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doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2010.23.010
近年来,蛋白质组学的发展为系统性、整体性的分析线粒体蛋白质组提供了可能性,现将蛋白质组学技术在神经系统中的研究做一综述。
线粒体蛋白质的分离鉴定
传统的基于凝胶电泳的蛋白质鉴定技术:如双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(2-DE)结合质谱技术。
近几年来,2DE技术有了很大发展。差异凝胶电泳(DIGE)是2DE的发展,DIGE技术最早在1997年由Jon Minden实验室提出,其技术路线是将样品在电泳前标记Cy2、Cy3和Cy5这3种荧光染料(其中Cy2作为用Cy3、Cy5标记的蛋白质内标,用以比较数据库中各个胶之间的蛋白质的量的差异),然后将标记后的3种样品混合,同时在一块胶上进行电泳。该方法的灵敏度高,可以检测到100～200pg的蛋白质,线形动态范围在5个数量级左右。此外,还有有固相pH梯度(IPC)凝胶电泳、双向高效柱层析技术以及毛细血管电泳法,2DE仍在不断完善中[1]。在这项技术中,天然状态的膜蛋白(完整的复合体)首先要成为可溶的,然后在第一相的电泳中被溶解。在第二相中利用变性凝胶分离这些复合体,将它们分解成亚单位。这项技术也使得检测线粒体呼吸链中的复合体变得容易。
基于非胶体系的多维层析分离与生物质谱相结合的技术路线(Mud PIT)。多维毛细管LC-ESI-MS/MS蛋白质认定技术(MudPIT)和从混合物中分离蛋白质的鸟枪法很有前途。鸟枪法是将纯化的线粒体直接用一种或多种蛋白酶水解成肽段后,分别用离子交换和不同种类的反相色谱分离肽段后,以离线或在线方式与ESI-MS(Q-TOF)或离子阱质谱联用,进行蛋白质鉴定,这种方法对于蛋白质的分离较为简单,但对色谱的要求提高。MudPIT和2DE相比,是更强大的把蛋白质从细胞和组织中分离出来的方法,但是它是非定量的。为了定量混合的蛋白质复合物,Gygi等引进了同位素标记亲和(ICATs),这项技术被成功的用来检测膜蛋白。
线粒体蛋白质组学在神经系统疾病中的研究
大脑是一个相当复杂的器官,传统的研究方法已经不能满足研究大脑结构和功能的需求。另一方面,大脑是一个耗能多的器官并且只能利用糖酵解过程中产生的能量。因此,线粒体的功能对于大脑很重要。细胞器蛋白质组表达谱的研究进展促使了脑蛋白质组的研究开始向线粒体、微体、胞浆和细胞质膜蛋白质组等特定的亚细胞组分的分析方向发展,如突触小体、突触膜、突触小泡和突触后富集区都已成为蛋白质组学研究中的目标组分[2]。
Thierry Rabilloud等运用蛋白质组学技术研究了这些突变是否会广泛的影响线粒体蛋白质。他们分析了同胞杂种细胞的正常和有点突变的MELA或MERRF综合征病人的几百个线粒体蛋白,发现了一些上调和下调的蛋白。通过质谱鉴定发现了核编码的细胞色素C氧化酶亚单位中的两个蛋白水平在呈现出显著下降。他们的发现显示了线粒体rRNA突变基因核核编码的的蛋白稳态之间有密切关系。作者认为他们为大规模研究线粒体功能紊乱提供了一个有潜力的模式。Mark A.Lovell[3]用同位素亲和标记(ICAT)和双向液相色谱、串联质谱(2DLC/MS/MS)技术定量研究了小鼠原代皮层神经元培养细胞暴露于25microM淀粉状蛋白肽16小时后线粒体蛋白质的变化。他们鉴定出10蛋白包括Na/K-转运ATP酶,丝切蛋白,二氢嘧啶酶,丙酮酸激酶和电压依从性阴离子通道1(VDAC1)有显著变化(P<0.05)。与能量生成有关的蛋白含量的上调提示淀粉状蛋白?肽作用后诱导的凋亡可以导致与ATP生成有关的蛋白的合成和释放以维持代谢功能。Frank Gillardon[4]分析了过度表达人淀粉样前蛋白(K670N,M671L)的Tg2576小鼠的海马线粒体蛋白质组变化。发现热休克蛋白70有显著变化,提示有明显的氧化应激。接着,海马和非海马区的线粒体蛋白被用IEF或Blue-native凝胶电泳技术在第一向分离并在第二向用了SDS-PAGE技术。在呼吸链复合体I和III中发现了大量的亚单位组成成分的变化。通过寡核苷酸序列分析分析没有检测到这些蛋白的相应的mRNA水平的变化。他们得出结论:在Tg2576小鼠大脑中,在淀粉状蛋白斑沉积前,线粒体蛋白质组和功能的变化提示线粒体是淀粉状-凝聚物的一个早期作用靶点。
总之,神经系统的复杂性反映在细胞种类和突触数量上。最新的有关神经系统线粒体蛋白质组学的研究为研究神经系统的不同部分和同一部分在不同理化和致病状态下的情况提供了深入的探索。然而我们面临的一个大问题是从人脑中取样的困难,因此目前大多数研究还是建立在动物模型基础上。
未来瞻望
运用蛋白质组的研究手段比较神经系统不同部位或同一部位在正常状态和病理状态下的蛋白质图谱的差异,寻找疾病特异性蛋白质作为神经系统疾病诊断的分子标记,为诊断提供线索,具有重要的临床价值。但蛋白质组学研究本身还存在许多缺点和不足,仍然有许多关键性的技术需要解决,无论从样品的制备、分离到鉴定都需要发展和改进。另外,有关线粒体蛋白质的数据库还很不完善,新鉴定蛋白的定位问题是研究线粒体蛋白质组学的一个重要方面,相信随着现代生物技术和信息技术的飞速发展,蛋白质组学将为CNS 疾病的研究发挥更大的作用。
参考文献
1 S.D.Patterson,Proteomics:evolution of the technology.Biotechniques,2003,35:440-4.
2 H.Jaffe,L.Vinade,and A.Dosemeci.Identification of novel phosphorylation sites on postsynaptic density proteins.Biochem Biophys Res Commun,2004,321:210-8.
3 M.A.Lovell,S.Xiong,W.R.Markesbery,et al.Quantitative proteomic analysis of mitochondria from primary neuron cultures treated with amyloid beta peptide.Neurochem Res,2005,30:113-22.
4 F.Gillardon,W.Rist,L.Kussmaul,et al.Proteomic and functional alterations in brain mitochondria from Tg2576 mice occur before amyloid plaque deposition.Proteomics,2007,7:605-16.
近年来,蛋白质组学的发展为系统性、整体性的分析线粒体蛋白质组提供了可能性,现将蛋白质组学技术在神经系统中的研究做一综述。
线粒体蛋白质的分离鉴定
传统的基于凝胶电泳的蛋白质鉴定技术:如双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(2-DE)结合质谱技术。
近几年来,2DE技术有了很大发展。差异凝胶电泳(DIGE)是2DE的发展,DIGE技术最早在1997年由Jon Minden实验室提出,其技术路线是将样品在电泳前标记Cy2、Cy3和Cy5这3种荧光染料(其中Cy2作为用Cy3、Cy5标记的蛋白质内标,用以比较数据库中各个胶之间的蛋白质的量的差异),然后将标记后的3种样品混合,同时在一块胶上进行电泳。该方法的灵敏度高,可以检测到100～200pg的蛋白质,线形动态范围在5个数量级左右。此外,还有有固相pH梯度(IPC)凝胶电泳、双向高效柱层析技术以及毛细血管电泳法,2DE仍在不断完善中[1]。在这项技术中,天然状态的膜蛋白(完整的复合体)首先要成为可溶的,然后在第一相的电泳中被溶解。在第二相中利用变性凝胶分离这些复合体,将它们分解成亚单位。这项技术也使得检测线粒体呼吸链中的复合体变得容易。
基于非胶体系的多维层析分离与生物质谱相结合的技术路线(Mud PIT)。多维毛细管LC-ESI-MS/MS蛋白质认定技术(MudPIT)和从混合物中分离蛋白质的鸟枪法很有前途。鸟枪法是将纯化的线粒体直接用一种或多种蛋白酶水解成肽段后,分别用离子交换和不同种类的反相色谱分离肽段后,以离线或在线方式与ESI-MS(Q-TOF)或离子阱质谱联用,进行蛋白质鉴定,这种方法对于蛋白质的分离较为简单,但对色谱的要求提高。MudPIT和2DE相比,是更强大的把蛋白质从细胞和组织中分离出来的方法,但是它是非定量的。为了定量混合的蛋白质复合物,Gygi等引进了同位素标记亲和(ICATs),这项技术被成功的用来检测膜蛋白。
线粒体蛋白质组学在神经系统疾病中的研究
大脑是一个相当复杂的器官,传统的研究方法已经不能满足研究大脑结构和功能的需求。另一方面,大脑是一个耗能多的器官并且只能利用糖酵解过程中产生的能量。因此,线粒体的功能对于大脑很重要。细胞器蛋白质组表达谱的研究进展促使了脑蛋白质组的研究开始向线粒体、微体、胞浆和细胞质膜蛋白质组等特定的亚细胞组分的分析方向发展,如突触小体、突触膜、突触小泡和突触后富集区都已成为蛋白质组学研究中的目标组分[2]。
Thierry Rabilloud等运用蛋白质组学技术研究了这些突变是否会广泛的影响线粒体蛋白质。他们分析了同胞杂种细胞的正常和有点突变的MELA或MERRF综合征病人的几百个线粒体蛋白,发现了一些上调和下调的蛋白。通过质谱鉴定发现了核编码的细胞色素C氧化酶亚单位中的两个蛋白水平在呈现出显著下降。他们的发现显示了线粒体rRNA突变基因核核编码的的蛋白稳态之间有密切关系。作者认为他们为大规模研究线粒体功能紊乱提供了一个有潜力的模式。Mark A.Lovell[3]用同位素亲和标记(ICAT)和双向液相色谱、串联质谱(2DLC/MS/MS)技术定量研究了小鼠原代皮层神经元培养细胞暴露于25microM淀粉状蛋白肽16小时后线粒体蛋白质的变化。他们鉴定出10蛋白包括Na/K-转运ATP酶,丝切蛋白,二氢嘧啶酶,丙酮酸激酶和电压依从性阴离子通道1(VDAC1)有显著变化(P<0.05)。与能量生成有关的蛋白含量的上调提示淀粉状蛋白?肽作用后诱导的凋亡可以导致与ATP生成有关的蛋白的合成和释放以维持代谢功能。Frank Gillardon[4]分析了过度表达人淀粉样前蛋白(K670N,M671L)的Tg2576小鼠的海马线粒体蛋白质组变化。发现热休克蛋白70有显著变化,提示有明显的氧化应激。接着,海马和非海马区的线粒体蛋白被用IEF或Blue-native凝胶电泳技术在第一向分离并在第二向用了SDS-PAGE技术。在呼吸链复合体I和III中发现了大量的亚单位组成成分的变化。通过寡核苷酸序列分析分析没有检测到这些蛋白的相应的mRNA水平的变化。他们得出结论:在Tg2576小鼠大脑中,在淀粉状蛋白斑沉积前,线粒体蛋白质组和功能的变化提示线粒体是淀粉状-凝聚物的一个早期作用靶点。
总之,神经系统的复杂性反映在细胞种类和突触数量上。最新的有关神经系统线粒体蛋白质组学的研究为研究神经系统的不同部分和同一部分在不同理化和致病状态下的情况提供了深入的探索。然而我们面临的一个大问题是从人脑中取样的困难,因此目前大多数研究还是建立在动物模型基础上。
未来瞻望
运用蛋白质组的研究手段比较神经系统不同部位或同一部位在正常状态和病理状态下的蛋白质图谱的差异,寻找疾病特异性蛋白质作为神经系统疾病诊断的分子标记,为诊断提供线索,具有重要的临床价值。但蛋白质组学研究本身还存在许多缺点和不足,仍然有许多关键性的技术需要解决,无论从样品的制备、分离到鉴定都需要发展和改进。另外,有关线粒体蛋白质的数据库还很不完善,新鉴定蛋白的定位问题是研究线粒体蛋白质组学的一个重要方面,相信随着现代生物技术和信息技术的飞速发展,蛋白质组学将为CNS 疾病的研究发挥更大的作用。
参考文献
1 S.D.Patterson,Proteomics:evolution of the technology.Biotechniques,2003,35:440-4.
2 H.Jaffe,L.Vinade,and A.Dosemeci.Identification of novel phosphorylation sites on postsynaptic density proteins.Biochem Biophys Res Commun,2004,321:210-8.
3 M.A.Lovell,S.Xiong,W.R.Markesbery,et al.Quantitative proteomic analysis of mitochondria from primary neuron cultures treated with amyloid beta peptide.Neurochem Res,2005,30:113-22.
4 F.Gillardon,W.Rist,L.Kussmaul,et al.Proteomic and functional alterations in brain mitochondria from Tg2576 mice occur before amyloid plaque deposition.Proteomics,2007,7:605-16.