌株B.subtilis SD76产酶的最佳培养条件：培养基初始pH 6.8；培养基稻草粉浓度3.0 g/L；硫酸铵浓度3.5 g/L，发酵温度32 ℃。在最佳培养条件下，该菌株的CMCase活力达到462.34 U。[结论]为提高B.subtilis SD76产纤维素活力和该菌株的工业产酶生产提供一定的参数和应用依据。
关键词纤维素酶；发酵条件；酶活性；正交试验
中图分类号S188；FQ920.1文献标识码A文章编号0517-6611（2015）24-020-02
纤维素是高等植物细胞壁的主要成分，是生物圈中最廉价、最大量永不枯竭的可再生性碳源资源。地球上植物体每年通过光合作用生成数千亿吨有机资源，其中三分之一以上为纤维素资源。但这些储存的能量和碳，植物体自身并不重复利用，绝大部分纤维素资源如枯枝落叶等只能废弃到环境中，造成了资源的巨大浪费和环境的污染。有效地转化、开发和利用这一丰富天然资源，对于解决工农业原料来源、能源危机、环境污染等具有重要的现实意义。
目前，生物降解是纤维素降解方面研究最经济、环保的方法。但在生物降解应用过程中，除选育高产优良纤维素酶（CMCase）菌株外，产酶发酵条件同样非常重要。即使同一菌种，若培养基类型、实验设备及发酵条件不同，菌种产酶的能力也存在较大差异。对于不同菌种，则产酶差异更大。因此，笔者以大围山原始森林土壤中筛选出一株产纤维素酶活力高的菌株B.subtilis SD76为出发菌，探讨培养基起始pH、碳源、氮源和发酵温度对高产纤维素酶菌株B.subtilis SD76产酶的影响，并通过正交分析确定产纤维素酶的最佳培养条件，以期为提高B.subtilis SD76产纤维素活力和该菌株的工业产酶生产提供一定的参数和应用依据。
1材料与方法
1.1 试验材料
菌种：B. subtilis SD76，分离自云南大围山原始森林土壤。
产酶发酵基础培养基：羧甲基纤维素钠10 g，硫酸铵4 g，磷酸二氢钾2 g，七水合硫酸镁0.5 g，蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，加水至1 000 ml。121 ℃，灭菌30 min后冷却备用。
其他原料：碳源：麸皮，玉米芯，羧甲基纤维素（CMC），玉米秸秆，稻草粉，豆渣。麸皮、玉米芯、玉米秸秆用小型粉碎机进行粉碎，过20目筛后备用。氮源：2.0 g/L牛肉膏，2.0 g/L蛋白胨，4.0 g/L酵母粉，1.5 g/L硫酸铵，2.5 g/L硝酸钠，1.5 g/L氯化铵。
1.2 试验方法
1.2.1
初始pH对B.subtilis SD76产酶的影响。用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液将培养基初始pH分别调制成2.8、3.8、4.8、5.8、6.8、7.8、8.8，接种后于30 ℃恒温培养72 h，测定其酶活力。每组3个平行。
1.2.2
温度对B.subtilis SD76产酶的影响。将接种B.subtilis SD-76后的产酶发酵培养基分别置于24、26、28、30、32、34和36 ℃，恒温培养72 h后，测定其酶活力。每组3个平行。
1.2.3
碳源对B.subtilis SD76产酶的影响。分别以麸皮、玉米芯、CMC、玉米秸秆、稻草粉、豆渣作为唯一碳源，培养基经121 ℃高压灭菌，接种后于30 ℃恒温培养72 h，测定其酶活力。每组3个平行。
1.2.4
氮源对B.subtilis SD76产酶的影响。
分别将牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、硫酸铵、硝酸钠、氯化铵溶解于10 ml水中，分别加入装有10 g稻草粉的250 ml三角瓶中，搅拌均匀，121 ℃灭菌接种后于30 ℃恒温培养箱培养72 h，测定其酶活力。每组3个平行。
1.2.5
发酵培养优化试验。在单因素发酵产酶的基础上，以初始pH、发酵温度、稻草粉浓度、硫酸铵浓度4个因素作为影响菌株B.subtilis SD76发酵生产纤维素酶的主要因子。设计4因素3水平正交试验，因素水平见表1。
1.2.6
纤维素酶活性测定。CMCase酶活的测定参照文献[5]。
1.3数据分析
试验数据采用SPASS 16.0软件进行分析。
2结果与分析
2.1初始pH对B.subtilis SD76产酶的影响
由图1可知，当培养基初始pH在2.8～6.8时，随着pH的升高，菌株B.subtilis SD76产纤维素酶呈上升趋势，当初始pH 6.8时纤维素酶活力达到最大值392.83 U。当培养基初始pH大于6.8后，随着pH的增加菌株B.subtilis SD76产纤维素酶呈下降趋势。因此选择起始pH 6.8。
2.2温度对B.subtilis SD76产酶的影响
由图2可知，当温度在20～30 ℃时，随着发酵温度增加，菌株B.subtilis SD76产纤维素酶呈上升趋势，当发酵温度为30 ℃时纤维素酶活力最高，可达395.47 U。而纤维素酶活力达到最高值后，随发酵温度继续升高则产酶下降。可见发酵温度对产酶效果有明显影响，因此发酵温度选择 30 ℃。
2.3碳源对B.subtilis SD76产酶的影响
由图3可知，所选的几种碳源都能使B.subtilis SD76产酶，但不同的碳源，产酶量不同。产酶量最高的是稻草粉，其次为玉米芯、豆渣、CMC和玉米秸秆，最低的是麸皮。 2.4氮源对B.subtilis SD76产酶的影响
由图4可知，所选用的几种氮源都能使B.subtilis SD76产酶，但不同的氮源，产酶量不同。其中硫酸铵为氮源能够有效提高产纤维素酶的能力，因此选择硫酸铵作为氮源。
2.5 菌株B.subtilis SD76的最佳产酶条件
对正交试验各摇瓶编号的提取酶液，测定CMCase活性。结果见表2。
由表2可知，以CMCase活力为衡量指标时，初始pH、发酵温度、稻草粉浓度、硫酸铵浓度4个因素对酶活力大小影响次序为A、B、C、D，即影响B. subtilis SD76产酶最大的是培养基初始pH，其次为发酵温度、硫酸铵浓度和稻草粉浓度。B. subtilis SD76产纤维素酶的最佳条件为A3B3C2D3，即发酵最佳条件为pH 6.8，温度32 ℃，稻草粉浓度3.0 g/L，硫酸铵浓度为3.5 g/L，该菌株的酶活达到462.34 U。
3结论
（1）适合该菌株B. subtilis SD76液体摇瓶发酵的碳源为稻草粉；氮源为硫酸铵；培养基初始pH为6.8；发酵温度为30 ℃。在最适pH和最适温度下培养，该菌株的纤维素酶活力分别达到392.83和395.47 U。
（2）菌株B. subtilis SD76的最佳产酶条件为：培养基初始pH为6.8；发酵温度为32 ℃；稻草粉浓度为3.0 g/L；硫酸铵浓度为3.5 g/L。在最佳条件下培养，该菌株的酶活达到462.34 U。
参考文献
[1]
陈洪章，李佐虎.纤维素原料微生物与生物量全利用[J].化工科技市场，2001（5）：17-20.
[2] DUNLAP C E，CHIANG L C.Cellulose degradationa common Link[M]//SHULER M L.Utilization and recycle of agriculture wastes and residues.Boca Raton，Florida：CRC Press Inc，1980.
[3] 薛桥丽，王炜，胡永金，等.堆肥中高温纤维素酶菌株的筛选及其酶性质研究[J].中国酿造，2012，31（1）：30-33.
[4] 陈洪章.纤维素生物技术[M].北京：化学工业出版社，2005.
[5] ACEBAL C，CASTILLON M P，ESTRADA P，et al.Enhanced cellulase production from Trichodermo reesei QM9414 on physically treated wheat straw[J].Appl Microbiol Biotechnol，1986，24：218-223.
[目的]探讨培养基起始pH、碳源、氮源和发酵温度对高产纤维素酶菌株B.subtilis SD76产酶的影响。[方法]通过正交分析确定菌株B.subtilis SD76产纤维素酶（CMCase）的最佳培养条件。[结果]菌株B.subtilis SD76产酶的最佳培养条件：培养基初始pH 6.8；培养基稻草粉浓度3.0 g/L；硫酸铵浓度3.5 g/L，发酵温度32 ℃。在最佳培养条件下，该菌株的CMCase活力达到462.34 U。[结论]为提高B.subtilis SD76产纤维素活力和该菌株的工业产酶生产提供一定的参数和应用依据。
关键词纤维素酶；发酵条件；酶活性；正交试验
中图分类号S188；FQ920.1文献标识码A文章编号0517-6611（2015）24-020-02
纤维素是高等植物细胞壁的主要成分，是生物圈中最廉价、最大量永不枯竭的可再生性碳源资源。地球上植物体每年通过光合作用生成数千亿吨有机资源，其中三分之一以上为纤维素资源。但这些储存的能量和碳，植物体自身并不重复利用，绝大部分纤维素资源如枯枝落叶等只能废弃到环境中，造成了资源的巨大浪费和环境的污染。有效地转化、开发和利用这一丰富天然资源，对于解决工农业原料来源、能源危机、环境污染等具有重要的现实意义。
目前，生物降解是纤维素降解方面研究最经济、环保的方法。但在生物降解应用过程中，除选育高产优良纤维素酶（CMCase）菌株外，产酶发酵条件同样非常重要。即使同一菌种，若培养基类型、实验设备及发酵条件不同，菌种产酶的能力也存在较大差异。对于不同菌种，则产酶差异更大。因此，笔者以大围山原始森林土壤中筛选出一株产纤维素酶活力高的菌株B.subtilis SD76为出发菌，探讨培养基起始pH、碳源、氮源和发酵温度对高产纤维素酶菌株B.subtilis SD76产酶的影响，并通过正交分析确定产纤维素酶的最佳培养条件，以期为提高B.subtilis SD76产纤维素活力和该菌株的工业产酶生产提供一定的参数和应用依据。
1材料与方法
1.1 试验材料
菌种：B. subtilis SD76，分离自云南大围山原始森林土壤。
产酶发酵基础培养基：羧甲基纤维素钠10 g，硫酸铵4 g，磷酸二氢钾2 g，七水合硫酸镁0.5 g，蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，加水至1 000 ml。121 ℃，灭菌30 min后冷却备用。
其他原料：碳源：麸皮，玉米芯，羧甲基纤维素（CMC），玉米秸秆，稻草粉，豆渣。麸皮、玉米芯、玉米秸秆用小型粉碎机进行粉碎，过20目筛后备用。氮源：2.0 g/L牛肉膏，2.0 g/L蛋白胨，4.0 g/L酵母粉，1.5 g/L硫酸铵，2.5 g/L硝酸钠，1.5 g/L氯化铵。
1.2 试验方法
1.2.1
初始pH对B.subtilis SD76产酶的影响。用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液将培养基初始pH分别调制成2.8、3.8、4.8、5.8、6.8、7.8、8.8，接种后于30 ℃恒温培养72 h，测定其酶活力。每组3个平行。
1.2.2
温度对B.subtilis SD76产酶的影响。将接种B.subtilis SD-76后的产酶发酵培养基分别置于24、26、28、30、32、34和36 ℃，恒温培养72 h后，测定其酶活力。每组3个平行。
1.2.3
碳源对B.subtilis SD76产酶的影响。分别以麸皮、玉米芯、CMC、玉米秸秆、稻草粉、豆渣作为唯一碳源，培养基经121 ℃高压灭菌，接种后于30 ℃恒温培养72 h，测定其酶活力。每组3个平行。
1.2.4
氮源对B.subtilis SD76产酶的影响。
分别将牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、硫酸铵、硝酸钠、氯化铵溶解于10 ml水中，分别加入装有10 g稻草粉的250 ml三角瓶中，搅拌均匀，121 ℃灭菌接种后于30 ℃恒温培养箱培养72 h，测定其酶活力。每组3个平行。
1.2.5
发酵培养优化试验。在单因素发酵产酶的基础上，以初始pH、发酵温度、稻草粉浓度、硫酸铵浓度4个因素作为影响菌株B.subtilis SD76发酵生产纤维素酶的主要因子。设计4因素3水平正交试验，因素水平见表1。
1.2.6
纤维素酶活性测定。CMCase酶活的测定参照文献[5]。
1.3数据分析
试验数据采用SPASS 16.0软件进行分析。
2结果与分析
2.1初始pH对B.subtilis SD76产酶的影响
由图1可知，当培养基初始pH在2.8～6.8时，随着pH的升高，菌株B.subtilis SD76产纤维素酶呈上升趋势，当初始pH 6.8时纤维素酶活力达到最大值392.83 U。当培养基初始pH大于6.8后，随着pH的增加菌株B.subtilis SD76产纤维素酶呈下降趋势。因此选择起始pH 6.8。
2.2温度对B.subtilis SD76产酶的影响
由图2可知，当温度在20～30 ℃时，随着发酵温度增加，菌株B.subtilis SD76产纤维素酶呈上升趋势，当发酵温度为30 ℃时纤维素酶活力最高，可达395.47 U。而纤维素酶活力达到最高值后，随发酵温度继续升高则产酶下降。可见发酵温度对产酶效果有明显影响，因此发酵温度选择 30 ℃。
2.3碳源对B.subtilis SD76产酶的影响
由图3可知，所选的几种碳源都能使B.subtilis SD76产酶，但不同的碳源，产酶量不同。产酶量最高的是稻草粉，其次为玉米芯、豆渣、CMC和玉米秸秆，最低的是麸皮。 2.4氮源对B.subtilis SD76产酶的影响
由图4可知，所选用的几种氮源都能使B.subtilis SD76产酶，但不同的氮源，产酶量不同。其中硫酸铵为氮源能够有效提高产纤维素酶的能力，因此选择硫酸铵作为氮源。
2.5 菌株B.subtilis SD76的最佳产酶条件
对正交试验各摇瓶编号的提取酶液，测定CMCase活性。结果见表2。
由表2可知，以CMCase活力为衡量指标时，初始pH、发酵温度、稻草粉浓度、硫酸铵浓度4个因素对酶活力大小影响次序为A、B、C、D，即影响B. subtilis SD76产酶最大的是培养基初始pH，其次为发酵温度、硫酸铵浓度和稻草粉浓度。B. subtilis SD76产纤维素酶的最佳条件为A3B3C2D3，即发酵最佳条件为pH 6.8，温度32 ℃，稻草粉浓度3.0 g/L，硫酸铵浓度为3.5 g/L，该菌株的酶活达到462.34 U。
3结论
（1）适合该菌株B. subtilis SD76液体摇瓶发酵的碳源为稻草粉；氮源为硫酸铵；培养基初始pH为6.8；发酵温度为30 ℃。在最适pH和最适温度下培养，该菌株的纤维素酶活力分别达到392.83和395.47 U。
（2）菌株B. subtilis SD76的最佳产酶条件为：培养基初始pH为6.8；发酵温度为32 ℃；稻草粉浓度为3.0 g/L；硫酸铵浓度为3.5 g/L。在最佳条件下培养，该菌株的酶活达到462.34 U。
参考文献
[1]
陈洪章，李佐虎.纤维素原料微生物与生物量全利用[J].化工科技市场，2001（5）：17-20.
[2] DUNLAP C E，CHIANG L C.Cellulose degradationa common Link[M]//SHULER M L.Utilization and recycle of agriculture wastes and residues.Boca Raton，Florida：CRC Press Inc，1980.
[3] 薛桥丽，王炜，胡永金，等.堆肥中高温纤维素酶菌株的筛选及其酶性质研究[J].中国酿造，2012，31（1）：30-33.
[4] 陈洪章.纤维素生物技术[M].北京：化学工业出版社，2005.
[5] ACEBAL C，CASTILLON M P，ESTRADA P，et al.Enhanced cellulase production from Trichodermo reesei QM9414 on physically treated wheat straw[J].Appl Microbiol Biotechnol，1986，24：218-223.