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摘 要：纤维素是地球上一种丰富的天然生物聚合物和主要的农业废弃物。这种纤维素生物质是一种具有被生物转化为增值生物产品巨大潜力的丰富的可再生资源。它可以被纤维素分解菌产生的纤维素酶降解。这种酶有多种工业用途，目前被认为是最重要的工业酶。本综述将探讨纤维素酶的应用、分类和定量以及纤维素分解菌的类型和筛选，也将介绍通过液态发酵和固态发酵方式生产纤维素酶、纤维素酶的性质以及纤维素酶基因的克隆和表达的最新知识。此外，本文还将讨论研究纤维素酶的生物技术及其未来展望。
关键词：纤维素分解菌；生物转化；纤维素酶；内切葡聚糖酶；外切葡聚糖酶；β-葡萄糖苷酶；纤维小体
中图分类号：S8516 文献标志码：C 文章编号：1001-0769（2018）09-0051-04
地球每年大约产生2 000亿t CO2，这意味着有相同数量的有机物被降解，其中30%被动植物利用而其他的70%被微生物降解。一般来说，纤维素约占植物生物质干重的50%。这些植物生物质是可供人类使用的燃料和材料的唯一可预见的可持续来源。农业废弃物是木质纤维素生物质的主要来源，木质纤维素具有可再生、未开发且廉价的特点。这些可再生资源来自玉米皮、玉米秸秆、甘蔗渣、稻草、稻壳、木本作物、森林残留物的叶子、茎和秸秆。除此之外，它们还来自工业和农业生产中产生的木质纤维素废弃物，如柑橘皮、椰子生物质、木屑、纸浆、工业废料、城市纤维固体废物和造纸厂污泥。此外，它们还可来自生物燃料专用能源作物，包括多年生牧草（如柳枝稷）和其他牧草饲料（如芒草、大象草、百慕达草等）。
大约70%的植物生物质被锁定在5-碳糖和6-碳糖中。这些糖存在于木质纤维生物质中，木质纤维生物质主要由可被一种复杂的酶系统即纤维素酶（外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等）水解的木质素（由β-1，4糖苷键链接的葡萄糖同源聚合物）、少量的半纤维素（由戊糖D-木糖、达拉定糖和己糖D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖与糖酸组成的5-和6-碳糖的异源聚合物）和极少量的木质素（一种复杂的芳香族聚合物）组成。在硬木中，半纤维素主要为木聚糖；而在软木中，半纤维素主要是葡甘露聚糖。简单来说，木聚糖降解需要内切-1，4-β-木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-葡糖苷酸酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶以及乙酰木聚糖酯酶。葡甘露聚糖的降解需要β-甘露聚糖酶和β-甘露糖苷酶切割其聚合物骨架。
有限的天然化石燃料储备正在以惊人的速度被文明世界消耗。燃烧化石燃料也引起了对不稳定且不确定石油资源、燃料成本上涨以及全球气候变暖的担忧。这些担忧已经转向到利用可再生资源来生产能够满足世界高能需求的“更加绿色的”能源替代品。到2010年，加拿大可再生能源燃料标准提高到乙醇含量5%的混合燃料；2009年美国环保局将其可再生燃料标准提高到乙醇含量10.21%的混合燃料；而巴西的混合燃料的标准是含25%的乙醇（2007年确立）。纤维素酶占全球工业酶需求量的8%。当纤维素酶用于将预处理的纤维素类物质水解成糖（所产糖可以大规模发酵成生物乙醇和生物碱产品）时，纤维素酶市场将大幅扩张。据估计，美国的纤维素酶市场每年高达4亿美元。在2004-2014年期间，作为一种特殊的酶，纤维素酶的使用量预计将增加一倍。生物技术公司Genencor国际公司和Novozymes公司报道，他们已经开发了可以降低纤维素至乙醇转化工艺中所用纤维素酶成本的技术，使每加仑乙醇的生产成本从5.4美元降低至20美分左右，其中两个重要策略是：（1）控制纤维素酶的生产成本，通过优化加工工艺和增强菌株产酶能力来降低每千克酶的生产成本，例如：从乳糖到葡萄糖选用更廉价的培养基和新的诱导系统； （2）提高纤维素酶的性能以在减少酶使用量的同时能获得与酶混合物相同的水解能力，同时改善酶产品的组成。
除此之外，纤维素酶在工业上的主要应用是纺织工业中织物的生物抛光和生产砂洗外观的牛仔布以及用于增加衣物柔软度和亮度的家用洗涤剂。另外，它们还应用于动物饲料中以提高养分消化率和质量，以及用来制作果汁和烘焙食品，而纸张脱墨是另一个新兴的用途。纤维素酶有可能发挥重要作用的一个挑战性领域是将可再生的纤维素生物质转化为商用化学品的生物转化。酶在清洁剂、皮革和造纸工业中的应用需要能够在极端pH和温度条件下具有高稳定活性。纤维素酶和纤维素分解菌的一些重要用途列于表1中。
本篇综述将阐述在自然以及人工技术条件下纤维素酶的生产。此外，本文将从综合视角以及纤维素分解菌和酶系统多样性的角度描述细菌性纤维素酶的应用，并将力图讨论纤维素酶在细菌系统中的作用方式和它们的分子生物调节作用。此外，本文还将探讨异源宿主中纤维素酶基因的克隆和表达、以及这些罕见的纤维素酶如何帮助人们解决生物燃料工业的一些重要技术瓶颈和生物技术中一些独特的细菌策略如何帮助生物炼制。
1 纤维素酶的分类
微生物产生的纤维素酶以游离或与细胞结合的方式水解和代谢不可溶性纤维素。在过去30年中，人们已经对需氧、厌氧细菌及真菌产生的纤维素酶系统的生物化学分析技術进行了全面的综述。以下的纤维素酶系统是根据其催化作用模式进行分类的（表2）。
1.1 内切葡聚糖酶或内切-1，4-β-D-葡聚糖水解酶（EC 3.2.1.4）
内切葡聚糖酶在纤维素多糖链中的内部无定形位点随机切割，产生各种长度的寡糖以及新的链末端。它通常作用于酸膨胀的无定形纤维素、纤维素的可溶性衍生物如羧甲基纤维素和纤维低聚糖等底物。
1.2 外切葡聚糖酶或1，4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶（纤维二糖水解酶）（EC 3.2.1.91）
外切葡聚糖酶以强占的方式作用于纤维素多糖链的还原性或非还原性末端，产生两个重要的产物葡萄糖（葡萄糖水解酶）和纤维二糖（纤维二糖水解酶）。这些酶对结晶底物如微晶纤维素、无定形纤维素和纤维寡糖具有活性。然而，它们对纤维二糖或可溶性纤维素衍生物如羧甲基纤维素无活性。 1.3 外切葡聚糖酶或1，4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶（也称为纤维糊精酶）（EC 3.2.1.74）
它能够催化除去纤维寡糖或硝基苯基-β-纤维二糖苷中的纤维二糖，但对无定形纤维素或羧甲基纤维素无活性。
1.4 β-葡糖苷酶或β-D-葡萄糖苷葡糖水解酶（EC 3.2.1.21）
β-葡糖苷酶可从非还原端将可溶性纤维糊精和纤维二糖水解成葡萄糖。它对结晶或无定形纤维素无活性。
1.5 纤维二糖磷酸化酶或纤维二糖：正磷酸α-D-葡萄糖基转移酶（EC 2.4.1.20）
它能够催化纤维二糖的可逆磷酸裂解部。该酶最初由Ayers等在红球菌（Ruminococcus albus）的细胞中发現。
纤维二糖 H3PO4 = α-D-葡萄糖 1-磷酸 葡萄糖
1.6 纤维糊精磷酸化酶或1，4-β-D-寡葡聚糖正磷酸盐α-D-葡萄糖基转移酶（EC 2.4.1.49）
它在热感染梭菌细胞中被人们发现，对纤维二糖不起作用，但可催化纤维糊精从纤维三糖到纤维六糖的可逆磷酸化裂解。
（1，4-β-D-葡糖基）n H3PO4 = （1，4-β-D-葡糖基）n-1 α-D-葡萄糖-1-磷酸
1.7 纤维二糖差向异构酶（EC 5.1.3.11）
它最初在红球菌的细胞中被人们发现，催化下列反应：
纤维二糖 = 4-O-β-D-葡萄糖基甘露糖
2 筛选产生纤维素酶的细菌
通常在含有结晶纤维素或微晶纤维素（如微晶纤维素）[琼脂中的最终浓度为0.1%～0.5%（w/v）]的平板上筛选有细菌性纤维素酶活性的微生物分离株。在经过一段合适时期的孵育后，若菌落周围出现一个清除的区域，表明这是纤维素生产者。然而，能分解纤维素的噬细胞菌属细菌不会出现任何的清除区域。因此清除区域的直径可能无法精确反映此细菌真实的纤维素酶活性。
为快速筛选可以产生纤维素酶的细菌，在用含0.5%（w/v）的羧甲基纤维素为唯一碳源的琼脂培养基孵育后，用1%（w/v）刚果红浸泡；20 min后倒出该染料，该平板再用 5 M的NaCl溶液浸泡，20 min～30 min后倒出NaCl溶液。在红色背景上，被一个浅橙色至透明的区域包围的菌落即是可产生纤维素酶的阳性细菌。此纤维素分解菌可用此类平板直接筛选出，但要分离出活性菌落，利用总平板的复制平板培养法更适合，因为浸泡的试剂会伤害分离株。Plant等报道了将天青色纤维素加入琼脂管上面两层来分析细菌的纤维素酶活性的半定量测定法。底物中释放的染料可以用光密度法测定。Kasana等（2008）发现，用革兰氏碘替代十六烷基三甲基溴化铵或刚果红染色平板，能快速得到高辨识度的结果。
然而，利用染料进行的平板筛选法并不是一种定量方法，因为酶活性与光晕大小之间的相关性较差。这个问题可通过开发一类含有经过修饰的还原末端和发色/荧光基团（如荧光素、试卤灵和4-甲基伞形酮）的短纤维寡糖来解决，以获得更高的灵敏度和定量。但是，将荧光底物用于琼脂平板的一个主要限制是其水解产物往往会大量扩散，因此使用这样的化合物仍然存在困难。因此，在平板法中，人们会合成新的底物——2-（2’-苯并噻唑基）-苯基[2-（2’-benzothiazolyl）-phenyl，BTP]纤维寡糖来筛选纤维素分解菌。
现在，研究人员已经将重点放在极端环境中不可培养的微生物的纤维素酶基因上，因为它们对恶劣环境条件有较高的抵抗力，希望能分离到的酶是新的且在生物炼制工业中具有特殊的用途。为了快速鉴定从可培养或不可培养的所有细菌中分离到的新的纤维素酶，我们应该建立宏基因组克隆库，然后进行功能筛选。
（待续）
关键词：纤维素分解菌；生物转化；纤维素酶；内切葡聚糖酶；外切葡聚糖酶；β-葡萄糖苷酶；纤维小体
中图分类号：S8516 文献标志码：C 文章编号：1001-0769（2018）09-0051-04
地球每年大约产生2 000亿t CO2，这意味着有相同数量的有机物被降解，其中30%被动植物利用而其他的70%被微生物降解。一般来说，纤维素约占植物生物质干重的50%。这些植物生物质是可供人类使用的燃料和材料的唯一可预见的可持续来源。农业废弃物是木质纤维素生物质的主要来源，木质纤维素具有可再生、未开发且廉价的特点。这些可再生资源来自玉米皮、玉米秸秆、甘蔗渣、稻草、稻壳、木本作物、森林残留物的叶子、茎和秸秆。除此之外，它们还来自工业和农业生产中产生的木质纤维素废弃物，如柑橘皮、椰子生物质、木屑、纸浆、工业废料、城市纤维固体废物和造纸厂污泥。此外，它们还可来自生物燃料专用能源作物，包括多年生牧草（如柳枝稷）和其他牧草饲料（如芒草、大象草、百慕达草等）。
大约70%的植物生物质被锁定在5-碳糖和6-碳糖中。这些糖存在于木质纤维生物质中，木质纤维生物质主要由可被一种复杂的酶系统即纤维素酶（外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等）水解的木质素（由β-1，4糖苷键链接的葡萄糖同源聚合物）、少量的半纤维素（由戊糖D-木糖、达拉定糖和己糖D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖与糖酸组成的5-和6-碳糖的异源聚合物）和极少量的木质素（一种复杂的芳香族聚合物）组成。在硬木中，半纤维素主要为木聚糖；而在软木中，半纤维素主要是葡甘露聚糖。简单来说，木聚糖降解需要内切-1，4-β-木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-葡糖苷酸酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶以及乙酰木聚糖酯酶。葡甘露聚糖的降解需要β-甘露聚糖酶和β-甘露糖苷酶切割其聚合物骨架。
有限的天然化石燃料储备正在以惊人的速度被文明世界消耗。燃烧化石燃料也引起了对不稳定且不确定石油资源、燃料成本上涨以及全球气候变暖的担忧。这些担忧已经转向到利用可再生资源来生产能够满足世界高能需求的“更加绿色的”能源替代品。到2010年，加拿大可再生能源燃料标准提高到乙醇含量5%的混合燃料；2009年美国环保局将其可再生燃料标准提高到乙醇含量10.21%的混合燃料；而巴西的混合燃料的标准是含25%的乙醇（2007年确立）。纤维素酶占全球工业酶需求量的8%。当纤维素酶用于将预处理的纤维素类物质水解成糖（所产糖可以大规模发酵成生物乙醇和生物碱产品）时，纤维素酶市场将大幅扩张。据估计，美国的纤维素酶市场每年高达4亿美元。在2004-2014年期间，作为一种特殊的酶，纤维素酶的使用量预计将增加一倍。生物技术公司Genencor国际公司和Novozymes公司报道，他们已经开发了可以降低纤维素至乙醇转化工艺中所用纤维素酶成本的技术，使每加仑乙醇的生产成本从5.4美元降低至20美分左右，其中两个重要策略是：（1）控制纤维素酶的生产成本，通过优化加工工艺和增强菌株产酶能力来降低每千克酶的生产成本，例如：从乳糖到葡萄糖选用更廉价的培养基和新的诱导系统； （2）提高纤维素酶的性能以在减少酶使用量的同时能获得与酶混合物相同的水解能力，同时改善酶产品的组成。
除此之外，纤维素酶在工业上的主要应用是纺织工业中织物的生物抛光和生产砂洗外观的牛仔布以及用于增加衣物柔软度和亮度的家用洗涤剂。另外，它们还应用于动物饲料中以提高养分消化率和质量，以及用来制作果汁和烘焙食品，而纸张脱墨是另一个新兴的用途。纤维素酶有可能发挥重要作用的一个挑战性领域是将可再生的纤维素生物质转化为商用化学品的生物转化。酶在清洁剂、皮革和造纸工业中的应用需要能够在极端pH和温度条件下具有高稳定活性。纤维素酶和纤维素分解菌的一些重要用途列于表1中。
本篇综述将阐述在自然以及人工技术条件下纤维素酶的生产。此外，本文将从综合视角以及纤维素分解菌和酶系统多样性的角度描述细菌性纤维素酶的应用，并将力图讨论纤维素酶在细菌系统中的作用方式和它们的分子生物调节作用。此外，本文还将探讨异源宿主中纤维素酶基因的克隆和表达、以及这些罕见的纤维素酶如何帮助人们解决生物燃料工业的一些重要技术瓶颈和生物技术中一些独特的细菌策略如何帮助生物炼制。
1 纤维素酶的分类
微生物产生的纤维素酶以游离或与细胞结合的方式水解和代谢不可溶性纤维素。在过去30年中，人们已经对需氧、厌氧细菌及真菌产生的纤维素酶系统的生物化学分析技術进行了全面的综述。以下的纤维素酶系统是根据其催化作用模式进行分类的（表2）。
1.1 内切葡聚糖酶或内切-1，4-β-D-葡聚糖水解酶（EC 3.2.1.4）
内切葡聚糖酶在纤维素多糖链中的内部无定形位点随机切割，产生各种长度的寡糖以及新的链末端。它通常作用于酸膨胀的无定形纤维素、纤维素的可溶性衍生物如羧甲基纤维素和纤维低聚糖等底物。
1.2 外切葡聚糖酶或1，4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶（纤维二糖水解酶）（EC 3.2.1.91）
外切葡聚糖酶以强占的方式作用于纤维素多糖链的还原性或非还原性末端，产生两个重要的产物葡萄糖（葡萄糖水解酶）和纤维二糖（纤维二糖水解酶）。这些酶对结晶底物如微晶纤维素、无定形纤维素和纤维寡糖具有活性。然而，它们对纤维二糖或可溶性纤维素衍生物如羧甲基纤维素无活性。 1.3 外切葡聚糖酶或1，4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶（也称为纤维糊精酶）（EC 3.2.1.74）
它能够催化除去纤维寡糖或硝基苯基-β-纤维二糖苷中的纤维二糖，但对无定形纤维素或羧甲基纤维素无活性。
1.4 β-葡糖苷酶或β-D-葡萄糖苷葡糖水解酶（EC 3.2.1.21）
β-葡糖苷酶可从非还原端将可溶性纤维糊精和纤维二糖水解成葡萄糖。它对结晶或无定形纤维素无活性。
1.5 纤维二糖磷酸化酶或纤维二糖：正磷酸α-D-葡萄糖基转移酶（EC 2.4.1.20）
它能够催化纤维二糖的可逆磷酸裂解部。该酶最初由Ayers等在红球菌（Ruminococcus albus）的细胞中发現。
纤维二糖 H3PO4 = α-D-葡萄糖 1-磷酸 葡萄糖
1.6 纤维糊精磷酸化酶或1，4-β-D-寡葡聚糖正磷酸盐α-D-葡萄糖基转移酶（EC 2.4.1.49）
它在热感染梭菌细胞中被人们发现，对纤维二糖不起作用，但可催化纤维糊精从纤维三糖到纤维六糖的可逆磷酸化裂解。
（1，4-β-D-葡糖基）n H3PO4 = （1，4-β-D-葡糖基）n-1 α-D-葡萄糖-1-磷酸
1.7 纤维二糖差向异构酶（EC 5.1.3.11）
它最初在红球菌的细胞中被人们发现，催化下列反应：
纤维二糖 = 4-O-β-D-葡萄糖基甘露糖
2 筛选产生纤维素酶的细菌
通常在含有结晶纤维素或微晶纤维素（如微晶纤维素）[琼脂中的最终浓度为0.1%～0.5%（w/v）]的平板上筛选有细菌性纤维素酶活性的微生物分离株。在经过一段合适时期的孵育后，若菌落周围出现一个清除的区域，表明这是纤维素生产者。然而，能分解纤维素的噬细胞菌属细菌不会出现任何的清除区域。因此清除区域的直径可能无法精确反映此细菌真实的纤维素酶活性。
为快速筛选可以产生纤维素酶的细菌，在用含0.5%（w/v）的羧甲基纤维素为唯一碳源的琼脂培养基孵育后，用1%（w/v）刚果红浸泡；20 min后倒出该染料，该平板再用 5 M的NaCl溶液浸泡，20 min～30 min后倒出NaCl溶液。在红色背景上，被一个浅橙色至透明的区域包围的菌落即是可产生纤维素酶的阳性细菌。此纤维素分解菌可用此类平板直接筛选出，但要分离出活性菌落，利用总平板的复制平板培养法更适合，因为浸泡的试剂会伤害分离株。Plant等报道了将天青色纤维素加入琼脂管上面两层来分析细菌的纤维素酶活性的半定量测定法。底物中释放的染料可以用光密度法测定。Kasana等（2008）发现，用革兰氏碘替代十六烷基三甲基溴化铵或刚果红染色平板，能快速得到高辨识度的结果。
然而，利用染料进行的平板筛选法并不是一种定量方法，因为酶活性与光晕大小之间的相关性较差。这个问题可通过开发一类含有经过修饰的还原末端和发色/荧光基团（如荧光素、试卤灵和4-甲基伞形酮）的短纤维寡糖来解决，以获得更高的灵敏度和定量。但是，将荧光底物用于琼脂平板的一个主要限制是其水解产物往往会大量扩散，因此使用这样的化合物仍然存在困难。因此，在平板法中，人们会合成新的底物——2-（2’-苯并噻唑基）-苯基[2-（2’-benzothiazolyl）-phenyl，BTP]纤维寡糖来筛选纤维素分解菌。
现在，研究人员已经将重点放在极端环境中不可培养的微生物的纤维素酶基因上，因为它们对恶劣环境条件有较高的抵抗力，希望能分离到的酶是新的且在生物炼制工业中具有特殊的用途。为了快速鉴定从可培养或不可培养的所有细菌中分离到的新的纤维素酶，我们应该建立宏基因组克隆库，然后进行功能筛选。
（待续）