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摘 要 bHLH家族作为植物中较大的转录因子家族之一，在真核生物生长发育调控中具有重要作用。本研究基于芒果果实转录组数据，利用生物信息学方法鉴定出87个bHLH家族蛋白，其中酸性蛋白所占比例较大，大部分为不稳定蛋白，且均为不含信号肽的亲水性蛋白，除CL10714.Contig1为膜结合转录因子外，其余均不含跨膜结构。芒果bHLH蛋白结构域有多个氨基酸位点保守性较高，87个芒果bHLH蛋白中73个（83.91%）具有E-box结合功能。GO分析发现芒果bHLH蛋白共注释到生物学过程、细胞组分和分子功能3大类功能的17个亚类。进化树分析发现芒果bHLH蛋白与拟南芥有较高的保守性，并基于进化树对部分bHLH蛋白的功能进行了预测。本研究结果将为下一步芒果bHLH蛋白的功能研究奠定基础。
关键词 芒果;bHLH家族;转录因子;生物信息学
中图分类号 S667.7 文献标识码 A
碱性螺旋-环-螺旋（basic Helix-Loop-Helix， bHLH）转录因子为真核生物蛋白中的一个大家族[1]，在生物的生长发育调控中起着极为重要的作用。bHLH转录因子于1989年首次在动物中发现，因含有bHLH结构域而得名[2]。bHLH结构域由大约60个氨基酸组成，分为碱性氨基酸区域（basic）和α-螺旋-环-α-螺旋区（HLH），碱性氨基酸区位于bHLH结构域的N端，长度约为15个氨基酸，主要负责与DNA顺式元件结合，HLH区位于该结构域的C-端，由大约40个氨基酸组成，具有形成二聚体的特性[2-4]。
植物中bHLH转录因子是仅次于MYB的第二大转录因子家族[5]，其参与调控抗逆、器官发育、激素响应及代谢物合成等多个生物学进程[6]。与对照相比，拟南芥中过表达bHLH122基因的株系对干旱、NaCl和渗透胁迫的抗性增强[7];Jiang等[8]发现bHLH转录因子参与了黄瓜果实长度的调控;在拟南芥中，bHLH基因BEE1、BEE2和BEE3参与对油菜素内酯的响应，且这3个基因在油菜素内酯的信号传导中功能冗余[9];MdbHLH33参与调控苹果花色素苷的生物合成[10]。
基于高通量测序及生物信息学分析技术，人们已对一些植物的bHLH基因家族进行了挖掘、比较分析和功能预测，并对部分bHLH基因进行了功能分析。基于基因组信息，Geng等[11]在甜橙中发现56个bHLH转录因子，其中CsbHLH18通过调控抗氧化基因调节植株耐寒性及活性氧平衡。芒果素有“热带果王”之美誉，含有丰富的糖类、蛋白质、维生素、类胡萝卜素和钙质等营养成分，在我国主要分布在海南、广西、云南、四川、广东和福建等地，已成为我国热区农业的支柱产业[12]，但目前关于芒果bHLH转录因子的研究还鲜有报道。为此，本研究基于芒果果实转录组测序结果，利用生物信息学手段对bHLH家族基因进行鉴定和分析，为进一步探究芒果bHLH转录因子的功能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
芒果蛋白序列来源于構建的转录组数据库（GenBank accession SRP035450）。拟南芥bHLH家族氨基酸序列下载于拟南芥信息资源（TAIR）数据库（http：//www.arabidopsis.org/）。
1.2 方法
1.2.1 芒果bHLH家族蛋白的鉴定 从Pfam 31.0[13]数据库（http：//pfam.xfam.org/）下载HLH结构域种子文件PF00010和PF14215，利用HMMER 3.1b2[14]软件分别构建Profile HMM（数值表格型隐马可夫模型），基于Profile HMM分别检索芒果转录组蛋白数据库并对检索结果进行整合去冗余，得到候选蛋白。将候选蛋白用SMART[15]（http：//smart.embl-heidelberg.de/）分析HLH结构域，同时用NCBI blast（https：//blast. ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi）和植物转录因子数据库[16]（PlantTFDB）（http：//planttfdb.cbi.pku.edu.cn/）进行进一步分析鉴定，筛选出具有全长氨基酸序列的芒果bHLH转录因子。
1.2.2 芒果bHLH家族蛋白生物信息学分析 基于筛选鉴定的芒果bHLH家族蛋白，利用在线工具ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）对其进行理化性质分析，并用在线软件SOPMA[17]（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_ sopma.html）分析其二级结构，信号肽的预测应用SignalP 4.1 Server[18]（http：//www. cbs.dtu.dk/services/SignalP/）软件进行分析，最后采用TMHMM Server v. 2.0（http：//www.cbs. dtu.dk/services/TMHMM/）在线软件完成跨膜结构分析。
1.2.3 芒果bHLH家族蛋白结构域分析 使用BioEdit软件对芒果bHLH家族蛋白结构域进行比对，将比对结果用在线软件WebLogo 3（http：//weblogo.threeplusone.com/cre at e.cgi）分析结构域序列标签。
1.2.4 芒果bHLH家族蛋白系统发育树构建及基序分析 利用MEGA 6.0软件内置的Clustal W程序对芒果bHLH家族蛋白的氨基酸序列进行比对分析，将比对结果采用邻接法构建系统发育树，选用Poisson模型，并进行自举评估（Bootstrap），重复次数为1000次，缺失值处理方式为配对状态删除（pairwise deletion），其他参数使用默认值[19]。运用MEME 4.11.02程序[20]分析芒果bHLH家族蛋白的基序，设定基序宽度为6～50，基序数量为5，其余参数为默认值。 1.2.5 芒果bHLH家族蛋白GO分析 首先使用Blast2GO 4.0软件[21]对芒果bHLH家族蛋白序列进行GO（gene ontology）注释，然后用在线软件WEGO[22]（http：//wego.genomics.org.cn/cgi-bin/ wego/index.pl）绘制GO功能分类图。
1.2.6 芒果和拟南芥bHLH蛋白进化树构建 使用MEGA 6.0软件采用最大似然法将芒果bHLH蛋白和拟南芥bHLH蛋白共同构建进化树。
2 结果与分析
2.1 芒果bHLH家族成员的获得
基于从Pfam 31.0数据库下载的种子文件PF00010和PF14215，使用HMMER 3.1b2软件从芒果转录组49 117个蛋白序列中分别筛选出211个和86个候选蛋白序列，逐个进行结构域及同源比对分析，去除重复及非全长氨基酸序列，共获得87个芒果bHLH家族蛋白序列（表1），其中最小的bHLH蛋白含89个氨基酸，最大的bHLH蛋白含944个氨基酸。
2.2 芒果bHLH家族蛋白特性分析
对芒果bHLH家族蛋白进一步进行生物信息学分析（表1），理化性质分析发现：87个芒果bHLH家族蛋白的相对分子量在10.17～102.47 ku之间，其中含61个酸性蛋白（理论等电点<7）和26个碱性蛋白（理论等电点>7）;不稳定指数（Ⅱ）分析发现除Unigene21025和CL12 02.Contig3为稳定蛋白外（Ⅱ<40），其余均为不稳定蛋白（Ⅱ>40）;平均疏水指数均小于0，为亲水性蛋白。二级结构分析发现：芒果bHLH家族蛋白中无规卷曲和α-螺旋所占比例较大，其中50个为无规卷曲所占比例最大，36个为α-螺旋所占比例最大，CL5018.Contig2二级结构中α-螺旋和无规卷曲所占比例一致。87个bHLH家族蛋白均不含信号肽。跨膜结构分析发现CL10714.Contig1含跨膜结构，为膜结合转录因子，其余bHLH蛋白均不含跨膜结构。
2.3 芒果bHLH蛋白结构域分析及分类
使用BioEdit对87个芒果bHLH蛋白的结构域进行比对，并用WebLogo 3获得芒果bHLH蛋白的结构域序列标签（图1）。分析发现，在芒果bHLH结构域的2个α-螺旋区内，23和54位点均为疏水性氨基酸亮氨酸（L），100%的20、44和51位点，98.85%的16位点以及97.70%的27位点为疏水性氨基酸（A、F、I、L、M、P、V、W或Y），而这些疏水性氨基酸对bHLH的蛋白二级结构的稳定性起着关键作用[23]。
在bHLH结构域的碱性区内，有多个关键位点用于识别并结合DNA特定碱基序列，其中9位点的谷氨酸（E）用于与DNA双螺旋结构的大沟结合[23]，分析发现，73个（83.91%）芒果bHLH结构域的9位点为谷氨酸（E），其中72个在9位点为谷氨酸（E）且12位点为精氨酸（R），而且研究发现具有9位点为E且12位点为R结构的bHLH蛋白具有识别并结合E-box序列（CANNTG）的功能[24]，57個（65.52%）bHLH蛋白结构域在5位点为组氨酸（H）或赖氨酸（K）、9位点为谷氨酸（E）且13位点为精氨酸（R），而在植物中该结构被证实用于识别并结合G-box[25]。在14个9位点不是谷氨酸（E）的bHLH结构域中，有3个bHLH结构域的碱性区内含5个及以上碱性氨基酸（R、K或H），这3个bHLH蛋白可能在非E-box序列处与DNA结合[4]。11个bHLH结构域9位点不是谷氨酸（E）且碱性区内含5个以下碱性氨基酸（R、K或H），该类bHLH蛋白不具有结合DNA功能[26]。
2.4 芒果bHLH家族蛋白进化树及基序分析
通过MEGA 6.0软件构建芒果bHLH家族蛋白的系统进化树。由图2可知，在进化树中，相同类型的bHLH蛋白聚在一起，且相近分支的bHLH序列长度及结构域位置相近。
3 讨论
植物bHLH蛋白参与抗逆、生长发育、生物合成及信号传导等生理生化过程[35]。基于生物信息学分析技术，目前已从一些植物如拟南芥[36]、水稻[37]、人参[38]、西瓜[39]、茶树[40]、葡萄[41]、苹果[42]等分别鉴定出162、167、169、96、120、110、175个bHLH蛋白。
本研究基于芒果果实转录组数据，鉴定出87个bHLH家族蛋白，其中酸性蛋白所占比例较大，大部分为不稳定蛋白，且均为不含信号肽的亲水性蛋白，此现象与‘短柄樱桃’[43]等多种植物的bHLH家族蛋白相似。除CL10714.Contig1为膜结合转录因子外，其余bHLH蛋白均不含跨膜结构，推测CL10714.Contig1与芒果对环境的胁迫响应有关[44]。大部分芒果bHLH家族蛋白二级结构中无规卷曲所占比例最大，该结果与云南红皮梨bHLH转录因子一致[45]。
芒果bHLH蛋白结构域有多个氨基酸位点保守性较高，且保守位点与西瓜[39]和莲[46]bHLH蛋白的分析结果相似。87个芒果bHLH蛋白中的73个（83.91%）具有E-box结合功能，57个（65.52%）具有G-box结合功能，该结果与拟南芥（60.54%）和水稻（56.89%）[37]的分析结果相似。
进化树上相近分枝的芒果bHLH的基序组成相同，序列长度及结构域位置相近，与拟南芥bHLH的分析结果相似[27]。
芒果bHLH蛋白共注释到GO分类中生物学过程、细胞组分和分子功能3大类功能的17个亚类，其中56.32% bHLH蛋白注释到结合功能。
对芒果和拟南芥bHLH蛋白共同构建的进化树分析发现，芒果bHLH蛋白与拟南芥有较高的保守性，大部分芒果bHLH蛋白与拟南芥不同亚组的bHLH蛋白聚在一起，推测芒果bHLH蛋白与相近的拟南芥bHLH蛋白具有相似的功能，该分析将为下一步芒果bHLH蛋白的功能分析提供参考。基于此方法，Chen等[47]发现与拟南芥AtbHLH112同源的水稻OsbHLH068在参与盐胁迫响应时与AtbHLH112功能一致，参与花期调控时与AtbHLH112功能相反。 bHLH蛋白参与植物的多种生命活动，本研究从芒果转录组数据中鉴定87个bHLH家族蛋白，为今后芒果bHLH家族蛋白的研究提供了基础。由于转录组数据的局限性，所鉴定的仅为芒果bHLH家族的部分蛋白序列，因此，芒果bHLH家族蛋白还有待进一步挖掘和研究。本研究仅对部分芒果bHLH蛋白进行了功能预测，其具体功能有待进一步验证。
参考文献
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关键词 芒果;bHLH家族;转录因子;生物信息学
中图分类号 S667.7 文献标识码 A
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植物中bHLH转录因子是仅次于MYB的第二大转录因子家族[5]，其参与调控抗逆、器官发育、激素响应及代谢物合成等多个生物学进程[6]。与对照相比，拟南芥中过表达bHLH122基因的株系对干旱、NaCl和渗透胁迫的抗性增强[7];Jiang等[8]发现bHLH转录因子参与了黄瓜果实长度的调控;在拟南芥中，bHLH基因BEE1、BEE2和BEE3参与对油菜素内酯的响应，且这3个基因在油菜素内酯的信号传导中功能冗余[9];MdbHLH33参与调控苹果花色素苷的生物合成[10]。
基于高通量测序及生物信息学分析技术，人们已对一些植物的bHLH基因家族进行了挖掘、比较分析和功能预测，并对部分bHLH基因进行了功能分析。基于基因组信息，Geng等[11]在甜橙中发现56个bHLH转录因子，其中CsbHLH18通过调控抗氧化基因调节植株耐寒性及活性氧平衡。芒果素有“热带果王”之美誉，含有丰富的糖类、蛋白质、维生素、类胡萝卜素和钙质等营养成分，在我国主要分布在海南、广西、云南、四川、广东和福建等地，已成为我国热区农业的支柱产业[12]，但目前关于芒果bHLH转录因子的研究还鲜有报道。为此，本研究基于芒果果实转录组测序结果，利用生物信息学手段对bHLH家族基因进行鉴定和分析，为进一步探究芒果bHLH转录因子的功能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
芒果蛋白序列来源于構建的转录组数据库（GenBank accession SRP035450）。拟南芥bHLH家族氨基酸序列下载于拟南芥信息资源（TAIR）数据库（http：//www.arabidopsis.org/）。
1.2 方法
1.2.1 芒果bHLH家族蛋白的鉴定 从Pfam 31.0[13]数据库（http：//pfam.xfam.org/）下载HLH结构域种子文件PF00010和PF14215，利用HMMER 3.1b2[14]软件分别构建Profile HMM（数值表格型隐马可夫模型），基于Profile HMM分别检索芒果转录组蛋白数据库并对检索结果进行整合去冗余，得到候选蛋白。将候选蛋白用SMART[15]（http：//smart.embl-heidelberg.de/）分析HLH结构域，同时用NCBI blast（https：//blast. ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi）和植物转录因子数据库[16]（PlantTFDB）（http：//planttfdb.cbi.pku.edu.cn/）进行进一步分析鉴定，筛选出具有全长氨基酸序列的芒果bHLH转录因子。
1.2.2 芒果bHLH家族蛋白生物信息学分析 基于筛选鉴定的芒果bHLH家族蛋白，利用在线工具ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）对其进行理化性质分析，并用在线软件SOPMA[17]（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_ sopma.html）分析其二级结构，信号肽的预测应用SignalP 4.1 Server[18]（http：//www. cbs.dtu.dk/services/SignalP/）软件进行分析，最后采用TMHMM Server v. 2.0（http：//www.cbs. dtu.dk/services/TMHMM/）在线软件完成跨膜结构分析。
1.2.3 芒果bHLH家族蛋白结构域分析 使用BioEdit软件对芒果bHLH家族蛋白结构域进行比对，将比对结果用在线软件WebLogo 3（http：//weblogo.threeplusone.com/cre at e.cgi）分析结构域序列标签。
1.2.4 芒果bHLH家族蛋白系统发育树构建及基序分析 利用MEGA 6.0软件内置的Clustal W程序对芒果bHLH家族蛋白的氨基酸序列进行比对分析，将比对结果采用邻接法构建系统发育树，选用Poisson模型，并进行自举评估（Bootstrap），重复次数为1000次，缺失值处理方式为配对状态删除（pairwise deletion），其他参数使用默认值[19]。运用MEME 4.11.02程序[20]分析芒果bHLH家族蛋白的基序，设定基序宽度为6～50，基序数量为5，其余参数为默认值。 1.2.5 芒果bHLH家族蛋白GO分析 首先使用Blast2GO 4.0软件[21]对芒果bHLH家族蛋白序列进行GO（gene ontology）注释，然后用在线软件WEGO[22]（http：//wego.genomics.org.cn/cgi-bin/ wego/index.pl）绘制GO功能分类图。
1.2.6 芒果和拟南芥bHLH蛋白进化树构建 使用MEGA 6.0软件采用最大似然法将芒果bHLH蛋白和拟南芥bHLH蛋白共同构建进化树。
2 结果与分析
2.1 芒果bHLH家族成员的获得
基于从Pfam 31.0数据库下载的种子文件PF00010和PF14215，使用HMMER 3.1b2软件从芒果转录组49 117个蛋白序列中分别筛选出211个和86个候选蛋白序列，逐个进行结构域及同源比对分析，去除重复及非全长氨基酸序列，共获得87个芒果bHLH家族蛋白序列（表1），其中最小的bHLH蛋白含89个氨基酸，最大的bHLH蛋白含944个氨基酸。
2.2 芒果bHLH家族蛋白特性分析
对芒果bHLH家族蛋白进一步进行生物信息学分析（表1），理化性质分析发现：87个芒果bHLH家族蛋白的相对分子量在10.17～102.47 ku之间，其中含61个酸性蛋白（理论等电点<7）和26个碱性蛋白（理论等电点>7）;不稳定指数（Ⅱ）分析发现除Unigene21025和CL12 02.Contig3为稳定蛋白外（Ⅱ<40），其余均为不稳定蛋白（Ⅱ>40）;平均疏水指数均小于0，为亲水性蛋白。二级结构分析发现：芒果bHLH家族蛋白中无规卷曲和α-螺旋所占比例较大，其中50个为无规卷曲所占比例最大，36个为α-螺旋所占比例最大，CL5018.Contig2二级结构中α-螺旋和无规卷曲所占比例一致。87个bHLH家族蛋白均不含信号肽。跨膜结构分析发现CL10714.Contig1含跨膜结构，为膜结合转录因子，其余bHLH蛋白均不含跨膜结构。
2.3 芒果bHLH蛋白结构域分析及分类
使用BioEdit对87个芒果bHLH蛋白的结构域进行比对，并用WebLogo 3获得芒果bHLH蛋白的结构域序列标签（图1）。分析发现，在芒果bHLH结构域的2个α-螺旋区内，23和54位点均为疏水性氨基酸亮氨酸（L），100%的20、44和51位点，98.85%的16位点以及97.70%的27位点为疏水性氨基酸（A、F、I、L、M、P、V、W或Y），而这些疏水性氨基酸对bHLH的蛋白二级结构的稳定性起着关键作用[23]。
在bHLH结构域的碱性区内，有多个关键位点用于识别并结合DNA特定碱基序列，其中9位点的谷氨酸（E）用于与DNA双螺旋结构的大沟结合[23]，分析发现，73个（83.91%）芒果bHLH结构域的9位点为谷氨酸（E），其中72个在9位点为谷氨酸（E）且12位点为精氨酸（R），而且研究发现具有9位点为E且12位点为R结构的bHLH蛋白具有识别并结合E-box序列（CANNTG）的功能[24]，57個（65.52%）bHLH蛋白结构域在5位点为组氨酸（H）或赖氨酸（K）、9位点为谷氨酸（E）且13位点为精氨酸（R），而在植物中该结构被证实用于识别并结合G-box[25]。在14个9位点不是谷氨酸（E）的bHLH结构域中，有3个bHLH结构域的碱性区内含5个及以上碱性氨基酸（R、K或H），这3个bHLH蛋白可能在非E-box序列处与DNA结合[4]。11个bHLH结构域9位点不是谷氨酸（E）且碱性区内含5个以下碱性氨基酸（R、K或H），该类bHLH蛋白不具有结合DNA功能[26]。
2.4 芒果bHLH家族蛋白进化树及基序分析
通过MEGA 6.0软件构建芒果bHLH家族蛋白的系统进化树。由图2可知，在进化树中，相同类型的bHLH蛋白聚在一起，且相近分支的bHLH序列长度及结构域位置相近。
3 讨论
植物bHLH蛋白参与抗逆、生长发育、生物合成及信号传导等生理生化过程[35]。基于生物信息学分析技术，目前已从一些植物如拟南芥[36]、水稻[37]、人参[38]、西瓜[39]、茶树[40]、葡萄[41]、苹果[42]等分别鉴定出162、167、169、96、120、110、175个bHLH蛋白。
本研究基于芒果果实转录组数据，鉴定出87个bHLH家族蛋白，其中酸性蛋白所占比例较大，大部分为不稳定蛋白，且均为不含信号肽的亲水性蛋白，此现象与‘短柄樱桃’[43]等多种植物的bHLH家族蛋白相似。除CL10714.Contig1为膜结合转录因子外，其余bHLH蛋白均不含跨膜结构，推测CL10714.Contig1与芒果对环境的胁迫响应有关[44]。大部分芒果bHLH家族蛋白二级结构中无规卷曲所占比例最大，该结果与云南红皮梨bHLH转录因子一致[45]。
芒果bHLH蛋白结构域有多个氨基酸位点保守性较高，且保守位点与西瓜[39]和莲[46]bHLH蛋白的分析结果相似。87个芒果bHLH蛋白中的73个（83.91%）具有E-box结合功能，57个（65.52%）具有G-box结合功能，该结果与拟南芥（60.54%）和水稻（56.89%）[37]的分析结果相似。
进化树上相近分枝的芒果bHLH的基序组成相同，序列长度及结构域位置相近，与拟南芥bHLH的分析结果相似[27]。
芒果bHLH蛋白共注释到GO分类中生物学过程、细胞组分和分子功能3大类功能的17个亚类，其中56.32% bHLH蛋白注释到结合功能。
对芒果和拟南芥bHLH蛋白共同构建的进化树分析发现，芒果bHLH蛋白与拟南芥有较高的保守性，大部分芒果bHLH蛋白与拟南芥不同亚组的bHLH蛋白聚在一起，推测芒果bHLH蛋白与相近的拟南芥bHLH蛋白具有相似的功能，该分析将为下一步芒果bHLH蛋白的功能分析提供参考。基于此方法，Chen等[47]发现与拟南芥AtbHLH112同源的水稻OsbHLH068在参与盐胁迫响应时与AtbHLH112功能一致，参与花期调控时与AtbHLH112功能相反。 bHLH蛋白参与植物的多种生命活动，本研究从芒果转录组数据中鉴定87个bHLH家族蛋白，为今后芒果bHLH家族蛋白的研究提供了基础。由于转录组数据的局限性，所鉴定的仅为芒果bHLH家族的部分蛋白序列，因此，芒果bHLH家族蛋白还有待进一步挖掘和研究。本研究仅对部分芒果bHLH蛋白进行了功能预测，其具体功能有待进一步验证。
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