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摘要：研究了中性蛋白酶和木瓜蛋白酶对鹅血液的水解作用，以水解度为指标，用响应面分析对其酶解条件进行优化，建立了一个水解模型，其最优化条件是加酶量为4693.46 U/g、温度为53.67℃、时间为3.6h、底物浓度为9.54%。达到最大水解度24.29%。
关键词：酶解 血红蛋白 鹅血 响应面分析
中图分类号：TS249.2 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2015）04-0012-02
鹅是食草家禽，其血液含丰富的可利用营养成分。有报道鹅血具有增强机体的免疫力，对食道癌、上呼吸道癌、肝癌等具有良好的功效[1]。
近年来，科学家研究发现，蛋白质经消化道酶促水解后主要以小肽的形式吸收，比完全游离氨基酸更易、更快被机体吸收利用。这是肽研究理论和实践的重大突破[2]。酶水解血液可以制备游离氨基酸和功能肽，功能肽在促进免疫细胞增生、抗肿瘤、抗氧化、增强机体免疫力等方面有一定的功效。
因此，本研究采用蛋白酶水解鹅血红蛋白，对其工艺及水解条件进行了探讨，为进一步从鹅血中提取蛋白肽提供了可靠的依据。
l 材料与方法
1.1 原料与试剂
鹅血，采自吉林德莱鹅业公司的新鲜、检疫合格的鹅血；中性蛋白酶（16.3×10‘U/g）、木瓜蛋白酶（50.6×104 U/g），均为食品级，广西南宁庞博生物工程有限公司，甲醛、氢氧化钠、硫酸铜、硫酸钾等均为分析纯。
1.2 仪器设备
微量凯氏定氮装置、精密pH计、分析天平、高速离心机、超声波粉碎仪等。
2 实验方法
2.1 血红蛋白的制备
新鲜鹅血按3.8 g/kg血量加入食用柠檬酸钠抗凝，并充分搅拌，离心分离，下层为血细胞。沉淀用生理盐水（0.9%NaCI）洗涤血细胞，然后离心，收集沉淀的血细胞，加入1倍体积的蒸馏水，用超声波粉碎仪处理，再离心去除细胞膜及杂质沉淀，得到血红蛋白溶液。
2.2 酶水解工艺
新鲜鹅血→抗凝→离心→破胞→离心→血红蛋白原液→酶水解→灭酶终止反应→离心→脱色→离心→水解蛋白液→提纯分离→多肽
2.3 检验方法
蛋白质含量测定：参照GB/T5009.5-2003；
酶活性测定：参照QB/T180-93；
氨态氮测定：参照GB/T5009.39-96；
水解度DH%的测定：
DH=水解液中总游离氨基酸含氮量/总氮量
2.4 酶制剂的筛选
在相同的底物浓度的样品溶液中，分别加入中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、动物蛋白水解专用酶4种酶来水解样品。拟定各酶适宜的温度、酶解时间、酶添加量。水解后测定各组的水解度，确定最佳用酶。
2.5 水解条件的响应面法优化实验
以中性蛋白酶与木瓜蛋白酶1：1混合水解鹅血红蛋白，以水解度为指标，对加酶量（X1）、温度（X2）、时间（X3）底物浓度（X4）、共4个主要水解反应参数进行优化，建立一个二次回归正交旋转组合数学模型。各反应变量及其实验设计水平编码值见表l。
3 结果与分析
3.1 酶的筛选
由于酶具有特异性和选择性。要使鹅血红蛋白酶解反应充分进行，选择适宜的酶至关重要。本研究选用不同的酶在各自最适条件下水解骨蛋白。其结果见图1。
由图中可以看出，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解效果理想；由于双酶水解有协同增效作用；所以选用中性蛋白酶和木瓜蛋白酶以1：1的比例做进一步实验。
3.2 酶水解参数的优化
以水解度为指标的4因素响应面分析实验设计与结果见表2。
经回归拟合后各试验因子对响应值的影响可得到蛋白水解液提取率回归方程为：
Y=-107.48375+0.0067*Xl+4.651583*X2+4.860417*X3-3.669375*X4-0.000001127*X1*X1-0.000030370*X2*X1- 0.056571*X2*X2+0.000389*X3*X1+0.070875*X3*X2- 1.525521*X3*X3+0.00043*X4*X1+0.137063*X4*X2+ 0.050937*X4*X3-0.308568*X4*X4
运用RSREG程序进行方差分析：其方差分析结果见表3。
二次回归模型F值为18.46，P值<0.001，大于在0.01水平上的F值，而失拟项的F值为1.85，小于在0.05水平上的F值，说明该模型拟和结果好。
一次项，二次项的F值大于0.0l水平上的F值，说明各个因素和各因素之间作用都对提取率有极其显著的影响。参数R2为0.9417（>0.85），F=18.72>F 0.00l（14，16）=3.45，说明该模型是可靠的。
将两个因素固定在零水平，然后用水解度与两个不同因素做等值线图（见图1～3）。
由SAS响应面优化图，可以得出等高线图和响应面趋势具有一致性。从曲线的弯曲度可以看出，各因素影响程度从大到小的依次排列为温度、底物浓度、加酶量和时间。提取率最高时的加酶量为4693.46 U/g、温度为53.67℃、时间为3.6h、底物浓度为9.54%。在此条件下达到最大水解度24.29%。
4 结语
本实验通过加入不同蛋白酶来水解鹅血红蛋白，确定了中性蛋白酶和木瓜蛋白酶对鹅血液进行水解为最佳用酶。以水解度作为响应值，设计了4因素5水平的响应面实验，从而得到最佳水解工艺条件：加酶量为4693.46U/g、温度为53.67℃、时间为3.6h、底物浓度为9.54%。在此条件下达到最大水解度24.29%。从而为进一步开发禽、畜血红蛋白产品提供可靠的数据。
参考文献
[1]汤风霞，乔长晟.猪血水解蛋白生产工艺的研究[J].宁夏农学院学报，1996，（2）：42-49.
[2]张华山.猪血蛋白的酶水解及氨基酸含量[J].氨基酸和生物资源，1999，（3）t35-37.
[3]王钦德 主编.食品实验设计与统计分析.北京：中国农业大学出版社.
关键词：酶解 血红蛋白 鹅血 响应面分析
中图分类号：TS249.2 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2015）04-0012-02
鹅是食草家禽，其血液含丰富的可利用营养成分。有报道鹅血具有增强机体的免疫力，对食道癌、上呼吸道癌、肝癌等具有良好的功效[1]。
近年来，科学家研究发现，蛋白质经消化道酶促水解后主要以小肽的形式吸收，比完全游离氨基酸更易、更快被机体吸收利用。这是肽研究理论和实践的重大突破[2]。酶水解血液可以制备游离氨基酸和功能肽，功能肽在促进免疫细胞增生、抗肿瘤、抗氧化、增强机体免疫力等方面有一定的功效。
因此，本研究采用蛋白酶水解鹅血红蛋白，对其工艺及水解条件进行了探讨，为进一步从鹅血中提取蛋白肽提供了可靠的依据。
l 材料与方法
1.1 原料与试剂
鹅血，采自吉林德莱鹅业公司的新鲜、检疫合格的鹅血；中性蛋白酶（16.3×10‘U/g）、木瓜蛋白酶（50.6×104 U/g），均为食品级，广西南宁庞博生物工程有限公司，甲醛、氢氧化钠、硫酸铜、硫酸钾等均为分析纯。
1.2 仪器设备
微量凯氏定氮装置、精密pH计、分析天平、高速离心机、超声波粉碎仪等。
2 实验方法
2.1 血红蛋白的制备
新鲜鹅血按3.8 g/kg血量加入食用柠檬酸钠抗凝，并充分搅拌，离心分离，下层为血细胞。沉淀用生理盐水（0.9%NaCI）洗涤血细胞，然后离心，收集沉淀的血细胞，加入1倍体积的蒸馏水，用超声波粉碎仪处理，再离心去除细胞膜及杂质沉淀，得到血红蛋白溶液。
2.2 酶水解工艺
新鲜鹅血→抗凝→离心→破胞→离心→血红蛋白原液→酶水解→灭酶终止反应→离心→脱色→离心→水解蛋白液→提纯分离→多肽
2.3 检验方法
蛋白质含量测定：参照GB/T5009.5-2003；
酶活性测定：参照QB/T180-93；
氨态氮测定：参照GB/T5009.39-96；
水解度DH%的测定：
DH=水解液中总游离氨基酸含氮量/总氮量
2.4 酶制剂的筛选
在相同的底物浓度的样品溶液中，分别加入中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、动物蛋白水解专用酶4种酶来水解样品。拟定各酶适宜的温度、酶解时间、酶添加量。水解后测定各组的水解度，确定最佳用酶。
2.5 水解条件的响应面法优化实验
以中性蛋白酶与木瓜蛋白酶1：1混合水解鹅血红蛋白，以水解度为指标，对加酶量（X1）、温度（X2）、时间（X3）底物浓度（X4）、共4个主要水解反应参数进行优化，建立一个二次回归正交旋转组合数学模型。各反应变量及其实验设计水平编码值见表l。
3 结果与分析
3.1 酶的筛选
由于酶具有特异性和选择性。要使鹅血红蛋白酶解反应充分进行，选择适宜的酶至关重要。本研究选用不同的酶在各自最适条件下水解骨蛋白。其结果见图1。
由图中可以看出，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解效果理想；由于双酶水解有协同增效作用；所以选用中性蛋白酶和木瓜蛋白酶以1：1的比例做进一步实验。
3.2 酶水解参数的优化
以水解度为指标的4因素响应面分析实验设计与结果见表2。
经回归拟合后各试验因子对响应值的影响可得到蛋白水解液提取率回归方程为：
Y=-107.48375+0.0067*Xl+4.651583*X2+4.860417*X3-3.669375*X4-0.000001127*X1*X1-0.000030370*X2*X1- 0.056571*X2*X2+0.000389*X3*X1+0.070875*X3*X2- 1.525521*X3*X3+0.00043*X4*X1+0.137063*X4*X2+ 0.050937*X4*X3-0.308568*X4*X4
运用RSREG程序进行方差分析：其方差分析结果见表3。
二次回归模型F值为18.46，P值<0.001，大于在0.01水平上的F值，而失拟项的F值为1.85，小于在0.05水平上的F值，说明该模型拟和结果好。
一次项，二次项的F值大于0.0l水平上的F值，说明各个因素和各因素之间作用都对提取率有极其显著的影响。参数R2为0.9417（>0.85），F=18.72>F 0.00l（14，16）=3.45，说明该模型是可靠的。
将两个因素固定在零水平，然后用水解度与两个不同因素做等值线图（见图1～3）。
由SAS响应面优化图，可以得出等高线图和响应面趋势具有一致性。从曲线的弯曲度可以看出，各因素影响程度从大到小的依次排列为温度、底物浓度、加酶量和时间。提取率最高时的加酶量为4693.46 U/g、温度为53.67℃、时间为3.6h、底物浓度为9.54%。在此条件下达到最大水解度24.29%。
4 结语
本实验通过加入不同蛋白酶来水解鹅血红蛋白，确定了中性蛋白酶和木瓜蛋白酶对鹅血液进行水解为最佳用酶。以水解度作为响应值，设计了4因素5水平的响应面实验，从而得到最佳水解工艺条件：加酶量为4693.46U/g、温度为53.67℃、时间为3.6h、底物浓度为9.54%。在此条件下达到最大水解度24.29%。从而为进一步开发禽、畜血红蛋白产品提供可靠的数据。
参考文献
[1]汤风霞，乔长晟.猪血水解蛋白生产工艺的研究[J].宁夏农学院学报，1996，（2）：42-49.
[2]张华山.猪血蛋白的酶水解及氨基酸含量[J].氨基酸和生物资源，1999，（3）t35-37.
[3]王钦德 主编.食品实验设计与统计分析.北京：中国农业大学出版社.