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摘要：磷脂酶D是广泛存在于动植物各种组织和细胞中的一类磷酸二酯酶，自身及其代谢产物磷脂酸可以调控细胞内许多生理生化活动，例如细胞内囊泡运输、细胞表面受体的信号传导和细胞骨架蛋白重组等。本文主要讨论哺乳动物磷脂酶D家族的分子生物学特点，及其代谢产物磷脂酸在磷脂酶D调控细胞生理和代谢性疾病上所发挥的重要作用。
关键词：磷脂酶D；磷脂酸；细胞调控；囊泡融合
中图分类号： Q556 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0015-04
磷脂酶D（phospholipase D，PLD）最先是在胡萝卜提取物中发现的，具有磷酸二酯酶的活性，可以专一地水解卵磷脂产生脂质第二信使磷脂酸（phosphatidic acid，PA）和胆碱。PLD超家族成员广泛存在于病毒、细菌、酵母菌、植物及动物体中。在哺乳动物细胞中，除白细胞和少数淋巴细胞外，均有PLD活性存在。20世纪90年代，研究人员克隆了PLD基因，发现PLD的活性及其代谢产物对动物的生理过程和某些疾病发生产生影响，如炎症、糖尿病、细胞骨架重建、囊泡运输和胞外分泌、肿瘤形成，以及嗜中性粒细胞氧化呼吸链的阻断等。这些发现均来自于PLD的磷酸基团转移作用，即在有水或一级醇（如乙醇、丁-1-醇）存在时，PLD能催化水解卵磷脂产生PA和磷脂酰乙醇或磷脂酰丁-1-醇。PA作为PLD在细胞中的主要代谢产物，在细胞内受到严格的调控。PA还可以被转化成为另外2个具有生物活性的脂质分子，甘油二酯（diacylglycerol，DAG）和溶血磷脂酸（phosphatidicacid，LPA）。PA与这2个活性分子参与细胞中骨架蛋白重建、囊泡运输和受体信号传导等重要生理过程。本文主要讨论哺乳动物PLD代谢的前体和产物，尤其是磷脂酸在PLD功能发挥中的作用。
1 磷脂酶D家族分子生物学特点
从植物、细菌和哺乳动物中克隆的磷脂酶D组成一个基因家族，具有一系列高度保守序列和特征，这个基因家族包括细菌PLD、磷酸转移酶/磷脂合成酶、核酸内切酶和一些病毒外壳结构蛋白。目前对动物体中对PLD1、PLD2的研究较多，主要关注点是磷脂酰胆碱专一性磷脂酶D在糖尿病中性粒细胞和心脏、血管、肾脏、神经组织细胞中的酶活性改变，及其引起糖尿病各种并发症改变的信号传导途径。PLD3、PLD4、PLD5基因是最近克隆出来的，它们具有与PLD1、PLD2相似的功能域（图1），但其功能和表达调控的研究才刚刚开始。总之，PLD作为细胞信号传导中重要的酶分子，参与了细胞功能的诸多方面，其具体的作用机制研究成为目前关注的热点。
1.1 磷脂酶D家族的分子结构
所有克隆得到的真核生物PLD都具有一个相对保守的核心催化功能域（PLDc）、N-末端、C-末端区域。PLD催化核心域一般有Ⅰ～Ⅳ个域组成。在这4个短序列区域中，域Ⅰ和域Ⅱ、域Ⅲ、域Ⅳ具有特别相似的结构。保守域Ⅱ和Ⅲ之间插入的不同非保守片段也说明了这一点，并且这些插入片段或者Loop区对于人PLD1活性并非必需。除了域Ⅰ～Ⅳ域，在酵母、人和线虫的序列中仍有其他的结构域，如核心催化功能域HKD基序，N末端的PX域（phox domain）和PH域（pleckstrin donmain）。PLD家族成员都具有一个保守序列（HXKX4DX6GG/S），它具有的催化活性使得PLD家族成员有相似的作用机理。HKD基序在PLD 家族中具有高度保守性。对PLD1、PLD2的研究表明，HKD基序中的组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸残基是催化作用所必需的。HKD 基序是PLD 的標志序列，具有催化水解的活性。这意味着真核生物PLD基因可能由同一基因经过复制和融合等基因重组过程进化而来。
有研究表明，PH域对于蛋白质的定位至关重要，序列缺失和定点突变会导致该蛋白不能在细胞内正确定位。PH域介导PLD1结合到脂质筏上，促进该酶的早期复性从而使其转位到内涵体的质膜上[1]。删除PH域并不影响PLD的酶活性，也不改变PLD催化反应对PI-4，5-P2依赖性，这导致了PI-4，5-P2结合基序的发现[2]。研究发现，PLD的PX域能够介导蛋白质-蛋白质相互作用或者结合磷酸肌醇[3]。与其他磷酸肌醇单磷酸（如PI5P）明显不同，PX域能够优先与磷酸肌醇三磷酸结合[4]。相反，在脂质体结合分析中PX域却与PI5P优先结合，由于PI5P是细胞内吞所需要的脂质体，这将有利于PLD1从质膜进入吞噬泡。与PLD2不同，PLD1具有保守的LOOP域，这一功能域具有负调控元件的作用，将该功能域缺失会导致PLD1的活性下降3倍。对PLD3、PLD4、PLD5进行蛋白质功能域预测分析，发现它们都没有PH和PX功能域，但却均在2个催化活性域之间多出1个envelope功能域。envelope功能域一般存在于病毒包膜蛋白中，而结合在质膜上的PLD通常通过把磷脂转化成磷脂酸来改变细胞膜的脂质结构，从而调节细胞内的脂质运动，这预示着这3个磷脂酶D很有可能具有不同于PLD1、PLD2的功能。
1.2 磷脂酶D的细胞定位
PLD1和PLD2在细胞中的定位是不同的。通过研究不同细胞系发现，PLD1主要分布于核周际，如高尔基体、内质网或后期囊泡[5]。也有观点相反的报道认为，PLD1只分布于后期囊泡和溶酶体中，高尔基体中就没有PLD1的分布[6]，而在未被刺激的细胞中，PLD1只分布于质膜[7]。但是现在研究发现，受到外界刺激后PLD1会转移到质膜[8]。实际上，由于细胞系囊泡循环的频率和数量不同以及PLD1调控的定位，只能以细胞内PLD1动态循环的概念来解释。
PLD2主要分布于质膜[9]，同时在胞质、囊泡体[10]和β肌动蛋白[11]中也有分布。在血清和表皮生长因子（EGF）刺激下PLD2会转移到细胞膜褶皱上。
2 PLD代谢产物PA的功能 [8]Huang P，Altshuller Y M，Hou J C，et al. Insulin-stimulated plasma membrane fusion of Glut4 glucose transporter-containing vesicles is regulated by phospholipase D1[J]. Molecular Biology of the Cell，2005，16（6）：2614-2623.
[9]Hsu Y L，Hung J Y，Ko Y C，et al. Phospholipase D signaling pathway is involved in lung cancer-derived IL-8 increased osteoclastogenesis[J]. Carcinogenesis，2010，31（4）：587-596.
[10]Divecha N，Roefs M，Halstead J R，et al. Interaction of the type Ⅰ alpha PIPkinase with phospholipase D：a role for the local generation of phosphatidylinositol 4，5-bisphosphate in the regulation of PLD2 activity[J]. The EMBO Journal，2000，19（20）：5440-5449.
[11]Lee S，Park J B，Kim J H，et al. Actin directly interacts with phospholipase D，inhibiting its activity[J]. The Journal of Biological Chemistry，2001，276（30）：28252-28260.
[12]Liu Y，Su Y，Wang X. Phosphatidic acid-mediated signaling[J]. Advances in Experimental Medicine and Biology，2013，991（3）：159-176.
[13]Jones D H，Morris J B，Morgan C P，et al. Type Ⅰ phosphatidylinositol 4-phosphate 5-kinase directly interacts with ADP-ribosylation factor 1 and is responsible for phosphatidylinositol 4，5-bisphosphate synthesis in the golgi compartment[J]. The Journal of Biological Chemistry，2000，275（18）：13962-13966.
[14]Arisz S A，Munnik T. Distinguishing phosphatidic acid pools from de novo synthesis，PLD，and DGK[J]. Methods in Molecular Biology，2013，1009：55-62.
[15]Jaafar R，Larichaudy J D，Chanon S，et al. Phospholipase D regulates the size of skeletal muscle cells through the activation of mTOR signaling[J]. Cell Communication and Signaling，2013，11（3）：55.
[16]Cheol S J，Woo K D，Mo Y K，et al. Phospholipase D inhibitor enhances radiosensitivity of breast cancer cells[J]. Experimental
关键词：磷脂酶D；磷脂酸；细胞调控；囊泡融合
中图分类号： Q556 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0015-04
磷脂酶D（phospholipase D，PLD）最先是在胡萝卜提取物中发现的，具有磷酸二酯酶的活性，可以专一地水解卵磷脂产生脂质第二信使磷脂酸（phosphatidic acid，PA）和胆碱。PLD超家族成员广泛存在于病毒、细菌、酵母菌、植物及动物体中。在哺乳动物细胞中，除白细胞和少数淋巴细胞外，均有PLD活性存在。20世纪90年代，研究人员克隆了PLD基因，发现PLD的活性及其代谢产物对动物的生理过程和某些疾病发生产生影响，如炎症、糖尿病、细胞骨架重建、囊泡运输和胞外分泌、肿瘤形成，以及嗜中性粒细胞氧化呼吸链的阻断等。这些发现均来自于PLD的磷酸基团转移作用，即在有水或一级醇（如乙醇、丁-1-醇）存在时，PLD能催化水解卵磷脂产生PA和磷脂酰乙醇或磷脂酰丁-1-醇。PA作为PLD在细胞中的主要代谢产物，在细胞内受到严格的调控。PA还可以被转化成为另外2个具有生物活性的脂质分子，甘油二酯（diacylglycerol，DAG）和溶血磷脂酸（phosphatidicacid，LPA）。PA与这2个活性分子参与细胞中骨架蛋白重建、囊泡运输和受体信号传导等重要生理过程。本文主要讨论哺乳动物PLD代谢的前体和产物，尤其是磷脂酸在PLD功能发挥中的作用。
1 磷脂酶D家族分子生物学特点
从植物、细菌和哺乳动物中克隆的磷脂酶D组成一个基因家族，具有一系列高度保守序列和特征，这个基因家族包括细菌PLD、磷酸转移酶/磷脂合成酶、核酸内切酶和一些病毒外壳结构蛋白。目前对动物体中对PLD1、PLD2的研究较多，主要关注点是磷脂酰胆碱专一性磷脂酶D在糖尿病中性粒细胞和心脏、血管、肾脏、神经组织细胞中的酶活性改变，及其引起糖尿病各种并发症改变的信号传导途径。PLD3、PLD4、PLD5基因是最近克隆出来的，它们具有与PLD1、PLD2相似的功能域（图1），但其功能和表达调控的研究才刚刚开始。总之，PLD作为细胞信号传导中重要的酶分子，参与了细胞功能的诸多方面，其具体的作用机制研究成为目前关注的热点。
1.1 磷脂酶D家族的分子结构
所有克隆得到的真核生物PLD都具有一个相对保守的核心催化功能域（PLDc）、N-末端、C-末端区域。PLD催化核心域一般有Ⅰ～Ⅳ个域组成。在这4个短序列区域中，域Ⅰ和域Ⅱ、域Ⅲ、域Ⅳ具有特别相似的结构。保守域Ⅱ和Ⅲ之间插入的不同非保守片段也说明了这一点，并且这些插入片段或者Loop区对于人PLD1活性并非必需。除了域Ⅰ～Ⅳ域，在酵母、人和线虫的序列中仍有其他的结构域，如核心催化功能域HKD基序，N末端的PX域（phox domain）和PH域（pleckstrin donmain）。PLD家族成员都具有一个保守序列（HXKX4DX6GG/S），它具有的催化活性使得PLD家族成员有相似的作用机理。HKD基序在PLD 家族中具有高度保守性。对PLD1、PLD2的研究表明，HKD基序中的组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸残基是催化作用所必需的。HKD 基序是PLD 的標志序列，具有催化水解的活性。这意味着真核生物PLD基因可能由同一基因经过复制和融合等基因重组过程进化而来。
有研究表明，PH域对于蛋白质的定位至关重要，序列缺失和定点突变会导致该蛋白不能在细胞内正确定位。PH域介导PLD1结合到脂质筏上，促进该酶的早期复性从而使其转位到内涵体的质膜上[1]。删除PH域并不影响PLD的酶活性，也不改变PLD催化反应对PI-4，5-P2依赖性，这导致了PI-4，5-P2结合基序的发现[2]。研究发现，PLD的PX域能够介导蛋白质-蛋白质相互作用或者结合磷酸肌醇[3]。与其他磷酸肌醇单磷酸（如PI5P）明显不同，PX域能够优先与磷酸肌醇三磷酸结合[4]。相反，在脂质体结合分析中PX域却与PI5P优先结合，由于PI5P是细胞内吞所需要的脂质体，这将有利于PLD1从质膜进入吞噬泡。与PLD2不同，PLD1具有保守的LOOP域，这一功能域具有负调控元件的作用，将该功能域缺失会导致PLD1的活性下降3倍。对PLD3、PLD4、PLD5进行蛋白质功能域预测分析，发现它们都没有PH和PX功能域，但却均在2个催化活性域之间多出1个envelope功能域。envelope功能域一般存在于病毒包膜蛋白中，而结合在质膜上的PLD通常通过把磷脂转化成磷脂酸来改变细胞膜的脂质结构，从而调节细胞内的脂质运动，这预示着这3个磷脂酶D很有可能具有不同于PLD1、PLD2的功能。
1.2 磷脂酶D的细胞定位
PLD1和PLD2在细胞中的定位是不同的。通过研究不同细胞系发现，PLD1主要分布于核周际，如高尔基体、内质网或后期囊泡[5]。也有观点相反的报道认为，PLD1只分布于后期囊泡和溶酶体中，高尔基体中就没有PLD1的分布[6]，而在未被刺激的细胞中，PLD1只分布于质膜[7]。但是现在研究发现，受到外界刺激后PLD1会转移到质膜[8]。实际上，由于细胞系囊泡循环的频率和数量不同以及PLD1调控的定位，只能以细胞内PLD1动态循环的概念来解释。
PLD2主要分布于质膜[9]，同时在胞质、囊泡体[10]和β肌动蛋白[11]中也有分布。在血清和表皮生长因子（EGF）刺激下PLD2会转移到细胞膜褶皱上。
2 PLD代谢产物PA的功能 [8]Huang P，Altshuller Y M，Hou J C，et al. Insulin-stimulated plasma membrane fusion of Glut4 glucose transporter-containing vesicles is regulated by phospholipase D1[J]. Molecular Biology of the Cell，2005，16（6）：2614-2623.
[9]Hsu Y L，Hung J Y，Ko Y C，et al. Phospholipase D signaling pathway is involved in lung cancer-derived IL-8 increased osteoclastogenesis[J]. Carcinogenesis，2010，31（4）：587-596.
[10]Divecha N，Roefs M，Halstead J R，et al. Interaction of the type Ⅰ alpha PIPkinase with phospholipase D：a role for the local generation of phosphatidylinositol 4，5-bisphosphate in the regulation of PLD2 activity[J]. The EMBO Journal，2000，19（20）：5440-5449.
[11]Lee S，Park J B，Kim J H，et al. Actin directly interacts with phospholipase D，inhibiting its activity[J]. The Journal of Biological Chemistry，2001，276（30）：28252-28260.
[12]Liu Y，Su Y，Wang X. Phosphatidic acid-mediated signaling[J]. Advances in Experimental Medicine and Biology，2013，991（3）：159-176.
[13]Jones D H，Morris J B，Morgan C P，et al. Type Ⅰ phosphatidylinositol 4-phosphate 5-kinase directly interacts with ADP-ribosylation factor 1 and is responsible for phosphatidylinositol 4，5-bisphosphate synthesis in the golgi compartment[J]. The Journal of Biological Chemistry，2000，275（18）：13962-13966.
[14]Arisz S A，Munnik T. Distinguishing phosphatidic acid pools from de novo synthesis，PLD，and DGK[J]. Methods in Molecular Biology，2013，1009：55-62.
[15]Jaafar R，Larichaudy J D，Chanon S，et al. Phospholipase D regulates the size of skeletal muscle cells through the activation of mTOR signaling[J]. Cell Communication and Signaling，2013，11（3）：55.
[16]Cheol S J，Woo K D，Mo Y K，et al. Phospholipase D inhibitor enhances radiosensitivity of breast cancer cells[J]. Experimental