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摘 要：近年来，芳香烃类化合物正以惊人的速度被制造出来，不仅带来了严重的环境问题，还威胁到了人类的生存、发展。目前，人类正在探索如何利用微生物技术更快、更彻底的消除环境中有害的芳香烃类化合物。本文简要介绍了传统的降解菌株及其降解机理，并着重探讨了生物强化技术，以及基因工程菌在芳香烃类化合物的降解中所达到的显著成果，对未来芳香烃类化合物的微生物降解事业作出了展望。
关键词：芳香烃类化合物 微生物降解 生物强化 基因工程菌
一、芳香烃类化合物的来源与危害
目前，全球每年大约有百万吨芳香族化合物被制造出来，这些化合物除广泛用于生产塑料聚合物、农药、染料、医药和其它日用品当中外，还广泛应用于冶金、炸药和化工产品的制造中[1]。这些物质在制造与利用的过程中，其中的有害物质不可避免的泄漏到环境中，导致土壤和水体环境质量下降，危害生态系统安全，从而造成严重的环境污染。
众所周知，芳香烃类化合物是可致癌或有潛在致癌性的物质，由于它毒性强且结构较稳定，所以很难通过降解除去。传统的处理方法包括物理法和化学法，如活性炭吸附、溶剂萃取、焚烧、深埋等[2]，这些方法不但效率低、成本高而且容易造成二次污染[3],目前为降低环境中芳香烃的含量，世界上采用的最安全有效的方法即微生物技术。
二、常见的降解菌株及其降解机理
芳香烃类化合物主要包括：苯、硝基苯、烷基苯、卤代苯、苯胺等[4]。主要降解微生物有假单胞菌属、反硝化菌属、产甲烷菌属、节细菌属、芽孢杆菌属、无色杆菌属、棒状杆菌属、黄杆菌属、土壤杆菌属、黄单胞杆菌属、微球菌属、气杆菌属、埃希氏杆菌属等，以及一部分放线菌、真菌、藻类[5]。它们的代谢途径分为好氧代谢和厌氧代谢。
1.芳香烃的好氧降解
芳香烃的好氧降解较厌氧降解更容易实现，所以目前发现和研究的大部分微生物都是好氧微生物。正常条件下培养的好氧微生物可以产出混合功能的双氧化酶或氧化酶，这些酶在分子氧的参与下．使苯环羟基化。从而引发芳环的裂解，所以能有效地降解芳香烃化合物[6]。
Claude-henri等在对微生物降解土壤中石油烃的实验中发现，大部分的芳烃组分发生了降解。微生物降解芳香烃的最初途径是多种多样的，但这些反应均具有一致的中间产物。邻苯二羟基类化合物原儿茶酚和儿茶酚就是大多数微生物代谢芳香化合物的过程中产生的中间产物[7]，同时也是环裂开前共同的先导性中间产物。
2.芳香烃的厌氧降解
厌氧降解是指在缺乏氧气的外界条件下，一些厌氧微生物、兼性厌氧微生物将有机物作为电子供体，将除氧以外的其他物质作为电子受体，微生物在降解有机物的同时获取化学能量。厌氧条件一般可分为4种：严格的产甲烷环境或发酵，以硫酸盐为最终电子受体，以硝酸盐为最终电子受体以及以Fe(Ⅲ)为最终电子受体。
2.1严格的产甲烷条件或发酵
“产甲烷条件”是指适合甲烷产生的环境或发酵条件。在产甲烷条件下，最终电子受体——二氧化碳被还原成甲烷，在外界存在电子受体或发酵的条件下，厌氧微生物可以将醇、酸、醛、酚等含氧芳香烃厌氧降解。简单含氧芳香烃的降解是以还原反应为基础的，还原反应可将芳香环转化为带有含氧取代基的脂环，大部分此类脂环均可以发生水解反应并破裂。
2.2以硝酸盐作为最终电子受体
硝酸盐呼吸菌一般是兼性厌氧菌，在氧气消耗完全时呼吸菌即可利用硝酸盐。不同的微生物种群对于硝酸盐的还原作用不同，可将其还原为氨或分子氨。在脱氨实验过程中，陈余道等发现在3个月的驯化期后，原环境中 14c甲苯的含量为0.25 mg，其中有75％在8天内被全部菌群转化，生成14C二氧化碳；经过7个月的稳定期后，在相同环境下，8天内间一二甲苯中的80％被菌群转化，生成 14C二氧化碳，同时硝酸盐被还原为氨气[8]。
2.3以硫酸盐作为最终电子受体
硫酸盐可以作为硫酸盐还原菌厌氧代谢过程中的的外来电子受体。这种代谢通常是在硝酸盐耗尽时发生，硫酸盐在代谢过程中被还原为硫化氢。以硫酸盐作为最终电子受体的厌氧降解在很多环境中可被发现，硫酸盐还原菌能够降解苯甲酸、羟基苯甲酸和苯己酸等很多芳香烃化和物[8]。
2.4铁(Ⅲ)作为电子受体
此外，铁(Ⅲ)也可作为厌氧微生物降解芳香烃过程中，微生物生存需要的电子受体[9]。经研究，若含水层中含有丰富的铁(Ⅲ)，其中的微生物对于芳香烃类化合物的转化则较易进行。证明了铁(Ⅲ)还原与烃降解之间的相关关系。
三、生物强化技术
虽然目前通过实验研究已发现了很多种可以降解不同种类芳香烃化合物的微生物菌株。但一方面由于外界环境不适合某些菌株的生存，降低了它们的繁殖速度，使有机物难以按预期目标快速降解；另一方面，多数菌株具有较强的专一性，而污染环境中常存在多种芳香烃化合物，单一菌种不能独立清洁含多种有机混合物的废水,因此需要通过生物强化技术来解决这一问题。
1.生物强化技术
生物强化技术(Bioaugmentation)是指通过向传统的生物处理系统中引入具有特定功能的微生物，提高有效微生物的浓度，增强对难降解有机物的降解能力，提高其降解速率，并改善原有生物处理体系对难降解有机物的去除效能。
以姚秀清等运用生物强化技术对炼油废水中含量较高的几种芳香烃及其衍生物(甲苯、对二甲苯、乙苯、邻苯二甲酸二丁酯和苯并噻唑)进行降解的研究为例[10]。他们分别选育出了可专一高效降解上述5种难降解有机物的菌种，并按一定比例制备成复合菌剂，运用生物强化技术将复合菌投入模拟废水反应池中，观测其在反应池中的降解效率，研究生物强化技术的处理效果。
2.复合菌剂的作用
在模拟废水处理反应池中复合菌剂有较明显的生物强化作用。复合茵剂的投加可以增加COD的去除效率，减短反应达到平衡状态的时间，及增强抵抗负荷的程度。此外，不同的菌剂投加量，对系统反应速度加快及应对能力增强的效用也不同，生物强化作用在投加lO％高效菌的时候需要最短的启动时间。 复合菌剂的應用使系统内优势菌群的种类发生了变化，进而提高了系统污水处理的效率。但是对于提高系统中高效菌对环境的适应能力、降解活性、及增强菌群竞争能力等问题，仍然有待进一步研究。
四、降解性质粒的研究及基因工程菌的构建
由于系统中高效菌的生存能力低、降解效率差，且存在菌群竞争。因此，可以通过将降解性基因转入适应性较好、繁殖力强的菌株内，或将可降解不同有机物的多种基因克隆到同一受体菌株内，构建出高效“基因工程菌”[4]，达到彻底降解芳香烃类化合物的目的。
1.降解性质粒的研究
在研究苯及其衍生物的降解性质粒的过程中，人们发现在不同种类的微生物中，存在着一些极为类似的基因，它们控制了降解的关键途径。如在降解苯乙烯的过程中，产生的TOL质粒pWWO与PST质粒是十分相似的。可分解代谢甲苯的好氧质粒TOL质粒在假恶臭单胞菌MT一2菌株中发现[4]。目前，对于TOL质粒的形状、基因结构及调控机理等已研究透彻，成为了发现其他降解性质粒的良好开端。
近年来，我国在研究降解质粒方面取得了一定的成果，主要包括对降解性质粒的观察、检测、质粒提取、及确定酶所在位点等[11]，但关于目的基因调控、基因的定位等方面还有待于进一步研究。另外，很少有报道提到了降解性质粒对于蒽醌类化合物的降解研究。
2.基因工程菌的构建
基因工程菌的基本构建过程为：从染色体或降解性质粒中选取起关键作用的基因片段，将其接种在适当的载体上，一同移入受体菌中，此时受体菌便有了新的降解功能。将所选取的基因片段转入受体菌的主要方法有：接合型质粒转移、整合型质粒转移和重组质粒转化。
2.1接合型质粒转移(injugetive plasmid transfer)
接合型质粒转移指通过供体细胞与受体细胞的紧密接触，使质粒转入受体细胞当中，使基因通过细菌间的有效接触而发生的横向转移的过程[12]。Chatteriee DK 等将恶臭假单胞菌的TOL质粒pWWO接合到某一细菌的驯化菌株中，该细菌能将TNT苯环上的3个硝基氧化脱除，并利用其作为氮源来满足生存需要，获得的菌株既可以氧化消除硝基又可以降解甲苯，将TNT作为生存所需的碳、氮源，从而使其矿化。
2.2整合型质粒转移(integrative plasmid transfer)
将降解目的所需的基因连接到可整合基因的质粒(含F因子)上，之后一同移入受体菌中，使该基因片段永久性留存于受体菌的染色体上，使基因所表现的降解性能可以稳定遗传。
在用于耕作土壤中，Ka等研究发现了新的2,4-D-降解菌株，并从中分离出了可自我遗传的降解性质粒-，4-D。其中质粒pKA2在菌株2811P上。分离出最初驯化的2811C菌株，观测到所有pKA2质粒均已整合到受体菌染色体上，没有破坏2,4-D的性状。
2.3重组质粒的转化(recombinant plasmid transfer)
重组质粒是指向一个质粒中同时转入多个有不同降解能力的基因片段，使受体菌可同时降解多种芳香烃，扩大了菌种的可降解范围、增强了菌种的降解能力。
五、存在的问题及展望
综上所述，在实验研究中，复合菌剂的使用，以及基因工程菌的构建，均可大大提高芳香烃类化合物的降解效率。但是当将复合菌剂应用于现实环境中芳香烃类化合物的降解时，就会出现降解系统中高效菌的降解活性下降、存活能力差及菌群间出现竞争等问题。此外，关于基因工程菌方面，国内单纯研究了各种降解性质粒，国外已构建出一些基因工程菌，但由于其安全性问题，目前尚未投入工业化生产。
因此，如何解决以上问题，使复合菌剂以及基因工程菌能真正用于解决环境问题，快速、彻底的降解对环境造成危害的芳香烃类化合物，仍有待进一步的研究。
参考文献
[1]张晶.任庆.朱焕山.芳香族化合物生物降解研究现状与展望[J]辽宁城乡环境科技.2004,24(1).
[2]陈余道.朱义年.蒋亚萍.汽油污染含水层中芳香烃的自然去除与生物降解特征[J]地球化学.2004,33（5）.
[3]邓琦.常萍.周围.程国军.芳香烃化合物降解菌CP5的降解特性及降解基因[J].华中农业大学学报.2010,29(2):185-188.
[4]杜翠红.周集体.王竞.严滨.宋智勇.朴香花.难降解芳香烃生物降解及基因工程菌研究进展[J].环境科学与技术.2005,28（1）.
[5] 杨永华．华晓梅.陈素玲．等．芳香族化合物生物降解代谢及其分子遗传研究[J]．环境科学进展.1995，3(6)：3l-43.
[6] 金若菲．王竞，张劲松．等．蒽醌染料中间体的降解脱色研究[J]．环境科学研究，1999，12(6)：32-35．
[7]盘志剐．张彤等．污染物生物降解[M]上海：华东理工大学出版社，1997．
[8]陈余道,朱义年，蒋亚萍，朱银红，程亚平,黄宗万.汽油污染含水层中芳香烃的自然去除与生物降解特征[J].地球化学.2004,33（5）.
[9]牟伯中.苏荣国.王修林.倪方天.周嘉玺.微生物对芳香烃的降解作用[J].2000,15(4).
[10]姚秀清.徐军祥.张全.复合菌剂生物强化SBR降解芳香烃及其衍生物的研究[J].化学与生物工程.2007,24(8).
[11]王淑君．赖林翰．联苯降解细菌的分离及其降解质粒某些特性的研究[J]．生物技术．2000，10(3)：4-8.
[12]Chatterjee D K，Chatterjee P．Expression of degradativegenes of Pseudomonas putida in Caulobacter crescentus[J]．J Bacteriol，1987．169(7)：2962—2966.
关键词：芳香烃类化合物 微生物降解 生物强化 基因工程菌
一、芳香烃类化合物的来源与危害
目前，全球每年大约有百万吨芳香族化合物被制造出来，这些化合物除广泛用于生产塑料聚合物、农药、染料、医药和其它日用品当中外，还广泛应用于冶金、炸药和化工产品的制造中[1]。这些物质在制造与利用的过程中，其中的有害物质不可避免的泄漏到环境中，导致土壤和水体环境质量下降，危害生态系统安全，从而造成严重的环境污染。
众所周知，芳香烃类化合物是可致癌或有潛在致癌性的物质，由于它毒性强且结构较稳定，所以很难通过降解除去。传统的处理方法包括物理法和化学法，如活性炭吸附、溶剂萃取、焚烧、深埋等[2]，这些方法不但效率低、成本高而且容易造成二次污染[3],目前为降低环境中芳香烃的含量，世界上采用的最安全有效的方法即微生物技术。
二、常见的降解菌株及其降解机理
芳香烃类化合物主要包括：苯、硝基苯、烷基苯、卤代苯、苯胺等[4]。主要降解微生物有假单胞菌属、反硝化菌属、产甲烷菌属、节细菌属、芽孢杆菌属、无色杆菌属、棒状杆菌属、黄杆菌属、土壤杆菌属、黄单胞杆菌属、微球菌属、气杆菌属、埃希氏杆菌属等，以及一部分放线菌、真菌、藻类[5]。它们的代谢途径分为好氧代谢和厌氧代谢。
1.芳香烃的好氧降解
芳香烃的好氧降解较厌氧降解更容易实现，所以目前发现和研究的大部分微生物都是好氧微生物。正常条件下培养的好氧微生物可以产出混合功能的双氧化酶或氧化酶，这些酶在分子氧的参与下．使苯环羟基化。从而引发芳环的裂解，所以能有效地降解芳香烃化合物[6]。
Claude-henri等在对微生物降解土壤中石油烃的实验中发现，大部分的芳烃组分发生了降解。微生物降解芳香烃的最初途径是多种多样的，但这些反应均具有一致的中间产物。邻苯二羟基类化合物原儿茶酚和儿茶酚就是大多数微生物代谢芳香化合物的过程中产生的中间产物[7]，同时也是环裂开前共同的先导性中间产物。
2.芳香烃的厌氧降解
厌氧降解是指在缺乏氧气的外界条件下，一些厌氧微生物、兼性厌氧微生物将有机物作为电子供体，将除氧以外的其他物质作为电子受体，微生物在降解有机物的同时获取化学能量。厌氧条件一般可分为4种：严格的产甲烷环境或发酵，以硫酸盐为最终电子受体，以硝酸盐为最终电子受体以及以Fe(Ⅲ)为最终电子受体。
2.1严格的产甲烷条件或发酵
“产甲烷条件”是指适合甲烷产生的环境或发酵条件。在产甲烷条件下，最终电子受体——二氧化碳被还原成甲烷，在外界存在电子受体或发酵的条件下，厌氧微生物可以将醇、酸、醛、酚等含氧芳香烃厌氧降解。简单含氧芳香烃的降解是以还原反应为基础的，还原反应可将芳香环转化为带有含氧取代基的脂环，大部分此类脂环均可以发生水解反应并破裂。
2.2以硝酸盐作为最终电子受体
硝酸盐呼吸菌一般是兼性厌氧菌，在氧气消耗完全时呼吸菌即可利用硝酸盐。不同的微生物种群对于硝酸盐的还原作用不同，可将其还原为氨或分子氨。在脱氨实验过程中，陈余道等发现在3个月的驯化期后，原环境中 14c甲苯的含量为0.25 mg，其中有75％在8天内被全部菌群转化，生成14C二氧化碳；经过7个月的稳定期后，在相同环境下，8天内间一二甲苯中的80％被菌群转化，生成 14C二氧化碳，同时硝酸盐被还原为氨气[8]。
2.3以硫酸盐作为最终电子受体
硫酸盐可以作为硫酸盐还原菌厌氧代谢过程中的的外来电子受体。这种代谢通常是在硝酸盐耗尽时发生，硫酸盐在代谢过程中被还原为硫化氢。以硫酸盐作为最终电子受体的厌氧降解在很多环境中可被发现，硫酸盐还原菌能够降解苯甲酸、羟基苯甲酸和苯己酸等很多芳香烃化和物[8]。
2.4铁(Ⅲ)作为电子受体
此外，铁(Ⅲ)也可作为厌氧微生物降解芳香烃过程中，微生物生存需要的电子受体[9]。经研究，若含水层中含有丰富的铁(Ⅲ)，其中的微生物对于芳香烃类化合物的转化则较易进行。证明了铁(Ⅲ)还原与烃降解之间的相关关系。
三、生物强化技术
虽然目前通过实验研究已发现了很多种可以降解不同种类芳香烃化合物的微生物菌株。但一方面由于外界环境不适合某些菌株的生存，降低了它们的繁殖速度，使有机物难以按预期目标快速降解；另一方面，多数菌株具有较强的专一性，而污染环境中常存在多种芳香烃化合物，单一菌种不能独立清洁含多种有机混合物的废水,因此需要通过生物强化技术来解决这一问题。
1.生物强化技术
生物强化技术(Bioaugmentation)是指通过向传统的生物处理系统中引入具有特定功能的微生物，提高有效微生物的浓度，增强对难降解有机物的降解能力，提高其降解速率，并改善原有生物处理体系对难降解有机物的去除效能。
以姚秀清等运用生物强化技术对炼油废水中含量较高的几种芳香烃及其衍生物(甲苯、对二甲苯、乙苯、邻苯二甲酸二丁酯和苯并噻唑)进行降解的研究为例[10]。他们分别选育出了可专一高效降解上述5种难降解有机物的菌种，并按一定比例制备成复合菌剂，运用生物强化技术将复合菌投入模拟废水反应池中，观测其在反应池中的降解效率，研究生物强化技术的处理效果。
2.复合菌剂的作用
在模拟废水处理反应池中复合菌剂有较明显的生物强化作用。复合茵剂的投加可以增加COD的去除效率，减短反应达到平衡状态的时间，及增强抵抗负荷的程度。此外，不同的菌剂投加量，对系统反应速度加快及应对能力增强的效用也不同，生物强化作用在投加lO％高效菌的时候需要最短的启动时间。 复合菌剂的應用使系统内优势菌群的种类发生了变化，进而提高了系统污水处理的效率。但是对于提高系统中高效菌对环境的适应能力、降解活性、及增强菌群竞争能力等问题，仍然有待进一步研究。
四、降解性质粒的研究及基因工程菌的构建
由于系统中高效菌的生存能力低、降解效率差，且存在菌群竞争。因此，可以通过将降解性基因转入适应性较好、繁殖力强的菌株内，或将可降解不同有机物的多种基因克隆到同一受体菌株内，构建出高效“基因工程菌”[4]，达到彻底降解芳香烃类化合物的目的。
1.降解性质粒的研究
在研究苯及其衍生物的降解性质粒的过程中，人们发现在不同种类的微生物中，存在着一些极为类似的基因，它们控制了降解的关键途径。如在降解苯乙烯的过程中，产生的TOL质粒pWWO与PST质粒是十分相似的。可分解代谢甲苯的好氧质粒TOL质粒在假恶臭单胞菌MT一2菌株中发现[4]。目前，对于TOL质粒的形状、基因结构及调控机理等已研究透彻，成为了发现其他降解性质粒的良好开端。
近年来，我国在研究降解质粒方面取得了一定的成果，主要包括对降解性质粒的观察、检测、质粒提取、及确定酶所在位点等[11]，但关于目的基因调控、基因的定位等方面还有待于进一步研究。另外，很少有报道提到了降解性质粒对于蒽醌类化合物的降解研究。
2.基因工程菌的构建
基因工程菌的基本构建过程为：从染色体或降解性质粒中选取起关键作用的基因片段，将其接种在适当的载体上，一同移入受体菌中，此时受体菌便有了新的降解功能。将所选取的基因片段转入受体菌的主要方法有：接合型质粒转移、整合型质粒转移和重组质粒转化。
2.1接合型质粒转移(injugetive plasmid transfer)
接合型质粒转移指通过供体细胞与受体细胞的紧密接触，使质粒转入受体细胞当中，使基因通过细菌间的有效接触而发生的横向转移的过程[12]。Chatteriee DK 等将恶臭假单胞菌的TOL质粒pWWO接合到某一细菌的驯化菌株中，该细菌能将TNT苯环上的3个硝基氧化脱除，并利用其作为氮源来满足生存需要，获得的菌株既可以氧化消除硝基又可以降解甲苯，将TNT作为生存所需的碳、氮源，从而使其矿化。
2.2整合型质粒转移(integrative plasmid transfer)
将降解目的所需的基因连接到可整合基因的质粒(含F因子)上，之后一同移入受体菌中，使该基因片段永久性留存于受体菌的染色体上，使基因所表现的降解性能可以稳定遗传。
在用于耕作土壤中，Ka等研究发现了新的2,4-D-降解菌株，并从中分离出了可自我遗传的降解性质粒-，4-D。其中质粒pKA2在菌株2811P上。分离出最初驯化的2811C菌株，观测到所有pKA2质粒均已整合到受体菌染色体上，没有破坏2,4-D的性状。
2.3重组质粒的转化(recombinant plasmid transfer)
重组质粒是指向一个质粒中同时转入多个有不同降解能力的基因片段，使受体菌可同时降解多种芳香烃，扩大了菌种的可降解范围、增强了菌种的降解能力。
五、存在的问题及展望
综上所述，在实验研究中，复合菌剂的使用，以及基因工程菌的构建，均可大大提高芳香烃类化合物的降解效率。但是当将复合菌剂应用于现实环境中芳香烃类化合物的降解时，就会出现降解系统中高效菌的降解活性下降、存活能力差及菌群间出现竞争等问题。此外，关于基因工程菌方面，国内单纯研究了各种降解性质粒，国外已构建出一些基因工程菌，但由于其安全性问题，目前尚未投入工业化生产。
因此，如何解决以上问题，使复合菌剂以及基因工程菌能真正用于解决环境问题，快速、彻底的降解对环境造成危害的芳香烃类化合物，仍有待进一步的研究。
参考文献
[1]张晶.任庆.朱焕山.芳香族化合物生物降解研究现状与展望[J]辽宁城乡环境科技.2004,24(1).
[2]陈余道.朱义年.蒋亚萍.汽油污染含水层中芳香烃的自然去除与生物降解特征[J]地球化学.2004,33（5）.
[3]邓琦.常萍.周围.程国军.芳香烃化合物降解菌CP5的降解特性及降解基因[J].华中农业大学学报.2010,29(2):185-188.
[4]杜翠红.周集体.王竞.严滨.宋智勇.朴香花.难降解芳香烃生物降解及基因工程菌研究进展[J].环境科学与技术.2005,28（1）.
[5] 杨永华．华晓梅.陈素玲．等．芳香族化合物生物降解代谢及其分子遗传研究[J]．环境科学进展.1995，3(6)：3l-43.
[6] 金若菲．王竞，张劲松．等．蒽醌染料中间体的降解脱色研究[J]．环境科学研究，1999，12(6)：32-35．
[7]盘志剐．张彤等．污染物生物降解[M]上海：华东理工大学出版社，1997．
[8]陈余道,朱义年，蒋亚萍，朱银红，程亚平,黄宗万.汽油污染含水层中芳香烃的自然去除与生物降解特征[J].地球化学.2004,33（5）.
[9]牟伯中.苏荣国.王修林.倪方天.周嘉玺.微生物对芳香烃的降解作用[J].2000,15(4).
[10]姚秀清.徐军祥.张全.复合菌剂生物强化SBR降解芳香烃及其衍生物的研究[J].化学与生物工程.2007,24(8).
[11]王淑君．赖林翰．联苯降解细菌的分离及其降解质粒某些特性的研究[J]．生物技术．2000，10(3)：4-8.
[12]Chatterjee D K，Chatterjee P．Expression of degradativegenes of Pseudomonas putida in Caulobacter crescentus[J]．J Bacteriol，1987．169(7)：2962—2966.