【摘 要】
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为了开发基于乳酸乳球菌载体表达的新型沙门氏菌口服疫苗,试验按照乳酸菌偏好优化密码子,将合成的截短的聚-γ-谷氨酸合成酶A(PgsA\')和截短的沙门氏菌鞭毛融合基因(Salmonella FliC)克隆到载体pUC57中,通过PCR和双酶切鉴定正确性;通过双酶切和T4连接插入目的 基因到乳酸乳球菌表达载体pNZ8048中,构建重组质粒pNZ8048-PgsA\'-FliC,通过PCR和双酶切鉴定正确性;提取质粒后将重组质粒利用电穿孔法转入乳酸乳球菌(Lactococcus lactis,L.lac
【机 构】
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天津农学院天津市畜禽病原检测与基因疫苗技术工程中心,天津300380
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为了开发基于乳酸乳球菌载体表达的新型沙门氏菌口服疫苗,试验按照乳酸菌偏好优化密码子,将合成的截短的聚-γ-谷氨酸合成酶A(PgsA\')和截短的沙门氏菌鞭毛融合基因(Salmonella FliC)克隆到载体pUC57中,通过PCR和双酶切鉴定正确性;通过双酶切和T4连接插入目的 基因到乳酸乳球菌表达载体pNZ8048中,构建重组质粒pNZ8048-PgsA\'-FliC,通过PCR和双酶切鉴定正确性;提取质粒后将重组质粒利用电穿孔法转入乳酸乳球菌(Lactococcus lactis,L.lactis)NZ9000中,挑取阳性克隆,扩增培养后提取质粒,通过PCR和双酶切鉴定正确性;通过Western-blot检测外源基因在重组菌中的表达情况;对Balb/c小鼠口服免疫重组乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8048-PgsA\'-FliC,以NZ9000/pNZ8048和PBS为对照,通过ELISA测定小肠黏液中特异性sIgA抗体表达水平.结果 表明:成功构建了重组质粒pNZ8048-PgsA\'-FliC与重组乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8048-PgsA\'-FliC,并成功表达PgsA\'-FliC蛋白,分子质量约为45 ku,重组蛋白在乳酸乳球菌细胞壁、破碎沉淀和破碎上清液均有表达.首免后10,20,30天,灌服乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8048小鼠的FliC特异性sIgA水平均与灌服PBS的小鼠差异不显著(P＞0.05).首免后10,30天,灌服重组乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8048-PgsA\'-FliC小鼠的FliC特异性sIgA水平显著高于灌服PBS的小鼠(P＜0.05);首免后20天,极显著高于灌服PBS的小鼠(P＜0.01).说明构建的重组乳酸乳球菌疫苗能引起动物产生特异性黏膜免疫.
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