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摘要：为筛选与目的基因连锁更加准确的分子标记以及明确分子标记鉴定技术的准确率，同时为后期进行基因精细定位研究提供技术手段，本试验采用F 2∶3 家系进行F2单株的TuMV抗性鉴定。结果表明，122个大白菜抗TuMV材料 8407和感病材料冠 291 的 F 2∶3 家系中，抗病的有98个，感病的有24个，经卡方测验，符合3∶1的分离比例，与以往对该群体F2代TuMV抗性分离比例的研究一致，表明这种鉴定方法可行。本结果可为今后分离群体单株TuMV抗性的准确鉴定提供参考。
关键词：大白菜;F 2∶3 家系; TuMV;单株抗性
中图分类号：S634.1文献标识号：A文章编号：1001-4942（2019）01-0115-04
Identification of Single Plant Resistance to TuMV in Segregated
Population of Chinese Cabbage by F 2∶3Family Method
Man Weiping Zhang Zhigang2* ， Li Chunmin 3， Zhao Zhizhong 2，
Wang Ronghua 2， Liu Shuantao 2， Li Qiaoyun Wang Lihua 2
（1.College of Life Sciences， Shandong Normal University， Jinan 250014， China;
2. Vegetables and Flowers Institute， Shandong Academy of Agricultural Sciences/Shandong Branch of National Center
for Vegetables Improvement/Shandong Key Laboratory for Biology of Greenhouse Vegetables， Jinan 250100， China;
3.Penglai Daliuhang Comprehensive Agricultural Service Station， Penglai 265615， China）
Abstract In order to screen out molecular markers with more accurate linkage distance and make clear of the identification accuracy of molecular markers， as well as for fine gene mapping in the later period， the F 2∶3families were used to identify the TuMV resistance of F2 single plant. The results showed that in 122 Chinese cabbage F 2∶3families with their resistant parent ‘8407’ and susceptible parent ‘Guan 291’， 98 were resistant families and 24 were susceptible families，which was in accordance with the 3∶1 separation ratio byChi- square test. This was consistent with previous studies in segregation ratio of TuMV resistance in F2 generation， which indicated that this method was feasible. This study provided a methodological guide for accurate identification of individual isolate on TuMV resistance in the future.
Keywords Chinese cabbage;F 2∶3Families;TuMV;Single plant resistance
利用分子標记和性状遗传分析对F 2 分离群体单株相关性状进行抗性鉴定并保证鉴定的准确性非常重要。但此类鉴定常常由于环境和操作方法等原因，难以得到准确结果。目前，为获得准确的鉴定结果，科研中较为常用的鉴定方式是构建F 2∶3 家系研究某一F 2 单株的F 2∶3 家系的性状表现。
利用F 2∶3 家系开展性状鉴定的研究已有报道。魏蒙关[1]利用F 2∶3 家系对13个玉米秸秆产量和品质性状进行单个性状的QTL定位和效应分析。余学杰等[2]利用 F 2∶3 群体分析玉米的穗长、秃尖长、穗粗、穗行数、行粒数、粒深、百粒重、出籽率和单株生产力等 9 个性状的变异及其相关性。李清超等[3]利用F 2∶3 群体对玉米株型性状进行研究，采用灰色关联度分析法对影响玉米叶向值的主要株型性状进行分析。周坤华等[4]利用辣椒种间F 2∶3 群体进行主要农艺性状 QTL 分析，株高、主茎高、果长、果径、单果质量、果形和果实辣味等7个性状的9 个加性 QTL 在两个群体中同时被检出。魏良明等[5]利用 F 2∶3 家系对玉米淀粉含量的表现及其与单株产量、百粒重、穗长、穗粗、穗行数等的相关性进行了研究。在抗病性鉴定方面，蒋思霞等[6]利用 F 2∶3 家系进行黄曲霉菌抗性鉴定的研究。钱伟[7]在对大白菜TuMV抗性基因retr02进行定位和克隆研究时，也采用F 2∶3 家系辅助F 2 群体单株的TuMV抗性鉴定。李巧云等[8]在研究大白菜抗TuMV分子标记辅助选择技术时，也引入F 2∶3 家系鉴定，以获得更准确的原 F 2 单株的TuMV抗性及基因型。目前，尚未见关于利用 F 2∶3 家系鉴定大白菜TuMV分离群体单株抗性具体方法的报道。 本研究通过构建大白菜抗TuMV材料 8407和感病材料冠 291 的 F 2∶3 家系，对每个 F 2∶3 家系的TuMV抗性进行鉴定，进而判断原 F 2 代单株的TuMV抗性，推测其基因型，并结合以往关于原F 2 群体的分离比例的研究，进一步验证这种鉴定方法的准确性。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试抗病亲本材料为大白菜TuMV国家级抗源材料8407（P1），感病亲本材料为高感TuMV的核心种质材料冠291（P2），两亲本杂交得F 1 群体，F 1 自交后构建F 2 代分离群体，F 2 代单株自交构建F 2∶3 家系。
供试TuMV的C4株系引自中国农业科学院蔬菜花卉研究所。
1.2 试验方法
对28株抗病亲本8407（P1）、29株感病亲本冠291（P2）、30株F 1 和288株F 2 群体分别采用摩擦接种 [9]和剥叶接种相结合的方法接种TuMV的C4株系，共剥叶接种2次，具体参见文献[10]的方法。接种3周后进行TuMV抗性调查，共调查3次，分别间隔1周。
对F 2 代122个单株自交构建F 2∶3 家系，每个F 2∶3 家系的10株以上单株接种TuMV的C4株系，采用生物学观察方法对F 2∶3 家系的TuMV抗性进行鉴定。
1.3 抗病性鉴定
病情分级、病情指数计算和抗性归类标准参见张晓亮[11]的方法和GB/T 19557.5-2004[12]。具体分级标准如下：
0级：无任何症状;
0.1级：接种叶出现个别褪绿斑;
0.5级：接种叶出现少数褪绿斑;
1级：心叶明脉，轻花叶;
3级：心叶及中部叶片花叶或心叶皱缩成畸形;
5级：心叶及中、外部叶片花叶，少数病叶畸形、皱缩，植株轻度矮化;
7级：重花叶，多数病叶畸形、皱缩，球叶上出现坏死斑及叶脉轻度坏死，植株矮化;
9级：植株表现严重花叶和皱缩，多数叶片畸形，叶脉坏死至整株坏死，无商品价值。
R：0<DS≤1;
MR：1<DS≤3;
MS：3<DS≤5;
S：5<DS≤9。
其中，R表示抗病，MR表示中抗，MS表示中感，S表示感病，DS表示病级，下同。
根据调查结果，计算群体的病情指数：
病情指数=Σ （病级的代表值×该病发病株数）/（调查总株数×最高级代表值）×100 。
高抗（HR）：病情指数0.01～11.11;
抗病（R）：病情指数11.12～33.33;
耐病（T）：病情指数33.34～55.55;
感病（S）：病情指数55.56～77.77;
高感（HS）：病情指数77.78～100。
2 结果与分析
2.1 P1、P2、F 1 及F 2 代群体TuMV抗性分析
由表1可知，抗病亲本（P1）各单株病级均在1级以下，其中以0级最多，病情指数为1.43，属于高抗;感病亲本（P2）各单株病级均在5级以上，其中以7级最多，病情指数为77.78，屬于高感;F 1 群体各单株病级均在3级以下，其中以1级最多，病情指数为11.22，属于抗病;F 2 群体出现抗、感分离，符合3∶1的分离比例（χ 2 c =1.50<χ 2 0.05 =3.84）。进一步表明本研究中的TuMV抗性受显性单基因控制。
2.2 F 2∶3 家系TuMV抗性分析
由表2可以看出，根据122个F 2∶3 家系的病情指数推测原F 2 单株的TuMV抗性，结果为：高抗（HR）48株，抗病（R）33株，耐病（T）17株，感病（S）21株，高感（HS）3株;抗、感单株比为98∶24，符合3∶1的分离比例（χ 2c=1.85<χ 2 0.05 =3.84）。
根据抗病性鉴定特点，抗病株系中没有出现感病单株，表明其抗性是纯合的（参考病情指数为 0.01～ 2.00），基因型记为AA;抗病株系中出现感病单株，表明其抗性不是纯合的（参考病情指数为 2.01～ 55.55），基因型记为Aa;感病株系在接种时，由于接种手法、环境等因素的影响，不能保证所有单株都发病，因此，病情指数55.56～100的全部归为纯合感病，基因型记为aa。
由表3看出，122个F 2 单株中，基因型为AA的有30株，基因型为Aa的有68株，基因型为aa的有24株。基因型AA∶Aa∶aa的比例为30∶68∶24，符合1∶2∶1的分离比例（χ 2c=2.20<χ 2 0.05 = 5.99）。
3 讨论与结论
在分子标记与基因定位研究中，表型鉴定的准确性直接影响到分子标记的遗传距离计算和基因定位的准确性。因此，研究更加准确的分离群体单株性状鉴定方法尤为重要。 本研究利用抗TuMV材料 8407和感病材料冠 291为亲本，构建122个F 2∶3 家系，通过对这些家系进行TuMV接种和鉴定，判断原F 2 单株的TuMV抗性。结果表明，抗病株系有98个，感病株系有24个，经卡方测验，符合3∶1的分离比例。这一结果与以往对该群体F 2 代TuMV抗性分离比例的研究结果一致[11]，表明这种鉴定方法可用于大白菜TuMV抗性单株鉴定。相对于F 2 代单株接种鉴定方法，此方法根据F 2∶3 家系的病情指数来判断原F 2 单株的抗性，准确性更高。
本课题组在2009年发表过一篇关于ELISA方法鉴定分离群体单株抗性的研究[9]。但该方法仍未能排除接种手法和环境对单株抗性的影响。相比较而言F 2：3 家系的性状表现整体情况更能反映原F 2 单株的真实性状特点。在大白菜分子标记辅助选择方面，钱伟[7]采用了F 2∶3 家系辅助F 2 群体单株的TuMV抗性鉴定，用于大白菜TuMV抗性基因retr02的精细定位研究，获得准确的精细定位结果，并进行了相关基因的克隆。本课题组[8]在研究大白菜抗TuMV分子标记辅助选择技术时，也引入F 2∶3 家系鉴定，获得了较为准确的标记选择准确率。本研究所得利用F 2∶3 家系辅助F 2 群体进行TuMV抗性鉴定的方法可为今后更好地从事相关方面的研究提供参考。
参 考 文 献：
[1]魏蒙关.玉米两个相关F 2∶3 群体秸秆产量和品质性状QTL分析及遗传相关研究[D].郑州：河南农业大学，2009.
[2]余学杰，石海春，柯永培，等. 一个玉米F 2∶3 群體主要性状的变异及相关分析[J]. 玉米科学，2008 ，16（3）： 22-25.
[3]李清超，马浪浪，文琼，等. 基于玉米F 2∶3 群体株型性状的灰色关联度分析[J]. 广东农业科学，2015，42（21）：6-10.
[4]周坤华，雷刚，方荣，等. 利用辣椒种间 F 2和F 2∶3 两个群体进行其主要农艺性状 QTL 分析[J]. 园艺学报，2015，42（5）：879-889.
[5]魏良明，王延召，宋迎辉，等. 玉米F 2∶3 群体淀粉含量的表现及相关性分析[J]. 种业导刊，2016（12）：15-17.
[6]蒋思霞，陈坚剑，徐志英，等. 玉米自交系和F 2∶3 家系对黄曲霉菌抗性的鉴定[J]. 扬州大学学报（农业与生命科学版），2012，33（2）：45-50.
[7]钱伟.大白菜TuMV抗性基因retr02的克隆与抗性机制研究[D].北京：中国农业科学院，2013.
[8]李巧云，张志刚，赵智中，等. 大白菜抗TuMV分子标记辅助选择技术研究[J].山东农业科学，2017，49（2）： 10-14.
[9]李巧云，张志刚，成文华，等.利用ELISA方法鉴定大白菜TuMV抗性[J].科技导报，2009，27（1）：42-45.
[10]高会超，曾强，张志刚，等. 与大白菜TuMV抗病基因TuRBCS01紧密连锁的分子标记开发[J].农业生物技术学报，2016， 24（2）： 196-205.
[11]张晓亮.大白菜抗芜菁花叶病毒（TuMV）基因分子标记筛选与定位[D].青岛：青岛农业大学，2012.
[12]国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会. 植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南 大白菜：GB/T 19557.5—2004 [S].北京：中国标准出版社，2004.
关键词：大白菜;F 2∶3 家系; TuMV;单株抗性
中图分类号：S634.1文献标识号：A文章编号：1001-4942（2019）01-0115-04
Identification of Single Plant Resistance to TuMV in Segregated
Population of Chinese Cabbage by F 2∶3Family Method
Man Weiping Zhang Zhigang2* ， Li Chunmin 3， Zhao Zhizhong 2，
Wang Ronghua 2， Liu Shuantao 2， Li Qiaoyun Wang Lihua 2
（1.College of Life Sciences， Shandong Normal University， Jinan 250014， China;
2. Vegetables and Flowers Institute， Shandong Academy of Agricultural Sciences/Shandong Branch of National Center
for Vegetables Improvement/Shandong Key Laboratory for Biology of Greenhouse Vegetables， Jinan 250100， China;
3.Penglai Daliuhang Comprehensive Agricultural Service Station， Penglai 265615， China）
Abstract In order to screen out molecular markers with more accurate linkage distance and make clear of the identification accuracy of molecular markers， as well as for fine gene mapping in the later period， the F 2∶3families were used to identify the TuMV resistance of F2 single plant. The results showed that in 122 Chinese cabbage F 2∶3families with their resistant parent ‘8407’ and susceptible parent ‘Guan 291’， 98 were resistant families and 24 were susceptible families，which was in accordance with the 3∶1 separation ratio byChi- square test. This was consistent with previous studies in segregation ratio of TuMV resistance in F2 generation， which indicated that this method was feasible. This study provided a methodological guide for accurate identification of individual isolate on TuMV resistance in the future.
Keywords Chinese cabbage;F 2∶3Families;TuMV;Single plant resistance
利用分子標记和性状遗传分析对F 2 分离群体单株相关性状进行抗性鉴定并保证鉴定的准确性非常重要。但此类鉴定常常由于环境和操作方法等原因，难以得到准确结果。目前，为获得准确的鉴定结果，科研中较为常用的鉴定方式是构建F 2∶3 家系研究某一F 2 单株的F 2∶3 家系的性状表现。
利用F 2∶3 家系开展性状鉴定的研究已有报道。魏蒙关[1]利用F 2∶3 家系对13个玉米秸秆产量和品质性状进行单个性状的QTL定位和效应分析。余学杰等[2]利用 F 2∶3 群体分析玉米的穗长、秃尖长、穗粗、穗行数、行粒数、粒深、百粒重、出籽率和单株生产力等 9 个性状的变异及其相关性。李清超等[3]利用F 2∶3 群体对玉米株型性状进行研究，采用灰色关联度分析法对影响玉米叶向值的主要株型性状进行分析。周坤华等[4]利用辣椒种间F 2∶3 群体进行主要农艺性状 QTL 分析，株高、主茎高、果长、果径、单果质量、果形和果实辣味等7个性状的9 个加性 QTL 在两个群体中同时被检出。魏良明等[5]利用 F 2∶3 家系对玉米淀粉含量的表现及其与单株产量、百粒重、穗长、穗粗、穗行数等的相关性进行了研究。在抗病性鉴定方面，蒋思霞等[6]利用 F 2∶3 家系进行黄曲霉菌抗性鉴定的研究。钱伟[7]在对大白菜TuMV抗性基因retr02进行定位和克隆研究时，也采用F 2∶3 家系辅助F 2 群体单株的TuMV抗性鉴定。李巧云等[8]在研究大白菜抗TuMV分子标记辅助选择技术时，也引入F 2∶3 家系鉴定，以获得更准确的原 F 2 单株的TuMV抗性及基因型。目前，尚未见关于利用 F 2∶3 家系鉴定大白菜TuMV分离群体单株抗性具体方法的报道。 本研究通过构建大白菜抗TuMV材料 8407和感病材料冠 291 的 F 2∶3 家系，对每个 F 2∶3 家系的TuMV抗性进行鉴定，进而判断原 F 2 代单株的TuMV抗性，推测其基因型，并结合以往关于原F 2 群体的分离比例的研究，进一步验证这种鉴定方法的准确性。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试抗病亲本材料为大白菜TuMV国家级抗源材料8407（P1），感病亲本材料为高感TuMV的核心种质材料冠291（P2），两亲本杂交得F 1 群体，F 1 自交后构建F 2 代分离群体，F 2 代单株自交构建F 2∶3 家系。
供试TuMV的C4株系引自中国农业科学院蔬菜花卉研究所。
1.2 试验方法
对28株抗病亲本8407（P1）、29株感病亲本冠291（P2）、30株F 1 和288株F 2 群体分别采用摩擦接种 [9]和剥叶接种相结合的方法接种TuMV的C4株系，共剥叶接种2次，具体参见文献[10]的方法。接种3周后进行TuMV抗性调查，共调查3次，分别间隔1周。
对F 2 代122个单株自交构建F 2∶3 家系，每个F 2∶3 家系的10株以上单株接种TuMV的C4株系，采用生物学观察方法对F 2∶3 家系的TuMV抗性进行鉴定。
1.3 抗病性鉴定
病情分级、病情指数计算和抗性归类标准参见张晓亮[11]的方法和GB/T 19557.5-2004[12]。具体分级标准如下：
0级：无任何症状;
0.1级：接种叶出现个别褪绿斑;
0.5级：接种叶出现少数褪绿斑;
1级：心叶明脉，轻花叶;
3级：心叶及中部叶片花叶或心叶皱缩成畸形;
5级：心叶及中、外部叶片花叶，少数病叶畸形、皱缩，植株轻度矮化;
7级：重花叶，多数病叶畸形、皱缩，球叶上出现坏死斑及叶脉轻度坏死，植株矮化;
9级：植株表现严重花叶和皱缩，多数叶片畸形，叶脉坏死至整株坏死，无商品价值。
R：0<DS≤1;
MR：1<DS≤3;
MS：3<DS≤5;
S：5<DS≤9。
其中，R表示抗病，MR表示中抗，MS表示中感，S表示感病，DS表示病级，下同。
根据调查结果，计算群体的病情指数：
病情指数=Σ （病级的代表值×该病发病株数）/（调查总株数×最高级代表值）×100 。
高抗（HR）：病情指数0.01～11.11;
抗病（R）：病情指数11.12～33.33;
耐病（T）：病情指数33.34～55.55;
感病（S）：病情指数55.56～77.77;
高感（HS）：病情指数77.78～100。
2 结果与分析
2.1 P1、P2、F 1 及F 2 代群体TuMV抗性分析
由表1可知，抗病亲本（P1）各单株病级均在1级以下，其中以0级最多，病情指数为1.43，属于高抗;感病亲本（P2）各单株病级均在5级以上，其中以7级最多，病情指数为77.78，屬于高感;F 1 群体各单株病级均在3级以下，其中以1级最多，病情指数为11.22，属于抗病;F 2 群体出现抗、感分离，符合3∶1的分离比例（χ 2 c =1.50<χ 2 0.05 =3.84）。进一步表明本研究中的TuMV抗性受显性单基因控制。
2.2 F 2∶3 家系TuMV抗性分析
由表2可以看出，根据122个F 2∶3 家系的病情指数推测原F 2 单株的TuMV抗性，结果为：高抗（HR）48株，抗病（R）33株，耐病（T）17株，感病（S）21株，高感（HS）3株;抗、感单株比为98∶24，符合3∶1的分离比例（χ 2c=1.85<χ 2 0.05 =3.84）。
根据抗病性鉴定特点，抗病株系中没有出现感病单株，表明其抗性是纯合的（参考病情指数为 0.01～ 2.00），基因型记为AA;抗病株系中出现感病单株，表明其抗性不是纯合的（参考病情指数为 2.01～ 55.55），基因型记为Aa;感病株系在接种时，由于接种手法、环境等因素的影响，不能保证所有单株都发病，因此，病情指数55.56～100的全部归为纯合感病，基因型记为aa。
由表3看出，122个F 2 单株中，基因型为AA的有30株，基因型为Aa的有68株，基因型为aa的有24株。基因型AA∶Aa∶aa的比例为30∶68∶24，符合1∶2∶1的分离比例（χ 2c=2.20<χ 2 0.05 = 5.99）。
3 讨论与结论
在分子标记与基因定位研究中，表型鉴定的准确性直接影响到分子标记的遗传距离计算和基因定位的准确性。因此，研究更加准确的分离群体单株性状鉴定方法尤为重要。 本研究利用抗TuMV材料 8407和感病材料冠 291为亲本，构建122个F 2∶3 家系，通过对这些家系进行TuMV接种和鉴定，判断原F 2 单株的TuMV抗性。结果表明，抗病株系有98个，感病株系有24个，经卡方测验，符合3∶1的分离比例。这一结果与以往对该群体F 2 代TuMV抗性分离比例的研究结果一致[11]，表明这种鉴定方法可用于大白菜TuMV抗性单株鉴定。相对于F 2 代单株接种鉴定方法，此方法根据F 2∶3 家系的病情指数来判断原F 2 单株的抗性，准确性更高。
本课题组在2009年发表过一篇关于ELISA方法鉴定分离群体单株抗性的研究[9]。但该方法仍未能排除接种手法和环境对单株抗性的影响。相比较而言F 2：3 家系的性状表现整体情况更能反映原F 2 单株的真实性状特点。在大白菜分子标记辅助选择方面，钱伟[7]采用了F 2∶3 家系辅助F 2 群体单株的TuMV抗性鉴定，用于大白菜TuMV抗性基因retr02的精细定位研究，获得准确的精细定位结果，并进行了相关基因的克隆。本课题组[8]在研究大白菜抗TuMV分子标记辅助选择技术时，也引入F 2∶3 家系鉴定，获得了较为准确的标记选择准确率。本研究所得利用F 2∶3 家系辅助F 2 群体进行TuMV抗性鉴定的方法可为今后更好地从事相关方面的研究提供参考。
参 考 文 献：
[1]魏蒙关.玉米两个相关F 2∶3 群体秸秆产量和品质性状QTL分析及遗传相关研究[D].郑州：河南农业大学，2009.
[2]余学杰，石海春，柯永培，等. 一个玉米F 2∶3 群體主要性状的变异及相关分析[J]. 玉米科学，2008 ，16（3）： 22-25.
[3]李清超，马浪浪，文琼，等. 基于玉米F 2∶3 群体株型性状的灰色关联度分析[J]. 广东农业科学，2015，42（21）：6-10.
[4]周坤华，雷刚，方荣，等. 利用辣椒种间 F 2和F 2∶3 两个群体进行其主要农艺性状 QTL 分析[J]. 园艺学报，2015，42（5）：879-889.
[5]魏良明，王延召，宋迎辉，等. 玉米F 2∶3 群体淀粉含量的表现及相关性分析[J]. 种业导刊，2016（12）：15-17.
[6]蒋思霞，陈坚剑，徐志英，等. 玉米自交系和F 2∶3 家系对黄曲霉菌抗性的鉴定[J]. 扬州大学学报（农业与生命科学版），2012，33（2）：45-50.
[7]钱伟.大白菜TuMV抗性基因retr02的克隆与抗性机制研究[D].北京：中国农业科学院，2013.
[8]李巧云，张志刚，赵智中，等. 大白菜抗TuMV分子标记辅助选择技术研究[J].山东农业科学，2017，49（2）： 10-14.
[9]李巧云，张志刚，成文华，等.利用ELISA方法鉴定大白菜TuMV抗性[J].科技导报，2009，27（1）：42-45.
[10]高会超，曾强，张志刚，等. 与大白菜TuMV抗病基因TuRBCS01紧密连锁的分子标记开发[J].农业生物技术学报，2016， 24（2）： 196-205.
[11]张晓亮.大白菜抗芜菁花叶病毒（TuMV）基因分子标记筛选与定位[D].青岛：青岛农业大学，2012.
[12]国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会. 植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南 大白菜：GB/T 19557.5—2004 [S].北京：中国标准出版社，2004.