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摘要[目的]分离并鉴定鸭源新城疫病毒。[方法]从安徽地区鸭病料中分离新城疫病毒，测定其鸡胚半数感染量（EID50）、鸡胚平均致死时间（MDT）和1日龄雏鸡脑内接种致病指数（ICPI）。[结果]2株新城疫病毒均为强毒。通过RT-PCR技术对这2株鸭新城疫病毒的F基因进行序列测定与分析，结果发现F基因裂解位点为112RRQKRF117，符合NDV强毒株裂解位点氨基酸序列。F基因遗传进化树分析发现，AH1株属于基因Ⅶ型，而AH2株属于基因Ⅵ型，来源于鸽源病毒。[结论]水禽新城疫病毒（NDV）的感染来源复杂，应避免将不同种类的家禽混合饲养。
关键词鸭；新城疫病毒；分离；鉴定；F基因
中图分类号S855文献标识码A文章编号0517-6611（2017）22-0073-02
Abstract[Objective] To separate and identify newcastle disease virus （NDV） from duck. [Method] NDV were separated from diseased duck samples from Anhui Province and their EID50， MDT and ICPI were determined. [Result] Two strains of NDV were virulent. F gene of two strains of NDV were sequenced by RTPCR， and the results showed that the cleavage site of F gene of the viruses was 112RRQKRF117， which was accorded with the amino acid sequences of cleavage site of highlypathogenic strain of NDV. The genetic evolutionary tree analysis of F gene showed that AH1 belonged to genotype Ⅶ， but AH2 belonged to genotype Ⅵ， which was from pigeon sources. [Conclusion] The infection sources of NDV from water birds were complex， so the mixed breeding of different varieties of fowls should be avoided.
Key wordsDuck；NDV；Separation；Identification；F gene
新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的以感染禽類为主的一种急性、烈性传染病，近年来鸭、鹅等水禽感染NDV并发病的病例越来越多，也越来越严重，给我国的水禽养殖业带来了很大的经济损失[1-4]。该病没有明显的流行季节，一年四季均可发生，发生该病后，日龄稍大的患病水禽并未在短时间内大批死亡。如果有细菌等混合感染（主要是大肠杆菌病和传染性浆膜炎），会使死亡率升高。笔者对临床上2个疑似鸭ND病例进行了病毒分离与鉴定。
1材料和方法
1.1病料来源
2016年10月，临床诊治过程中接诊到2例发病蛋鸭，临床和解剖情况均相似。鸭群精神表现尚可，采食量略有下降，产蛋鸭的主要变化为产蛋率下降明显，有软壳蛋、畸形蛋、沙壳蛋，少数出现临床症状。有临床症状的病鸭发病初期拉白色稀粪，两腿无力，蹲伏地面或瘫痪，其后粪便呈水样、暗红色或墨绿色；食欲减退、少食或拒食，饮欲增加，有的病鸭呼吸道发出“呼噜”声，出现张口呼吸、甩头、咳嗽等呼吸道症状。使用头孢类、丁胺卡那霉素等多种抗生素治疗，效果不明显。剖检病死鸭没有典型的病理变化，可见肝脏充血、出血，盲肠扁桃体出血，肠道黏膜出血，气管内黏稠分泌物。采集发病鸭的气管、肝脏、脑、脾脏、胰腺等病料，用于分离与鉴定。
1.2试剂
SPF种蛋购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司，由安徽省农业科学院畜牧兽医研究所兽医临床诊断中心孵化至9～11日龄；NDV标准阳性血清、禽流感病毒（H5、H7、H9亚型）标准阳性血清、减蛋综合征（EDS）阳性血清，均购自哈尔滨兽医研究所；RNA提取试剂TRIzol，购自Invitrogen公司；M-MLV反转录酶、RNasin、dNTP、Taq-DNA，均购自大连TaKaRa公司；DNA凝胶回收试剂盒，购自GeneMark公司；特异性引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，预计扩增产物大小约900 bp；青霉素10 000 U/mL，链霉素10 mg/mL，庆大霉素和卡那霉素均为250 μg/mL。
1.3病毒分离与血清学鉴定
将采集的鸭病料按1∶5的比例加入四抗（青霉素、链霉素、庆大霉素和卡那霉素）溶液，在组织研磨器中研磨，制备组织匀浆。反复冻融3次，将匀浆转移到滅菌的离心管中，置于台式高速离心机中10 000 r/min离心5 min，吸取上清液，转移至另一灭菌离心管中，用等体积的四抗溶液稀释，再置于台式高速离心机中10 000 r/min离心5 min，吸取上清液，接种10日龄SPF鸡胚0.2 mL/个，各3个。收集24 h后死亡的鸡胚尿囊液，通过血凝试验（HA）测定其血凝效价，HA检测结果呈阴性的胚液继续传代，每代都检测HA结果，到第3代若收获的尿囊液仍为阴性，则应弃去。HA阳性的尿囊液分别用禽流感病毒的H5、H7、H9亚型标准阳性血清、ND标准阳性血清以及EDS阳性血清进行血凝抑制试验（HI）[5]。 1.4病毒毒力指標的测定
用灭菌生理盐水分别连续10倍（从10-4到10-9）递增稀释分离毒株，每个稀释度接种5枚10日龄SPF鸡胚，37 ℃孵育5 d，记录鸡胚的死亡情况，弃去24 h内死亡的鸡胚，收集其余鸡胚的尿囊液，通过红细胞凝集试验（HA）检测尿囊液效价，若HA的效价大于等于4判为阳性。采用Reed-Muench方法计算各毒株的鸡胚半数感染量（EID50），按照文献[6]的方法计算病毒的鸡胚平均致死时间（MDT）；根据测定的不同毒株的EID50和MDT，选择不同毒力的代表毒株测定1日龄雏鸡脑内接种致病指数（ICPI），将纯化的病毒用灭菌生理盐水稀释10倍，脑内接种1日龄SPF雏鸡，攻毒剂量为0.05 mL/只，每个毒株接种10只，按文献[6]的方法计算病毒的ICPI。
1.5病毒F基因的扩增与序列测定
参照GenBank中发表的鸭新城疫病毒F基因序列，应用Premier 5.0设计1对引物，用于扩增F基因，预计扩增产物大小为900 bp，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。上游引物P1为5′-CGTAGAAAAAACACGGGTAGAAGA-3′，下游引物P2为5′-CAGGTAGGTRGCACGCATATTATT-3′（R=G/A）。按照试剂盒说明书抽提病毒RNA，并进行反转录。以反转录产物cDNA为模板，利用PCR扩增分离病毒的F基因，PCR阳性产物经Gel Extrac-lion Mini Kit试剂盒回收纯化后送交生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列测定。
1.6病毒F基因序列分析
采用DNAStar 4.0版本中的EditSeq和MegAlign進行病毒F基因序列分析，分析多肽裂解位点氨基酸序列；使用NCBI网站提供的BLAST程序，与 GenBank 上发表的NDV基因组序列进行同源性比较和系统进化树分析，使用MEGA 5.0分析软件进行系统进化树的绘制和遗传进化分析。
2结果与分析
2.1病毒分离与鉴定
从发病鸭中分离有血凝性的病毒，接种病毒的鸡胚48 h就开始出现死亡。该病毒能被新城疫阳性血清中和，血凝抑制效价在25以上，对禽流感（H7、H5、H9亚型）和EDS阳性血清呈阴性，确定分离病毒为NDV。
2.2病毒毒力测定
由表1可知，2株病毒的3个毒力指标（EID50、MDT和ICPI）按照毒力判断标准均符合强毒力的特点，表明2株分离的新城疫病毒株为强毒株。
2.3病毒F基因的RT-PCR扩增
利用设计的引物对2株鸭NDV尿囊液提取的RNA进行RT-PCR扩增，得到1条大小约900 bp的特异性扩增条带，与预期设计的扩增片段大小相符（图1）。
2.4F蛋白裂解位点分析
2株病毒AH1和AH2多肽裂解位点氨基酸组成为112RRQKRF117，具有NDV强毒株的典型分子特征，表明2株分离的新城疫毒株为强毒株，与MDT、ICPI等毒力指标的测定结果相符。
2.5F基因系统进化树分析
从图2可以看出，AH1和AH2均与LaSota、F48E9、V4等传统毒株的的遗传距离较远，AH1与近年来流行毒株的基因型一致，为Class Ⅱ 系列中的Ⅶ型；AH2与鸽源毒株的遗传距离较近。
3结论
（1）传统观点认为，新城疫病毒对鸡的致病性较高，对鸭、鹅等水禽虽然感染但不发病，无明显的临床症状和剖检变化。但是，近年来NDV对于水禽表现出较高的致病性。该试验中分离的2株病毒的MDT分别为51.6和49.8 h（强毒株的MDT为40～60 h），ICPI分别为1.72和1.69（强毒株的ICPI≥1.6）；测序结果表明，分离的2株鸭NDV裂解位点区的氨基酸序列均为112R-R-Q-K-R-F117，与强毒株相应的氨基酸序列相符合。因此，判定这2株鸭源NDV分离株均为强毒株。
（2）由于AH1和AH2均与LaSota、F48E9、V4等传统毒株的的遗传距离较远，传统疫苗难以有效保护免疫鸭免受NDV的感染；由于AH1与近年来流行毒株的基因型同为Class Ⅱ 系列中的Ⅶ型，因此可用新城疫（ND）的Ⅶ型疫苗进行免疫。AH2为Class Ⅱ 系列中的Ⅵ型，来源于鸽源病毒，说明水禽NDV的感染来源复杂，因此应避免将不同种类的家禽混合饲养，以减少NDV的中间传播。
参考文献
[1] 于可响，马秀丽，吴静，等.一株鸭新城疫强毒的分离鉴定和分子特性分析[J].中国家禽，2011，33（16）：13-15.
[2] 袁圣丹，袁生.蛋鸭副黏病毒病的初步诊断和防治[J].中兽医学杂志，2011，16（3）：43-44.
[3] 张秀峰，丁壮，刘佳旭，等.鸭副黏病毒病的诊断与病毒分离鉴定[J].黑龙江畜牧兽医（综合指导版），2012（10）：92-93.
[4] 罗伟林，武嘉平.一例鸭源副黏病毒感染鸡的诊断与思考[J].中国家禽，2009，31（24）：70，72.
[5] 世界动物卫生组织.哺乳动物、禽和蜜蜂A和B类疾病诊断试验和疫苗标准手册[M].中华人民共和国农业部畜牧兽医局，译.北京：中国农业科学技术出版社，1996：136-146.
[6] ALEXANDER D J.Newcastle disease virus and other avian paramyxoviruses[M]//PURCHASE H G，ARP L H，DOMERMUTH C H，et al.A laboratory manual for the isolation and identification of avian pathogens.4th ed.Kennett Square，PA：America Association of Avian Pathologists，1998：156-163.
关键词鸭；新城疫病毒；分离；鉴定；F基因
中图分类号S855文献标识码A文章编号0517-6611（2017）22-0073-02
Abstract[Objective] To separate and identify newcastle disease virus （NDV） from duck. [Method] NDV were separated from diseased duck samples from Anhui Province and their EID50， MDT and ICPI were determined. [Result] Two strains of NDV were virulent. F gene of two strains of NDV were sequenced by RTPCR， and the results showed that the cleavage site of F gene of the viruses was 112RRQKRF117， which was accorded with the amino acid sequences of cleavage site of highlypathogenic strain of NDV. The genetic evolutionary tree analysis of F gene showed that AH1 belonged to genotype Ⅶ， but AH2 belonged to genotype Ⅵ， which was from pigeon sources. [Conclusion] The infection sources of NDV from water birds were complex， so the mixed breeding of different varieties of fowls should be avoided.
Key wordsDuck；NDV；Separation；Identification；F gene
新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的以感染禽類为主的一种急性、烈性传染病，近年来鸭、鹅等水禽感染NDV并发病的病例越来越多，也越来越严重，给我国的水禽养殖业带来了很大的经济损失[1-4]。该病没有明显的流行季节，一年四季均可发生，发生该病后，日龄稍大的患病水禽并未在短时间内大批死亡。如果有细菌等混合感染（主要是大肠杆菌病和传染性浆膜炎），会使死亡率升高。笔者对临床上2个疑似鸭ND病例进行了病毒分离与鉴定。
1材料和方法
1.1病料来源
2016年10月，临床诊治过程中接诊到2例发病蛋鸭，临床和解剖情况均相似。鸭群精神表现尚可，采食量略有下降，产蛋鸭的主要变化为产蛋率下降明显，有软壳蛋、畸形蛋、沙壳蛋，少数出现临床症状。有临床症状的病鸭发病初期拉白色稀粪，两腿无力，蹲伏地面或瘫痪，其后粪便呈水样、暗红色或墨绿色；食欲减退、少食或拒食，饮欲增加，有的病鸭呼吸道发出“呼噜”声，出现张口呼吸、甩头、咳嗽等呼吸道症状。使用头孢类、丁胺卡那霉素等多种抗生素治疗，效果不明显。剖检病死鸭没有典型的病理变化，可见肝脏充血、出血，盲肠扁桃体出血，肠道黏膜出血，气管内黏稠分泌物。采集发病鸭的气管、肝脏、脑、脾脏、胰腺等病料，用于分离与鉴定。
1.2试剂
SPF种蛋购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司，由安徽省农业科学院畜牧兽医研究所兽医临床诊断中心孵化至9～11日龄；NDV标准阳性血清、禽流感病毒（H5、H7、H9亚型）标准阳性血清、减蛋综合征（EDS）阳性血清，均购自哈尔滨兽医研究所；RNA提取试剂TRIzol，购自Invitrogen公司；M-MLV反转录酶、RNasin、dNTP、Taq-DNA，均购自大连TaKaRa公司；DNA凝胶回收试剂盒，购自GeneMark公司；特异性引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，预计扩增产物大小约900 bp；青霉素10 000 U/mL，链霉素10 mg/mL，庆大霉素和卡那霉素均为250 μg/mL。
1.3病毒分离与血清学鉴定
将采集的鸭病料按1∶5的比例加入四抗（青霉素、链霉素、庆大霉素和卡那霉素）溶液，在组织研磨器中研磨，制备组织匀浆。反复冻融3次，将匀浆转移到滅菌的离心管中，置于台式高速离心机中10 000 r/min离心5 min，吸取上清液，转移至另一灭菌离心管中，用等体积的四抗溶液稀释，再置于台式高速离心机中10 000 r/min离心5 min，吸取上清液，接种10日龄SPF鸡胚0.2 mL/个，各3个。收集24 h后死亡的鸡胚尿囊液，通过血凝试验（HA）测定其血凝效价，HA检测结果呈阴性的胚液继续传代，每代都检测HA结果，到第3代若收获的尿囊液仍为阴性，则应弃去。HA阳性的尿囊液分别用禽流感病毒的H5、H7、H9亚型标准阳性血清、ND标准阳性血清以及EDS阳性血清进行血凝抑制试验（HI）[5]。 1.4病毒毒力指標的测定
用灭菌生理盐水分别连续10倍（从10-4到10-9）递增稀释分离毒株，每个稀释度接种5枚10日龄SPF鸡胚，37 ℃孵育5 d，记录鸡胚的死亡情况，弃去24 h内死亡的鸡胚，收集其余鸡胚的尿囊液，通过红细胞凝集试验（HA）检测尿囊液效价，若HA的效价大于等于4判为阳性。采用Reed-Muench方法计算各毒株的鸡胚半数感染量（EID50），按照文献[6]的方法计算病毒的鸡胚平均致死时间（MDT）；根据测定的不同毒株的EID50和MDT，选择不同毒力的代表毒株测定1日龄雏鸡脑内接种致病指数（ICPI），将纯化的病毒用灭菌生理盐水稀释10倍，脑内接种1日龄SPF雏鸡，攻毒剂量为0.05 mL/只，每个毒株接种10只，按文献[6]的方法计算病毒的ICPI。
1.5病毒F基因的扩增与序列测定
参照GenBank中发表的鸭新城疫病毒F基因序列，应用Premier 5.0设计1对引物，用于扩增F基因，预计扩增产物大小为900 bp，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。上游引物P1为5′-CGTAGAAAAAACACGGGTAGAAGA-3′，下游引物P2为5′-CAGGTAGGTRGCACGCATATTATT-3′（R=G/A）。按照试剂盒说明书抽提病毒RNA，并进行反转录。以反转录产物cDNA为模板，利用PCR扩增分离病毒的F基因，PCR阳性产物经Gel Extrac-lion Mini Kit试剂盒回收纯化后送交生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列测定。
1.6病毒F基因序列分析
采用DNAStar 4.0版本中的EditSeq和MegAlign進行病毒F基因序列分析，分析多肽裂解位点氨基酸序列；使用NCBI网站提供的BLAST程序，与 GenBank 上发表的NDV基因组序列进行同源性比较和系统进化树分析，使用MEGA 5.0分析软件进行系统进化树的绘制和遗传进化分析。
2结果与分析
2.1病毒分离与鉴定
从发病鸭中分离有血凝性的病毒，接种病毒的鸡胚48 h就开始出现死亡。该病毒能被新城疫阳性血清中和，血凝抑制效价在25以上，对禽流感（H7、H5、H9亚型）和EDS阳性血清呈阴性，确定分离病毒为NDV。
2.2病毒毒力测定
由表1可知，2株病毒的3个毒力指标（EID50、MDT和ICPI）按照毒力判断标准均符合强毒力的特点，表明2株分离的新城疫病毒株为强毒株。
2.3病毒F基因的RT-PCR扩增
利用设计的引物对2株鸭NDV尿囊液提取的RNA进行RT-PCR扩增，得到1条大小约900 bp的特异性扩增条带，与预期设计的扩增片段大小相符（图1）。
2.4F蛋白裂解位点分析
2株病毒AH1和AH2多肽裂解位点氨基酸组成为112RRQKRF117，具有NDV强毒株的典型分子特征，表明2株分离的新城疫毒株为强毒株，与MDT、ICPI等毒力指标的测定结果相符。
2.5F基因系统进化树分析
从图2可以看出，AH1和AH2均与LaSota、F48E9、V4等传统毒株的的遗传距离较远，AH1与近年来流行毒株的基因型一致，为Class Ⅱ 系列中的Ⅶ型；AH2与鸽源毒株的遗传距离较近。
3结论
（1）传统观点认为，新城疫病毒对鸡的致病性较高，对鸭、鹅等水禽虽然感染但不发病，无明显的临床症状和剖检变化。但是，近年来NDV对于水禽表现出较高的致病性。该试验中分离的2株病毒的MDT分别为51.6和49.8 h（强毒株的MDT为40～60 h），ICPI分别为1.72和1.69（强毒株的ICPI≥1.6）；测序结果表明，分离的2株鸭NDV裂解位点区的氨基酸序列均为112R-R-Q-K-R-F117，与强毒株相应的氨基酸序列相符合。因此，判定这2株鸭源NDV分离株均为强毒株。
（2）由于AH1和AH2均与LaSota、F48E9、V4等传统毒株的的遗传距离较远，传统疫苗难以有效保护免疫鸭免受NDV的感染；由于AH1与近年来流行毒株的基因型同为Class Ⅱ 系列中的Ⅶ型，因此可用新城疫（ND）的Ⅶ型疫苗进行免疫。AH2为Class Ⅱ 系列中的Ⅵ型，来源于鸽源病毒，说明水禽NDV的感染来源复杂，因此应避免将不同种类的家禽混合饲养，以减少NDV的中间传播。
参考文献
[1] 于可响，马秀丽，吴静，等.一株鸭新城疫强毒的分离鉴定和分子特性分析[J].中国家禽，2011，33（16）：13-15.
[2] 袁圣丹，袁生.蛋鸭副黏病毒病的初步诊断和防治[J].中兽医学杂志，2011，16（3）：43-44.
[3] 张秀峰，丁壮，刘佳旭，等.鸭副黏病毒病的诊断与病毒分离鉴定[J].黑龙江畜牧兽医（综合指导版），2012（10）：92-93.
[4] 罗伟林，武嘉平.一例鸭源副黏病毒感染鸡的诊断与思考[J].中国家禽，2009，31（24）：70，72.
[5] 世界动物卫生组织.哺乳动物、禽和蜜蜂A和B类疾病诊断试验和疫苗标准手册[M].中华人民共和国农业部畜牧兽医局，译.北京：中国农业科学技术出版社，1996：136-146.
[6] ALEXANDER D J.Newcastle disease virus and other avian paramyxoviruses[M]//PURCHASE H G，ARP L H，DOMERMUTH C H，et al.A laboratory manual for the isolation and identification of avian pathogens.4th ed.Kennett Square，PA：America Association of Avian Pathologists，1998：156-163.