【摘 要】
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旨在建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)血清抗体的阻断ELISA方法.采用原核表达的ASFVp54蛋白作为包被抗原,并制备了针对p54蛋白的单克隆抗体,采用方阵滴定法确定了阻断ELISA方法的最佳反应条件,并对建立的方法进行了敏感性、特异性、重复性和符合性评价.结果显示,抗原最佳包被浓度为2.0 μg·mL-1,抗原包被温度及时间为4℃过夜,被检血清稀释度为1 ∶ 40,酶标单抗稀释度为1 ∶ 1 000,被检血清作用时间为1 h,酶标单抗作用时间为30 min,底物作用时间为10 min.经阴、阳性样品检测
【机 构】
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华南农业大学兽医学院,国家非洲猪瘟区域实验室(广州)/人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室/农业农村部人畜共患病重点实验室/农业农村部兽用疫苗创制重点实验室/广东省动物源性人兽共患病防控重点实验室
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旨在建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)血清抗体的阻断ELISA方法.采用原核表达的ASFVp54蛋白作为包被抗原,并制备了针对p54蛋白的单克隆抗体,采用方阵滴定法确定了阻断ELISA方法的最佳反应条件,并对建立的方法进行了敏感性、特异性、重复性和符合性评价.结果显示,抗原最佳包被浓度为2.0 μg·mL-1,抗原包被温度及时间为4℃过夜,被检血清稀释度为1 ∶ 40,酶标单抗稀释度为1 ∶ 1 000,被检血清作用时间为1 h,酶标单抗作用时间为30 min,底物作用时间为10 min.经阴、阳性样品检测和特异性、敏感性试验,当临界值阻断率≥55.2％时,判定为阳性,当阻断率＜43.4％时,判定为阴性,介于两者之间判定为可疑.该方法与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、口蹄疫病毒、猪流感病毒、猪伪狂犬病病毒阳性血清不发生交叉反应,特异性好.批内重复试验及批间重复试验的变异系数(CV)均在10％以内.将该方法进行初步应用,并与商品化ELISA试剂盒进行符合性试验,两者的检测符合率为98％.综上表明,建立的阻断ELISA方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可用于ASFV临床样品的抗体检测.
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