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摘要：[目的]模拟自然状况下蜜蜂幼虫发育的环境条件，探索可行的饲养模式，建立完整的室内人工饲养蜜蜂幼虫的技术。[方法]以意大利蜜蜂幼虫为研究对象，以幼虫存活率、蛹化率和羽化率为评价指标，探讨日粮配方、虫龄和化蛹板等对幼虫生长发育的影响。[结果]通过筛选获得了比较理想的室内人工培养蜜蜂幼虫的技术，其中幼虫存活率、蛹化率和羽化率均可达到90%以上。[结论]该研究建立了有效、可行的蜜蜂幼虫的饲养技术，为进一步研究典型农药对蜜蜂幼虫毒性的影响奠定了基础。
关键词：农药；幼虫毒性；室内饲养技术
中图分类号：S894 文献标识码：A 文章编号：0517-6611（2016）07-079-02
Abstract：[Objective] Simulating environmental conditions for the development of bee larvae under natural conditions， the feasible breeding mode was explored， the complete indoor artificial cultivation technology for bee larvae was established. [Method] With Italy bee larvae as the research object， larvae survival rate， pupation rate and eclosion rate as evaluation indicators， effects of diet formula， insect age， pupation plate on growth and development of larvae were discussed. [Result] Through screening， the ideal indoor artificial cultivation technology for bee larvaes was obtained， the survival rate， pupation rate and eclosion rate could reach above 90%. [Conclusion] The study establishes an effective， feasible breeding technology for bee larvae， which will lay a foundation for further studying effects of typical pesticides on toxicity of bee larvae.
Key words：Pesticide； Larval toxicity； Indoor breeding technology
蜜蜂以其授粉高效性、采集專一性和种群社会性等优势在许多农作物授粉中发挥着重要作用，是自然界最重要的有益昆虫之一。然而，一些农药杀虫剂的不合理使用不仅会伤害采集蜂，而且对蜂群中的幼虫也具有一定的影响。蜜蜂是典型的真社会性昆虫，具有明确而细致的劳动分工，蜂群中的幼虫食物由专职哺育蜂来提供，而人工对幼虫进行操作，幼虫往往会被工蜂遗弃[1]，并且在自然蜂群中添加杀虫剂来研究其对采集蜂和幼虫的影响时，试验产物易存储于巢脾上影响蜂群繁殖，同时还受到外界蜜源冲淡杀虫剂剂量的影响，造成了人为干预下对蜜蜂幼虫研究的困难。
建立实验室内人工饲养蜜蜂幼虫的技术，是蜜蜂幼虫作为模式生物研究的基础[2-4]，是开展农药对蜜蜂幼虫毒性试验的前提。目前已有的室内饲养技术侧重于饲喂板的新旧和移虫模式[5-8]，忽略了日粮配方、虫龄和化蛹板等方面的影响，导致幼虫成活率、蛹化率及羽化率均偏低。笔者以意
大利蜜蜂幼虫为研究对象，以实验室内其正常发育为目标，
模拟自然状况下蜜蜂幼虫发育的环境条件，探索可行的蜜
蜂幼虫的饲养模式，建立完整的室内人工饲养蜜蜂幼虫的技
术，完善农药对蜜蜂幼虫毒性影响试验的关键技术，旨在为进一步开展典型农药对蜜蜂幼虫毒性影响研究奠定基础。
1：材料与方法
1.1：材料与仪器
1.1.1：试验材料。
意大利蜜蜂、无菌水、鲜蜂王浆、D-果糖、葡萄糖、酵母提取物等。
1.1.2：仪器与耗材。高压灭菌锅、恒温培养箱、48孔细胞培养板、24孔细胞培养板、烘箱、电子天平、移虫针。
1.2：试验方法
1.2.1：不同日粮配方对蜜蜂幼虫存活率的影响。
为获得最佳蜜蜂幼虫饲粮配比，参照OECD237[9]及Vandenberg等[10]的幼虫基础饲粮配方，配制4种蜜蜂幼虫饲粮，以供筛选。4种幼虫日粮（Larval diet，LD）的配方如表1所示。4种日粮分别配制，现用现配。
试验按日粮分为4个处理，每个处理 3个培养板（48 孔）即 3个重复，随机挑取1日龄幼虫进行饲喂。全过程观测幼虫生长状况，测定饲喂至化蛹期幼虫的存活率，观测比较4种日粮的饲喂效果。
1.2.2：
虫龄对幼虫存活率的影响。
试验日粮统一为试验1 中饲喂效果最佳的日粮配方，1日龄前期幼虫（蛋青色）和1日龄后期幼虫（白色）2个处理组，每个处理 3个培养板（48 孔）即 3个重复。全过程观测幼虫生长状况，测定饲喂至化蛹期幼虫的存活率，比较2种虫龄的发育效果。
1.2.3：不同化蛹板对幼虫发育的影响。
化蛹板的目的是让即将化蛹的幼虫在无菌的情况下蛹化。为获得最佳化蛹条件，试验设置2个处理组，1个处理组在24孔培养板孔内垫干燥的无菌擦镜纸，另1个处理组为空白24孔培养板。试验日粮统一为试验1 中饲喂效果最佳的日粮配方，挑取试验2 中饲喂效果最佳的虫龄进行饲喂，然后将进入排便期即将化蛹的幼虫（预蛹）用移虫针移入化蛹板孔中，每孔1 只。此后，不再移动虫体，幼虫可在孔中完成排便、吐丝和化蛹的过程，最后羽化为成蜂。测定化蛹率和羽化率，比较2种化蛹板的效果。 2：结果与分析
2.1：不同日粮配方对幼虫存活率的影响：
在饲喂过程中发现，饲喂LD1、LD2和LD3日粮的幼虫生长不佳，幼虫在移植到培养板 3 d左右死亡，个别幼虫在发育到蛹期后停止发育，然后死亡。由表2可知，饲喂LD1、LD2和LD3 3种日粮的幼虫存活率均低于50%，难于满足幼虫毒性试验的要求。饲喂LD4日粮的的幼虫生长良好，幼虫前3 d几乎不移动，仅采食其身边的食物，第4天起就可以移动到培养板孔的大部分地方采食大量的食物，且幼虫的身体以惊人的速度增长，第7天80%的幼虫存活，且开始排便。由此可见，4种日粮配方中LD4 对幼虫的饲喂效果明显优于LD1、LD2和LD3。
2.2：虫龄对幼虫存活率的影响：
在饲喂过程中发现，1日龄前期幼虫在移植到培养板前3 d长势比较不错，第4天50%以上的幼虫身体弹性减弱，逐渐停止发育然后死亡。1日龄后期幼虫生长良好，90%以上的幼虫存活，排便进入蛹化期。由表3可知，1日龄后期幼虫饲喂效果明显优于1日龄前期幼虫。这可能是因为1日龄前期幼虫所处的巢孔内蜂王浆含量较1日龄后期的幼虫少，保护措施较差，在人工移虫过程中对其伤害较大，导致幼虫受伤，所以后期幼虫死亡。
2.3：不同化蛹板对幼虫发育的影响：
由表4可知，2种化蛹板模式下蜜蜂幼虫的蛹化率和羽化率差异极显著（P<001）。空白的化蛹板的化蛹模式从预蛹到成蜂仅获得4444%的羽化率，而垫干燥的无菌擦镜纸的化蛹板获得高达95.83%的成活率。由此可见，垫干燥的无菌擦镜纸的化蛹板更有利于幼虫的发育。由于幼虫在进入不再吃食的蛹期前，需将堆积于体内的粪便一次排出，而排出的粪便主要为黄色液体，垫干燥的无菌擦镜纸可吸收排出的液体，保持幼虫的身体干燥，便于更好地化蛹。
3：小结
笔者通过筛选获得了比较理想的蜜蜂幼虫日粮营养配方，同时发现1日龄后期幼虫饲喂效果明显优于1日龄前期幼虫，垫干燥的无菌擦镜纸的化蛹板更有利于幼虫的发育，为大规模进行蜜蜂幼虫的人工培养提供了条件，建立完整的室内人工饲养蜜蜂幼虫的技术，完善农药对蜜蜂幼虫毒性影响试验的关键技术，为进一步开展典型农药对蜜蜂幼虫毒性影响研究奠定基础。
参考文献
[1] KATZAV G T，SOROKER V，KAMER J，et al.Ultrastructural and chemical characterization of egg surface of honeybee worker and queenlaid eggs[J].Chemoecology，2003，13：129-134.
[2] 王倩，孙亮先，肖培新，等.室内人工培育中华蜜蜂幼虫技术研究[J].山东农业科学，2009（11）：113-116.
[3] PAGE R E，ERBER J.Levels of behavioral organization and the evolution of division of labor[J].Naturwissenschaften，2002，89：91-106.
[4] ROBINSON G E，GROZINGER C M，WHITFIELD C W.Sociogenomics：Social life in molecular terms[J].Nat Rev Genet，2005，6：257-270.
[5] MALONE L A，PHAMDELEGUE M H.Effects of transgene products on honey bees（Apis mellifera）and bumblebees （Bombus sp.）[J].Apidologie，2001，32（4）：287-304.
[6] PENG C Y S，MUSSEN E.Laboratory and field studies on the effects of the development and p revention ofAmerican foulbrood disease[J].Invertebr Pathol，1996，67：65-71.
[7] WEAVER N.Rearing of honeybee larvae on royal jelly in the laboratory[J].Science，1995，121：509-510.
[8] SHUEL R W，DIXON S E.The importance of sugar for the pupation of the worker honeybee[J].J Apic Res，1968，7：109-112.
[9] OECD.Honey bee（Apis mellifera）larval toxicity test，single exposure：237[S].OECD，2013.
[10] VANDENBERG J D，SHIMANUK I H.Technique for rearing worker honeybees in the laboratory[J].Journal of apicultural research，1987，26（2）：90-97.
责任编辑：乔利利：责任校对：況玲玲
关键词：农药；幼虫毒性；室内饲养技术
中图分类号：S894 文献标识码：A 文章编号：0517-6611（2016）07-079-02
Abstract：[Objective] Simulating environmental conditions for the development of bee larvae under natural conditions， the feasible breeding mode was explored， the complete indoor artificial cultivation technology for bee larvae was established. [Method] With Italy bee larvae as the research object， larvae survival rate， pupation rate and eclosion rate as evaluation indicators， effects of diet formula， insect age， pupation plate on growth and development of larvae were discussed. [Result] Through screening， the ideal indoor artificial cultivation technology for bee larvaes was obtained， the survival rate， pupation rate and eclosion rate could reach above 90%. [Conclusion] The study establishes an effective， feasible breeding technology for bee larvae， which will lay a foundation for further studying effects of typical pesticides on toxicity of bee larvae.
Key words：Pesticide； Larval toxicity； Indoor breeding technology
蜜蜂以其授粉高效性、采集專一性和种群社会性等优势在许多农作物授粉中发挥着重要作用，是自然界最重要的有益昆虫之一。然而，一些农药杀虫剂的不合理使用不仅会伤害采集蜂，而且对蜂群中的幼虫也具有一定的影响。蜜蜂是典型的真社会性昆虫，具有明确而细致的劳动分工，蜂群中的幼虫食物由专职哺育蜂来提供，而人工对幼虫进行操作，幼虫往往会被工蜂遗弃[1]，并且在自然蜂群中添加杀虫剂来研究其对采集蜂和幼虫的影响时，试验产物易存储于巢脾上影响蜂群繁殖，同时还受到外界蜜源冲淡杀虫剂剂量的影响，造成了人为干预下对蜜蜂幼虫研究的困难。
建立实验室内人工饲养蜜蜂幼虫的技术，是蜜蜂幼虫作为模式生物研究的基础[2-4]，是开展农药对蜜蜂幼虫毒性试验的前提。目前已有的室内饲养技术侧重于饲喂板的新旧和移虫模式[5-8]，忽略了日粮配方、虫龄和化蛹板等方面的影响，导致幼虫成活率、蛹化率及羽化率均偏低。笔者以意
大利蜜蜂幼虫为研究对象，以实验室内其正常发育为目标，
模拟自然状况下蜜蜂幼虫发育的环境条件，探索可行的蜜
蜂幼虫的饲养模式，建立完整的室内人工饲养蜜蜂幼虫的技
术，完善农药对蜜蜂幼虫毒性影响试验的关键技术，旨在为进一步开展典型农药对蜜蜂幼虫毒性影响研究奠定基础。
1：材料与方法
1.1：材料与仪器
1.1.1：试验材料。
意大利蜜蜂、无菌水、鲜蜂王浆、D-果糖、葡萄糖、酵母提取物等。
1.1.2：仪器与耗材。高压灭菌锅、恒温培养箱、48孔细胞培养板、24孔细胞培养板、烘箱、电子天平、移虫针。
1.2：试验方法
1.2.1：不同日粮配方对蜜蜂幼虫存活率的影响。
为获得最佳蜜蜂幼虫饲粮配比，参照OECD237[9]及Vandenberg等[10]的幼虫基础饲粮配方，配制4种蜜蜂幼虫饲粮，以供筛选。4种幼虫日粮（Larval diet，LD）的配方如表1所示。4种日粮分别配制，现用现配。
试验按日粮分为4个处理，每个处理 3个培养板（48 孔）即 3个重复，随机挑取1日龄幼虫进行饲喂。全过程观测幼虫生长状况，测定饲喂至化蛹期幼虫的存活率，观测比较4种日粮的饲喂效果。
1.2.2：
虫龄对幼虫存活率的影响。
试验日粮统一为试验1 中饲喂效果最佳的日粮配方，1日龄前期幼虫（蛋青色）和1日龄后期幼虫（白色）2个处理组，每个处理 3个培养板（48 孔）即 3个重复。全过程观测幼虫生长状况，测定饲喂至化蛹期幼虫的存活率，比较2种虫龄的发育效果。
1.2.3：不同化蛹板对幼虫发育的影响。
化蛹板的目的是让即将化蛹的幼虫在无菌的情况下蛹化。为获得最佳化蛹条件，试验设置2个处理组，1个处理组在24孔培养板孔内垫干燥的无菌擦镜纸，另1个处理组为空白24孔培养板。试验日粮统一为试验1 中饲喂效果最佳的日粮配方，挑取试验2 中饲喂效果最佳的虫龄进行饲喂，然后将进入排便期即将化蛹的幼虫（预蛹）用移虫针移入化蛹板孔中，每孔1 只。此后，不再移动虫体，幼虫可在孔中完成排便、吐丝和化蛹的过程，最后羽化为成蜂。测定化蛹率和羽化率，比较2种化蛹板的效果。 2：结果与分析
2.1：不同日粮配方对幼虫存活率的影响：
在饲喂过程中发现，饲喂LD1、LD2和LD3日粮的幼虫生长不佳，幼虫在移植到培养板 3 d左右死亡，个别幼虫在发育到蛹期后停止发育，然后死亡。由表2可知，饲喂LD1、LD2和LD3 3种日粮的幼虫存活率均低于50%，难于满足幼虫毒性试验的要求。饲喂LD4日粮的的幼虫生长良好，幼虫前3 d几乎不移动，仅采食其身边的食物，第4天起就可以移动到培养板孔的大部分地方采食大量的食物，且幼虫的身体以惊人的速度增长，第7天80%的幼虫存活，且开始排便。由此可见，4种日粮配方中LD4 对幼虫的饲喂效果明显优于LD1、LD2和LD3。
2.2：虫龄对幼虫存活率的影响：
在饲喂过程中发现，1日龄前期幼虫在移植到培养板前3 d长势比较不错，第4天50%以上的幼虫身体弹性减弱，逐渐停止发育然后死亡。1日龄后期幼虫生长良好，90%以上的幼虫存活，排便进入蛹化期。由表3可知，1日龄后期幼虫饲喂效果明显优于1日龄前期幼虫。这可能是因为1日龄前期幼虫所处的巢孔内蜂王浆含量较1日龄后期的幼虫少，保护措施较差，在人工移虫过程中对其伤害较大，导致幼虫受伤，所以后期幼虫死亡。
2.3：不同化蛹板对幼虫发育的影响：
由表4可知，2种化蛹板模式下蜜蜂幼虫的蛹化率和羽化率差异极显著（P<001）。空白的化蛹板的化蛹模式从预蛹到成蜂仅获得4444%的羽化率，而垫干燥的无菌擦镜纸的化蛹板获得高达95.83%的成活率。由此可见，垫干燥的无菌擦镜纸的化蛹板更有利于幼虫的发育。由于幼虫在进入不再吃食的蛹期前，需将堆积于体内的粪便一次排出，而排出的粪便主要为黄色液体，垫干燥的无菌擦镜纸可吸收排出的液体，保持幼虫的身体干燥，便于更好地化蛹。
3：小结
笔者通过筛选获得了比较理想的蜜蜂幼虫日粮营养配方，同时发现1日龄后期幼虫饲喂效果明显优于1日龄前期幼虫，垫干燥的无菌擦镜纸的化蛹板更有利于幼虫的发育，为大规模进行蜜蜂幼虫的人工培养提供了条件，建立完整的室内人工饲养蜜蜂幼虫的技术，完善农药对蜜蜂幼虫毒性影响试验的关键技术，为进一步开展典型农药对蜜蜂幼虫毒性影响研究奠定基础。
参考文献
[1] KATZAV G T，SOROKER V，KAMER J，et al.Ultrastructural and chemical characterization of egg surface of honeybee worker and queenlaid eggs[J].Chemoecology，2003，13：129-134.
[2] 王倩，孙亮先，肖培新，等.室内人工培育中华蜜蜂幼虫技术研究[J].山东农业科学，2009（11）：113-116.
[3] PAGE R E，ERBER J.Levels of behavioral organization and the evolution of division of labor[J].Naturwissenschaften，2002，89：91-106.
[4] ROBINSON G E，GROZINGER C M，WHITFIELD C W.Sociogenomics：Social life in molecular terms[J].Nat Rev Genet，2005，6：257-270.
[5] MALONE L A，PHAMDELEGUE M H.Effects of transgene products on honey bees（Apis mellifera）and bumblebees （Bombus sp.）[J].Apidologie，2001，32（4）：287-304.
[6] PENG C Y S，MUSSEN E.Laboratory and field studies on the effects of the development and p revention ofAmerican foulbrood disease[J].Invertebr Pathol，1996，67：65-71.
[7] WEAVER N.Rearing of honeybee larvae on royal jelly in the laboratory[J].Science，1995，121：509-510.
[8] SHUEL R W，DIXON S E.The importance of sugar for the pupation of the worker honeybee[J].J Apic Res，1968，7：109-112.
[9] OECD.Honey bee（Apis mellifera）larval toxicity test，single exposure：237[S].OECD，2013.
[10] VANDENBERG J D，SHIMANUK I H.Technique for rearing worker honeybees in the laboratory[J].Journal of apicultural research，1987，26（2）：90-97.
责任编辑：乔利利：责任校对：況玲玲