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摘要 钙离子在生命活动中具有重要作用。本文系统介绍了团队前期研究成果，并结合国内外相关研究，基于生物化学对钙离子与经络腧穴关系，从经穴钙离子分布、针刺对经穴钙离子浓度的影响、脏腑病变时外周经穴钙离子浓度变化、络合钙离子对针刺效应的影响以及钙离子与神经、肥大细胞的关系等方面进行了全面的论述，以期推动经穴物质基础的研究，为经络腧穴的研究提供依据。
关键词 钙离子;针刺;针型传感器;经穴钙离子分布特异性;络合;肥大细胞
Abstract Calcium ions play an important role in human daily life. This paper systematically analyzed the early achievements of the research team， combined with related domestic and international research. Based on the relationship between calcium ions and meridian acupoints of biochemistry， the distribution of calcium ions in acupuncture points， the effects of acupuncture on calcium concentration in meridian points and calcium in peripheral meridian points during visceral and sacral disease changes in ion concentration， the effects of complexed calcium ions on acupuncture effects， and the relationship between calcium ions and nerves and mast cells were comprehensively discussed in order to promote the study of the material basis of meridian points and provide a basis for the study of meridian points.
Keywords Calcium ion; Acupuncture; Needle sensor; Specificity of calcium ion distribution in acupoints; Complexation; Mast cells
经络腧穴研究是现代生命科学的前沿课题，也是医学科学研究的重要方面。建国以来，在国家的大力支持下，经络腧穴的研究经过几代人艰辛努力，取得了重要进展。经络腧穴的物质基础研究是经络研究的重要方面。从上世纪80年代开始，本团队以钙离子为切入点，对经络腧穴的物质基础从生物化學角度开展了系列研究，承担了国家“八五”攀登计划——经络的研究课题、国家“八五”攻关计划、国家自然科学基金、教育部霍英东青年教师科学基金等课题，获得了天津市科技进步奖三等奖、中华中医药学会科技进步奖三等奖等，现结合有关国内外的研究进展介绍如下。
1 钙离子和钙离子选择性针型化学传感器
钙离子是生物体内非常重要的无机离子，是机体功能活动的综合调节剂，可分为细胞内Ca2+和细胞外Ca2+[1]。正常情况下细胞内外液Ca2+浓度保持动态平衡。当这种平衡被打破以后，将会出现细胞的损伤和疾病。Ca2+作为细胞中的第二信使，参与并调控着细胞增殖、代谢等多种生理和生化过程[2]，以及细胞内与细胞间的信号转导。此外，在凝血、腺体细胞分泌、骨骼肌兴奋、神经传导、卵子和精子受精、免疫细胞吞噬中也起着重要作用。常见疾病如高血压、冠心病、肝损伤及脑损伤等均与钙离子密切相关。当细胞内Ca2+浓度过高时，会引起钙稳态失调[3]和兴奋性氨基酸失控性的过量释放[4]，进而引起神经毒性作用，对中枢神经系统造成损伤，故钙通道阻断剂的使用可以产生神经保护作用。心肌肥厚、心律失常和心力衰竭等多种心血管系统疾病的病理过程中均会发生T管重构，该过程通过对Ca2+的调节，影响心肌细胞兴奋-收缩耦联、多种离子通道以及胞内信号转导过程[5]。研究发现，针刺能够调节钙离子浓度，Ca2+是针刺信号放大的关键因素之一，是针刺网络调节效应的重要节点。现代研究表明，阿片类物质的镇痛作用与Ca2+密切相关，Ca2+也参与了针刺效应的众多过程。因此，Ca2+可能在针刺网络信号的调控过程中起到了极其重要和广泛的作用[6]。
美国科学家D·A尤克曾说过：“人体的大部分功能都是依据化学原理进行的”。工欲善其事，必先利其器。要研究化学物质与经络腧穴的关系，化学物质的检测就成为重要的问题。我们与南开大学合作，研制成功了多种化学传感器——钙离子、钾离子、钠离子、氢离子、氧分压等针型化学传感器，建成了国家中医药管理局科研三级实验室——医用化学传感器实验室。所谓针型传感器即传感针，是基于针灸针或不锈钢针头，应用多种现代技术加工而成针灸针形状，能够在体监测传感机体内温度、pH值、氧分压、Ca2+等浓度的一种特殊传感器。传感针可在体、定位、微创、即时、连续动态地测量人体内某种物质浓度的变化[7]。
据Ca2+选择性电极的基本原理，将Ca2+选择性玻璃或塑料管电极，穿入空心针灸针或注射针头内组成针型传感器。以Ca2+敏感膜修饰后的针型传感器作为工作电极，饱和甘汞电极或针灸针和注射针头为参比电极，含有Ca2+的溶液为待测液，三者组成一个双电极闭合回路。检测时，针尖上的敏感膜选择性吸附待测液中的Ca2+，使传感器膜电势发生改变，膜电势与敏感Ca2+活度符合能斯特关系式，因此可以根据膜电势变化计算Ca2+浓度。本团队研制了Ca2+单管玻璃针型传感器、双管玻璃针型传感器和单管塑料电极传感器，用于不同浓度Ca2+的检测后，发现这3种电极对Ca2+的检测性能大致相同，其中玻璃电极的响应速度快、蘸膜后对膜溶液影响不大，但制作复杂、刺入皮肤容易折断，不适用于人体试验;塑料电极响应速度慢、蘸膜后对膜溶液影响较大，但制作简单、不易折断，可用于人体实验。将塑料电极传感器用于家兔肌肉中Ca2+浓度变化的检测中，发现该传感器能够灵敏反应Ca2+浓度的变化。所研制的塑料电极传感器虽然有望用于人体检测，但膜活性材料的污染问题仍需要进一步解决。有关传感器性能已经经过天津市科委组织的专家成果鉴定。 2 经穴钙离子分布及针刺对经穴钙离子分布的影响
2.1 经穴钙离子分布
2.1.1 生理状态下经穴钙离子浓度分布 生理状态下，经络及腧穴处Ca2+浓度显著高于非经非穴处，经穴Ca2+分布具有特异性。我们采用以上研制的针型Ca2+化学传感器，检测比较了家兔8个腧穴及与其对应非穴点处Ca2+浓度的差异以及“足阳明胃经”“任脉”上的在经非穴点及与其对应的非经非穴处Ca2+浓度的差异，首次发现穴位处的Ca2+浓度比非穴位处浓度高，差异有统计学意义[8]，某些经脉上某些点的Ca2+浓度也高于非经非穴处。在人体实验中，用自制塑料管针型钙离子传感器，检测了人体穴位Ca2+浓度分布，发现人体部分经穴处的Ca2+浓度高于旁开对照的非经穴处，即人体经穴处存在Ca2+浓度的富集[9]，研究结果与动物实验一致。复旦大学丁光宏、费伦[10]观察组利用PIES技术，对人体尸体部分穴位处的钙元素含量进行了测量，结果也显示经穴处的钙元素含量高于旁开的非经穴处。此后团队以家兔为实验对象，以推挽灌流技术采集足三里穴针尖“地部”组织液，发现足三里穴的钙元素浓度高于旁开对照点，认为足三里穴处的钙元素可能存在富集[11]。团队也利用微透析技术提取家兔中脘穴与旁开点非穴位处的组织液，结果发现家兔中脘穴处的钙离子、钾离子浓度明显高于非经非穴处，进一步证明了Ca2+在经穴处富集的分布特点[12]。华中科技大学[13-14]以自制的钙离子针型传感器为工作电极，对山羊大肠俞、肝俞和关元俞3个穴位和非穴位区Ca2+浓度进行比较，发现这3个穴位Ca2+浓度都明显高于非穴位区，且传统的针灸穴位具有高氧分压和高Ca2+浓度特性，实验结果也证明了钙离子在穴位分布的特异性。香港大学应用磁共振成像的手段观察到了垂直于经络传导的震荡横波和Ca2+富集现象。也有学者对大鼠穴位注射钙离子络合剂后电针反复刺激穴位，以鉬钯影像摄片，观察到穴位局部有Ca2+聚集的高密度影[15]。
2.1.2 病理状态下经穴钙离子浓度变化 穴位是疾病信息的反应点。当脏腑发生病变时，往往在相应的经穴上出现一些变化，主要包括组织形态学变化（如出现条索状物、结节等）;感觉异常变化（如压痛等）;生物物理学变化（如电阻的变化等）。研究表明，病理状态下腧穴处Ca2+浓度会发生特异性变化。团队用钙离子针型传感器检测到，在家免发生急性心律失常过程中，心包经上（曲泽、内关上2 cm）Ca2+浓度下降，而非心包经（曲池、足三里上2 cm）Ca2+浓度的变化不明显，即当脏腑发生病变时，相应的经穴处存在钙离子浓度的特异性变化，且穴位处Ca2+浓度变化与心律失常的向愈相关。研究提示外周经脉上Ca2+是经穴与脏腑相关的重要环节，在经脉信息传导中具有重要的作用[16]。昆明医学院赵钦[17]等对急性胸膜炎家兔左右耳相关穴位处钙离子等化学元素检测显示，当脏腑发生病变时，相应耳穴处的钙元素浓度也高于旁开非经穴处，说明在病理状态下Ca2+等化学元素会在与脏腑关系密切的耳穴区域富集。顾星[18]也发现，急性胃黏膜损伤家兔足三里穴灌流液中Ca2+浓度升高。我们团队研究发现[19]，肥大细胞密度在腧穴区明显高于非穴区，经脉线上的肥大细胞也相对丰富，且经穴区肥大细胞代谢更为旺盛。而络合穴区Ca2+后，针刺效应丧失或减弱的同时，穴区皮肤、肌肉处肥大细胞脱颗粒现象也相应减弱，肥大细胞脱颗粒与Ca2+浓度升高密切相关，疾病状态下，肥大细胞及Ca2+在腧穴区均存在特异性聚集现象。以上实验均表明，病理状态下经穴Ca2+会出现与疾病相关的特异性改变。
2.2 针刺对经穴钙离子分布的影响 针刺能够使经穴钙离子重新分布。团队研究表明[20]，针刺本经穴点可使本经其他穴位处Ca2+浓度升高，而使旁开对照点Ca2+浓度有下降趋势，即针刺可引起经脉线内外Ca2+的重新分布，提示Ca2+可能参与了针刺“得气”过程。实验结果还显示，针刺经外旁开点对本经穴位的Ca2+浓度影响不大，说明经脉线在传导针刺信息方面具有特异性，同时这一结果也证明了针灸学“宁失其穴，勿失其经”理论的正确性[21]。胡利民等[22]观察了针刺内关对乌头碱性心律失常家兔心包经上Ca2+浓度动态变化的影响，发现针刺内关后因心律失常导致的Ca2+浓度下降幅度降低，30 min后可恢复至原有水平，而相应对照点（曲池、足三里等）处无明显变化，说明针刺治疗可调整Ca2+浓度的变化。Rui Gao等[23]应用微透析技术检测2 Hz电针刺激大鼠足三里穴后穴位局部Ca2+的变化，发现电针可以显著增加穴位处Ca2+的浓度，针刺过程中Ca2+水平逐渐升高，60 min达到峰值，并于120 min后降低，与团队实验结果一致。香港大学Geng Li等[24]针刺小鼠足三里穴后，通过双光子共聚焦显微镜监测Ca2+水平。发现后肢肌肉纤维中荧光强度显著增加，且该荧光信号随后传播至邻近的肌肉纤维，表明针刺刺激可引起穴位局部Ca2+反應，进一步导致胞质Ca2+活化产生针刺效应。台湾国立中央大学Yang ES等[25]也认为针刺能够导致Ca2+通道的机械波激活而发挥针效，这些研究印证了针刺对经穴Ca2+产生影响，且Ca2+可能是针刺信号传导的重要环节。
此外，人体实验也证明了针刺能够改变经穴处钙离子的浓度，团队曾以健康成年男性为受试对象，开展针刺对经穴Ca2+浓度影响的研究，发现针刺上巨虚后，同经腧穴足三里、解溪穴处的Ca2+浓度升高，而对足三里旁开点的Ca2+浓度影响不大;针刺上巨虚旁开点对足三里及其旁开点的Ca2+浓度无显著影响;针刺足三里旁开点对解溪穴处的Ca2+浓度亦无显著影响，但可使解溪旁开点的Ca2+浓度升高。以上试验结果与动物实验的结论相符，表明在针刺状态下，经脉线的离子浓度存在特异性变化。结合穴位处钙离子浓度分布的特点及其针灸理论与临床实践，参考几十年来经络与针灸作用原理的研究成果，我们认为钙离子与循经信息的传导具有非常密切的关系。 3 调控穴位处钙离子对针刺效应的影响
穴位处钙离子浓度改变在针刺信号的传导中可能起到重要的作用，为了证明这一点，团队通过改变穴位钙离子浓度、阻断钙离子通道及钙离子的配体进行研究和论证。
3.1 络合钙离子 前期研究发现，针刺能够缩短心律失常的时间，但向“内关”处注射EDTA后（钙离子的特异性络合剂）再针刺“内关”穴，大鼠心率失常的时间未能缩短，说明络合“内关”穴后，针效降低[26]。除内关穴外，络合足三里穴处钙离子能使其促进小鼠胃排空率的效应降低[27]，也能阻断针刺抑制胃运动频率的效应[28]。如裴莹等[29]应用雄性昆明小鼠造成胃损伤模型，络合足三里穴处Ca2+后再行针刺，发现针效显著降低，同时能够抑制机体自身的恢复功能，且存在EGTA（钙离子络合剂）浓度越高，针效受影响越大的趋势，提示钙离子与针刺效应之间存在一定的量效关系。大量实验结果也证明了该现象的普适性，提示Ca2+可能是针刺效应产生的关键因素，是经络功能活动的重要物质基础之一。反之，若升高穴位钙离子浓度，是否可影响针刺效应？团队前期实验结果表明，穴位注射不同浓度的CaCl2溶液后，针刺效应继续存在，也未见提高，提示升高针刺部位的Ca2+浓度对针刺效应影响不大，这也可能存在其他原因，有待今后进一步研究。
3.2 阻断钙离子通道 Ca2+进入细胞内的途径主要有钙泵、Na+-Ca2+交换和Ca2+-H+交换。生理情况下，Ca2+进入细胞内可激活众多生理活动。病理状态下，各种原因引起的细胞内钙含量异常增多，可导致细胞结构损伤和功能代谢障碍的现象称为钙超载。质膜钙通道是引起钙超载的关键因素，主要有两大类型：电压依赖性钙通道和受体操纵性钙通道，针刺的循经特异性效应在心脏Ca2+通道的响应模式是改善Ca2+通道蛋白表达的异常升高，抑制钙超载[30]。Syarif Sudirman等[31]采用维拉帕米作为特异性L钙离子通道阻滞剂，omega conotoxin GVIA作为特异性N钙离子通道阻滞剂，以家鼠为研究对象，探索阻断Ca2+通道对针麻效果的影响，结果表明针刺加维拉帕米和omega conotoxin GVIA均可降低但未完全消除针麻作用。我们团队用Mn2+阻断内关穴细胞膜上电压门控性Ca2+通道后，针刺内关的效应消失，用硝苯吡啶阻断Ca2+通道后，针刺内关的效应部分消失[32]。此后在实验性家兔心律失常模型上阻断心包经曲泽穴细胞膜上电压门控性钙离子通道，观察该处钙离子通道阻断后对针刺内关治疗家兔心律失常效应的影响，发现阻断曲泽穴处细胞膜上钙离子通道后，针刺内关效应消失，而阻断尺泽穴处细胞膜上钙离子通道后再针刺内关，针刺效应无明显改变[33]。提示针效的发挥、经络活动与针刺部位所在经络线细胞膜上电压门控性Ca2+通道（VOCs）相关，也说明Ca2+参与经络活动主要是通过Ca2+从胞外进入胞内而实现的。
3.3 阻断钙离子配体 钙调蛋白（CaM）是一种钙离子结合蛋白，能与钙通道结合并有很强的调节功能，很多文献将其归于钙通道亚基的一种。CaM作为细胞内Ca2+配体可与Ca2+可逆性结合。研究发现，心肌缺血时心肌细胞钙离子通道蛋白Cavα1C、Cavβ、Cavα2-δ1、CaM及CaMKII表达升高，电针内关穴可明显降低上述蛋白表达的升高，说明针刺内关穴治疗心肌缺血在心肌细胞钙离子通道的响应模式是抑制钙通道及相关蛋白表达，从而抑制因钙超载引起的心肌损伤。Ca2+可通过与CaM结合，激活钙激酶（如CaMKII）而发挥作用[28]。
三氟拉嗪（TFP）为经典CaM拮抗剂，可在Ca2+存在下与CaM高亲和部位结合，使CaM失活，从而有效阻断Ca-CaM复合物对靶酶的激活。利用此原理，我们团队[34]在大鼠胃运动减低模型中使用经典钙调素拮抗剂三氟拉嗪溶液注射于双侧足三里穴区，在局部穴区钙调素失活状态下，观察针刺足三里对胃运动低下的影响。研究结果显示，局部穴区CaM失活状态下，在行针5 min期间针效丧失，留针期间针效有部分丧失，但随时间延长针效逐渐恢复，说明CaM在针刺行针过程中参与了经络活动。其中针效随时间延长可恢复的原因仍有待进一步研究阐明。
4 经穴钙离子与神经、肥大细胞等的关系研究
大量前期研究表明，穴位局部钙离子在针刺效应的产生中具有相当重要的作用，那么钙离子是通过哪些环节来发挥这些作用的？研究表明钙离子和神经、肥大细胞关系密切，据此我们开展了有关钙离子和神经、肥大细胞的关系研究。
4.1 钙离子与神经 Ca2+是针效产生机制的重要环节之一，其在针刺神经电信号传导过程中起着重要作用[35]。研究表明Ca2+与神经细胞之间关系密切，Ca2+可以引起神经冲动，能有效调控突触前和突触后的调节机制，具有可控制突触后离子通道功能和逆行抑制神经递质释放机制的双重调节作用。此外，神经细胞的凋亡与Ca2+浓度也有关[36]。团队陈静子等[37]在探讨Ca2+对针刺电信号影响的特征和规律研究中，选用健康成年雄性SD大鼠作为研究对象，络合足三里穴区Ca2+后观察神经细束的放电情况，并利用非线性时间序列分析方法、小波能量熵分析法、峰峰间期等方法对采集的数据进行分析，发现Ca2+浓度降低可导致针刺引发的神经放电频率降低，从而显著影响神经放电序列。
4.2 钙离子与肥大细胞 针刺起效不仅依赖神经调节，体液因素同样发挥重要作用。针刺腧穴后，除了神经的调节机制外，针刺血清中存在某种活性物质，可以明显地使神经细胞内Ca2+浓度降低，为针灸体液因素的存在提供了直接的证据[38]。在针刺过程中，机体穴位处受针刺刺激后，针刺局部可能會产生类似炎性反应，穴位结缔组织牵张释放Ca2+等化学物质，Ca2+浓度升高，激活肥大细胞，促使肥大细胞脱颗粒，释放组胺等炎性递质，并使毛细血管扩张，通透性增加而引起神经、免疫等细胞反应、Ca2+等化学物质循经传送等一系列化学反应[39]。Ca2+与肥大细胞都是针效产生的关键因素。团队裴莹等[40]采用EGTA络合足三里穴区Ca2+后，用光镜观察穴区肥大细胞的形态学变化，研究在针效产生中钙离子与肥大细胞两者相互作用的关系，结果显示机体在胃损伤状态下，针刺能够促进足三里穴位周围的肥大细胞脱颗粒。络合足三里穴区Ca2+后，针刺不能对机体的穴区皮肤、肌肉处的肥大细胞脱颗粒造成影响。且络合穴区Ca2+时使用的EGTA浓度越高，针刺后机体穴区皮肤、肌肉处脱颗粒的肥大细胞数量越少，同时肥大细胞脱颗粒率越低。陆月明等[41]对肥大细胞和Ca2+关系的研究表明，Ca2+参与了致敏肥大细胞的抗原活化过程，肥大细胞活化时胞质内Ca2+浓度明显增高，对胞外Ca2+浓度具有一定的依赖性，Ca2+的内流对肥大细胞脱颗粒过程具有重要意义;作为第二信使，Ca2+不能直接激活PTK，但可干扰PTK的下游信号转导。 5 小结
针型传感器可实现对钙离子浓度的在体检测，钙离子在针刺信号的传导中具有重要作用。钙离子在经穴处分布具有特异性，且病理状态下经穴处钙离子浓度存在特异性变化。针刺可改变经脉线上钙离子浓度，穴位处的钙离子与针刺效应具有密切的关系，钙离子是针刺效应产生的关键因素之一，钙离子与穴位处的神经—内分泌—免疫网络（穴网络）关系密切，经络穴位处钙离子活动的来龙去脉的研究，必将为揭示针灸治病的科学依据提供有力的支撑。
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（2020-03-10收稿 责任编辑：王明）
关键词 钙离子;针刺;针型传感器;经穴钙离子分布特异性;络合;肥大细胞
Abstract Calcium ions play an important role in human daily life. This paper systematically analyzed the early achievements of the research team， combined with related domestic and international research. Based on the relationship between calcium ions and meridian acupoints of biochemistry， the distribution of calcium ions in acupuncture points， the effects of acupuncture on calcium concentration in meridian points and calcium in peripheral meridian points during visceral and sacral disease changes in ion concentration， the effects of complexed calcium ions on acupuncture effects， and the relationship between calcium ions and nerves and mast cells were comprehensively discussed in order to promote the study of the material basis of meridian points and provide a basis for the study of meridian points.
Keywords Calcium ion; Acupuncture; Needle sensor; Specificity of calcium ion distribution in acupoints; Complexation; Mast cells
经络腧穴研究是现代生命科学的前沿课题，也是医学科学研究的重要方面。建国以来，在国家的大力支持下，经络腧穴的研究经过几代人艰辛努力，取得了重要进展。经络腧穴的物质基础研究是经络研究的重要方面。从上世纪80年代开始，本团队以钙离子为切入点，对经络腧穴的物质基础从生物化學角度开展了系列研究，承担了国家“八五”攀登计划——经络的研究课题、国家“八五”攻关计划、国家自然科学基金、教育部霍英东青年教师科学基金等课题，获得了天津市科技进步奖三等奖、中华中医药学会科技进步奖三等奖等，现结合有关国内外的研究进展介绍如下。
1 钙离子和钙离子选择性针型化学传感器
钙离子是生物体内非常重要的无机离子，是机体功能活动的综合调节剂，可分为细胞内Ca2+和细胞外Ca2+[1]。正常情况下细胞内外液Ca2+浓度保持动态平衡。当这种平衡被打破以后，将会出现细胞的损伤和疾病。Ca2+作为细胞中的第二信使，参与并调控着细胞增殖、代谢等多种生理和生化过程[2]，以及细胞内与细胞间的信号转导。此外，在凝血、腺体细胞分泌、骨骼肌兴奋、神经传导、卵子和精子受精、免疫细胞吞噬中也起着重要作用。常见疾病如高血压、冠心病、肝损伤及脑损伤等均与钙离子密切相关。当细胞内Ca2+浓度过高时，会引起钙稳态失调[3]和兴奋性氨基酸失控性的过量释放[4]，进而引起神经毒性作用，对中枢神经系统造成损伤，故钙通道阻断剂的使用可以产生神经保护作用。心肌肥厚、心律失常和心力衰竭等多种心血管系统疾病的病理过程中均会发生T管重构，该过程通过对Ca2+的调节，影响心肌细胞兴奋-收缩耦联、多种离子通道以及胞内信号转导过程[5]。研究发现，针刺能够调节钙离子浓度，Ca2+是针刺信号放大的关键因素之一，是针刺网络调节效应的重要节点。现代研究表明，阿片类物质的镇痛作用与Ca2+密切相关，Ca2+也参与了针刺效应的众多过程。因此，Ca2+可能在针刺网络信号的调控过程中起到了极其重要和广泛的作用[6]。
美国科学家D·A尤克曾说过：“人体的大部分功能都是依据化学原理进行的”。工欲善其事，必先利其器。要研究化学物质与经络腧穴的关系，化学物质的检测就成为重要的问题。我们与南开大学合作，研制成功了多种化学传感器——钙离子、钾离子、钠离子、氢离子、氧分压等针型化学传感器，建成了国家中医药管理局科研三级实验室——医用化学传感器实验室。所谓针型传感器即传感针，是基于针灸针或不锈钢针头，应用多种现代技术加工而成针灸针形状，能够在体监测传感机体内温度、pH值、氧分压、Ca2+等浓度的一种特殊传感器。传感针可在体、定位、微创、即时、连续动态地测量人体内某种物质浓度的变化[7]。
据Ca2+选择性电极的基本原理，将Ca2+选择性玻璃或塑料管电极，穿入空心针灸针或注射针头内组成针型传感器。以Ca2+敏感膜修饰后的针型传感器作为工作电极，饱和甘汞电极或针灸针和注射针头为参比电极，含有Ca2+的溶液为待测液，三者组成一个双电极闭合回路。检测时，针尖上的敏感膜选择性吸附待测液中的Ca2+，使传感器膜电势发生改变，膜电势与敏感Ca2+活度符合能斯特关系式，因此可以根据膜电势变化计算Ca2+浓度。本团队研制了Ca2+单管玻璃针型传感器、双管玻璃针型传感器和单管塑料电极传感器，用于不同浓度Ca2+的检测后，发现这3种电极对Ca2+的检测性能大致相同，其中玻璃电极的响应速度快、蘸膜后对膜溶液影响不大，但制作复杂、刺入皮肤容易折断，不适用于人体试验;塑料电极响应速度慢、蘸膜后对膜溶液影响较大，但制作简单、不易折断，可用于人体实验。将塑料电极传感器用于家兔肌肉中Ca2+浓度变化的检测中，发现该传感器能够灵敏反应Ca2+浓度的变化。所研制的塑料电极传感器虽然有望用于人体检测，但膜活性材料的污染问题仍需要进一步解决。有关传感器性能已经经过天津市科委组织的专家成果鉴定。 2 经穴钙离子分布及针刺对经穴钙离子分布的影响
2.1 经穴钙离子分布
2.1.1 生理状态下经穴钙离子浓度分布 生理状态下，经络及腧穴处Ca2+浓度显著高于非经非穴处，经穴Ca2+分布具有特异性。我们采用以上研制的针型Ca2+化学传感器，检测比较了家兔8个腧穴及与其对应非穴点处Ca2+浓度的差异以及“足阳明胃经”“任脉”上的在经非穴点及与其对应的非经非穴处Ca2+浓度的差异，首次发现穴位处的Ca2+浓度比非穴位处浓度高，差异有统计学意义[8]，某些经脉上某些点的Ca2+浓度也高于非经非穴处。在人体实验中，用自制塑料管针型钙离子传感器，检测了人体穴位Ca2+浓度分布，发现人体部分经穴处的Ca2+浓度高于旁开对照的非经穴处，即人体经穴处存在Ca2+浓度的富集[9]，研究结果与动物实验一致。复旦大学丁光宏、费伦[10]观察组利用PIES技术，对人体尸体部分穴位处的钙元素含量进行了测量，结果也显示经穴处的钙元素含量高于旁开的非经穴处。此后团队以家兔为实验对象，以推挽灌流技术采集足三里穴针尖“地部”组织液，发现足三里穴的钙元素浓度高于旁开对照点，认为足三里穴处的钙元素可能存在富集[11]。团队也利用微透析技术提取家兔中脘穴与旁开点非穴位处的组织液，结果发现家兔中脘穴处的钙离子、钾离子浓度明显高于非经非穴处，进一步证明了Ca2+在经穴处富集的分布特点[12]。华中科技大学[13-14]以自制的钙离子针型传感器为工作电极，对山羊大肠俞、肝俞和关元俞3个穴位和非穴位区Ca2+浓度进行比较，发现这3个穴位Ca2+浓度都明显高于非穴位区，且传统的针灸穴位具有高氧分压和高Ca2+浓度特性，实验结果也证明了钙离子在穴位分布的特异性。香港大学应用磁共振成像的手段观察到了垂直于经络传导的震荡横波和Ca2+富集现象。也有学者对大鼠穴位注射钙离子络合剂后电针反复刺激穴位，以鉬钯影像摄片，观察到穴位局部有Ca2+聚集的高密度影[15]。
2.1.2 病理状态下经穴钙离子浓度变化 穴位是疾病信息的反应点。当脏腑发生病变时，往往在相应的经穴上出现一些变化，主要包括组织形态学变化（如出现条索状物、结节等）;感觉异常变化（如压痛等）;生物物理学变化（如电阻的变化等）。研究表明，病理状态下腧穴处Ca2+浓度会发生特异性变化。团队用钙离子针型传感器检测到，在家免发生急性心律失常过程中，心包经上（曲泽、内关上2 cm）Ca2+浓度下降，而非心包经（曲池、足三里上2 cm）Ca2+浓度的变化不明显，即当脏腑发生病变时，相应的经穴处存在钙离子浓度的特异性变化，且穴位处Ca2+浓度变化与心律失常的向愈相关。研究提示外周经脉上Ca2+是经穴与脏腑相关的重要环节，在经脉信息传导中具有重要的作用[16]。昆明医学院赵钦[17]等对急性胸膜炎家兔左右耳相关穴位处钙离子等化学元素检测显示，当脏腑发生病变时，相应耳穴处的钙元素浓度也高于旁开非经穴处，说明在病理状态下Ca2+等化学元素会在与脏腑关系密切的耳穴区域富集。顾星[18]也发现，急性胃黏膜损伤家兔足三里穴灌流液中Ca2+浓度升高。我们团队研究发现[19]，肥大细胞密度在腧穴区明显高于非穴区，经脉线上的肥大细胞也相对丰富，且经穴区肥大细胞代谢更为旺盛。而络合穴区Ca2+后，针刺效应丧失或减弱的同时，穴区皮肤、肌肉处肥大细胞脱颗粒现象也相应减弱，肥大细胞脱颗粒与Ca2+浓度升高密切相关，疾病状态下，肥大细胞及Ca2+在腧穴区均存在特异性聚集现象。以上实验均表明，病理状态下经穴Ca2+会出现与疾病相关的特异性改变。
2.2 针刺对经穴钙离子分布的影响 针刺能够使经穴钙离子重新分布。团队研究表明[20]，针刺本经穴点可使本经其他穴位处Ca2+浓度升高，而使旁开对照点Ca2+浓度有下降趋势，即针刺可引起经脉线内外Ca2+的重新分布，提示Ca2+可能参与了针刺“得气”过程。实验结果还显示，针刺经外旁开点对本经穴位的Ca2+浓度影响不大，说明经脉线在传导针刺信息方面具有特异性，同时这一结果也证明了针灸学“宁失其穴，勿失其经”理论的正确性[21]。胡利民等[22]观察了针刺内关对乌头碱性心律失常家兔心包经上Ca2+浓度动态变化的影响，发现针刺内关后因心律失常导致的Ca2+浓度下降幅度降低，30 min后可恢复至原有水平，而相应对照点（曲池、足三里等）处无明显变化，说明针刺治疗可调整Ca2+浓度的变化。Rui Gao等[23]应用微透析技术检测2 Hz电针刺激大鼠足三里穴后穴位局部Ca2+的变化，发现电针可以显著增加穴位处Ca2+的浓度，针刺过程中Ca2+水平逐渐升高，60 min达到峰值，并于120 min后降低，与团队实验结果一致。香港大学Geng Li等[24]针刺小鼠足三里穴后，通过双光子共聚焦显微镜监测Ca2+水平。发现后肢肌肉纤维中荧光强度显著增加，且该荧光信号随后传播至邻近的肌肉纤维，表明针刺刺激可引起穴位局部Ca2+反應，进一步导致胞质Ca2+活化产生针刺效应。台湾国立中央大学Yang ES等[25]也认为针刺能够导致Ca2+通道的机械波激活而发挥针效，这些研究印证了针刺对经穴Ca2+产生影响，且Ca2+可能是针刺信号传导的重要环节。
此外，人体实验也证明了针刺能够改变经穴处钙离子的浓度，团队曾以健康成年男性为受试对象，开展针刺对经穴Ca2+浓度影响的研究，发现针刺上巨虚后，同经腧穴足三里、解溪穴处的Ca2+浓度升高，而对足三里旁开点的Ca2+浓度影响不大;针刺上巨虚旁开点对足三里及其旁开点的Ca2+浓度无显著影响;针刺足三里旁开点对解溪穴处的Ca2+浓度亦无显著影响，但可使解溪旁开点的Ca2+浓度升高。以上试验结果与动物实验的结论相符，表明在针刺状态下，经脉线的离子浓度存在特异性变化。结合穴位处钙离子浓度分布的特点及其针灸理论与临床实践，参考几十年来经络与针灸作用原理的研究成果，我们认为钙离子与循经信息的传导具有非常密切的关系。 3 调控穴位处钙离子对针刺效应的影响
穴位处钙离子浓度改变在针刺信号的传导中可能起到重要的作用，为了证明这一点，团队通过改变穴位钙离子浓度、阻断钙离子通道及钙离子的配体进行研究和论证。
3.1 络合钙离子 前期研究发现，针刺能够缩短心律失常的时间，但向“内关”处注射EDTA后（钙离子的特异性络合剂）再针刺“内关”穴，大鼠心率失常的时间未能缩短，说明络合“内关”穴后，针效降低[26]。除内关穴外，络合足三里穴处钙离子能使其促进小鼠胃排空率的效应降低[27]，也能阻断针刺抑制胃运动频率的效应[28]。如裴莹等[29]应用雄性昆明小鼠造成胃损伤模型，络合足三里穴处Ca2+后再行针刺，发现针效显著降低，同时能够抑制机体自身的恢复功能，且存在EGTA（钙离子络合剂）浓度越高，针效受影响越大的趋势，提示钙离子与针刺效应之间存在一定的量效关系。大量实验结果也证明了该现象的普适性，提示Ca2+可能是针刺效应产生的关键因素，是经络功能活动的重要物质基础之一。反之，若升高穴位钙离子浓度，是否可影响针刺效应？团队前期实验结果表明，穴位注射不同浓度的CaCl2溶液后，针刺效应继续存在，也未见提高，提示升高针刺部位的Ca2+浓度对针刺效应影响不大，这也可能存在其他原因，有待今后进一步研究。
3.2 阻断钙离子通道 Ca2+进入细胞内的途径主要有钙泵、Na+-Ca2+交换和Ca2+-H+交换。生理情况下，Ca2+进入细胞内可激活众多生理活动。病理状态下，各种原因引起的细胞内钙含量异常增多，可导致细胞结构损伤和功能代谢障碍的现象称为钙超载。质膜钙通道是引起钙超载的关键因素，主要有两大类型：电压依赖性钙通道和受体操纵性钙通道，针刺的循经特异性效应在心脏Ca2+通道的响应模式是改善Ca2+通道蛋白表达的异常升高，抑制钙超载[30]。Syarif Sudirman等[31]采用维拉帕米作为特异性L钙离子通道阻滞剂，omega conotoxin GVIA作为特异性N钙离子通道阻滞剂，以家鼠为研究对象，探索阻断Ca2+通道对针麻效果的影响，结果表明针刺加维拉帕米和omega conotoxin GVIA均可降低但未完全消除针麻作用。我们团队用Mn2+阻断内关穴细胞膜上电压门控性Ca2+通道后，针刺内关的效应消失，用硝苯吡啶阻断Ca2+通道后，针刺内关的效应部分消失[32]。此后在实验性家兔心律失常模型上阻断心包经曲泽穴细胞膜上电压门控性钙离子通道，观察该处钙离子通道阻断后对针刺内关治疗家兔心律失常效应的影响，发现阻断曲泽穴处细胞膜上钙离子通道后，针刺内关效应消失，而阻断尺泽穴处细胞膜上钙离子通道后再针刺内关，针刺效应无明显改变[33]。提示针效的发挥、经络活动与针刺部位所在经络线细胞膜上电压门控性Ca2+通道（VOCs）相关，也说明Ca2+参与经络活动主要是通过Ca2+从胞外进入胞内而实现的。
3.3 阻断钙离子配体 钙调蛋白（CaM）是一种钙离子结合蛋白，能与钙通道结合并有很强的调节功能，很多文献将其归于钙通道亚基的一种。CaM作为细胞内Ca2+配体可与Ca2+可逆性结合。研究发现，心肌缺血时心肌细胞钙离子通道蛋白Cavα1C、Cavβ、Cavα2-δ1、CaM及CaMKII表达升高，电针内关穴可明显降低上述蛋白表达的升高，说明针刺内关穴治疗心肌缺血在心肌细胞钙离子通道的响应模式是抑制钙通道及相关蛋白表达，从而抑制因钙超载引起的心肌损伤。Ca2+可通过与CaM结合，激活钙激酶（如CaMKII）而发挥作用[28]。
三氟拉嗪（TFP）为经典CaM拮抗剂，可在Ca2+存在下与CaM高亲和部位结合，使CaM失活，从而有效阻断Ca-CaM复合物对靶酶的激活。利用此原理，我们团队[34]在大鼠胃运动减低模型中使用经典钙调素拮抗剂三氟拉嗪溶液注射于双侧足三里穴区，在局部穴区钙调素失活状态下，观察针刺足三里对胃运动低下的影响。研究结果显示，局部穴区CaM失活状态下，在行针5 min期间针效丧失，留针期间针效有部分丧失，但随时间延长针效逐渐恢复，说明CaM在针刺行针过程中参与了经络活动。其中针效随时间延长可恢复的原因仍有待进一步研究阐明。
4 经穴钙离子与神经、肥大细胞等的关系研究
大量前期研究表明，穴位局部钙离子在针刺效应的产生中具有相当重要的作用，那么钙离子是通过哪些环节来发挥这些作用的？研究表明钙离子和神经、肥大细胞关系密切，据此我们开展了有关钙离子和神经、肥大细胞的关系研究。
4.1 钙离子与神经 Ca2+是针效产生机制的重要环节之一，其在针刺神经电信号传导过程中起着重要作用[35]。研究表明Ca2+与神经细胞之间关系密切，Ca2+可以引起神经冲动，能有效调控突触前和突触后的调节机制，具有可控制突触后离子通道功能和逆行抑制神经递质释放机制的双重调节作用。此外，神经细胞的凋亡与Ca2+浓度也有关[36]。团队陈静子等[37]在探讨Ca2+对针刺电信号影响的特征和规律研究中，选用健康成年雄性SD大鼠作为研究对象，络合足三里穴区Ca2+后观察神经细束的放电情况，并利用非线性时间序列分析方法、小波能量熵分析法、峰峰间期等方法对采集的数据进行分析，发现Ca2+浓度降低可导致针刺引发的神经放电频率降低，从而显著影响神经放电序列。
4.2 钙离子与肥大细胞 针刺起效不仅依赖神经调节，体液因素同样发挥重要作用。针刺腧穴后，除了神经的调节机制外，针刺血清中存在某种活性物质，可以明显地使神经细胞内Ca2+浓度降低，为针灸体液因素的存在提供了直接的证据[38]。在针刺过程中，机体穴位处受针刺刺激后，针刺局部可能會产生类似炎性反应，穴位结缔组织牵张释放Ca2+等化学物质，Ca2+浓度升高，激活肥大细胞，促使肥大细胞脱颗粒，释放组胺等炎性递质，并使毛细血管扩张，通透性增加而引起神经、免疫等细胞反应、Ca2+等化学物质循经传送等一系列化学反应[39]。Ca2+与肥大细胞都是针效产生的关键因素。团队裴莹等[40]采用EGTA络合足三里穴区Ca2+后，用光镜观察穴区肥大细胞的形态学变化，研究在针效产生中钙离子与肥大细胞两者相互作用的关系，结果显示机体在胃损伤状态下，针刺能够促进足三里穴位周围的肥大细胞脱颗粒。络合足三里穴区Ca2+后，针刺不能对机体的穴区皮肤、肌肉处的肥大细胞脱颗粒造成影响。且络合穴区Ca2+时使用的EGTA浓度越高，针刺后机体穴区皮肤、肌肉处脱颗粒的肥大细胞数量越少，同时肥大细胞脱颗粒率越低。陆月明等[41]对肥大细胞和Ca2+关系的研究表明，Ca2+参与了致敏肥大细胞的抗原活化过程，肥大细胞活化时胞质内Ca2+浓度明显增高，对胞外Ca2+浓度具有一定的依赖性，Ca2+的内流对肥大细胞脱颗粒过程具有重要意义;作为第二信使，Ca2+不能直接激活PTK，但可干扰PTK的下游信号转导。 5 小结
针型传感器可实现对钙离子浓度的在体检测，钙离子在针刺信号的传导中具有重要作用。钙离子在经穴处分布具有特异性，且病理状态下经穴处钙离子浓度存在特异性变化。针刺可改变经脉线上钙离子浓度，穴位处的钙离子与针刺效应具有密切的关系，钙离子是针刺效应产生的关键因素之一，钙离子与穴位处的神经—内分泌—免疫网络（穴网络）关系密切，经络穴位处钙离子活动的来龙去脉的研究，必将为揭示针灸治病的科学依据提供有力的支撑。
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